㈠ pcr用超纯水
最好还是在冰上做啦,一次两次没有问题,久了多了可能问题就出来了
一般用的是灭菌的双蒸水
保证引物的终浓度就可以.都是用水稀释的,没啥差别
㈡ 我想问做PCR扩增应该注意的事项
注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
另外，提取上清这步一定要小则歼心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
总mRNA的提取(自己的经验)
一、 关于Trizol Reagent需要的试剂
1． Chloroform：氯仿 (分析纯)
2． Isoproplyl alcohol：异丙醇(分析纯)
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。
4． RNase-free water：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50ul），在37℃过夜，并高压灭菌即得（150℃ 3小时）
5． 一次性塑料手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌
二、 关于Trizol Reagent的使用过程：
1． Homogenization（匀浆）
a. Tissues：组织
每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。
b. Cells Grown in monolayer（单层细胞接毒后出现病变的）
针对JEV细胞总RNA的抽提法：
BHK21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加维持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）约5ml，维持天。出 现75%-100%的病变时，以PBS（预冷）冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞（细胞瓶有两 种常用规格：大的约45cm2，小的约30cm2，故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶 底为度，而不是依据细胞的数量，否则可导致DNA的污染）具体方法如下：（样品一定要新鲜）
（1） 组织接入预冷的EP管中，加入Trizol试剂1ml/10cm2（量一定要加足，否则易污染），混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物彻底分离。
（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml），盖好，剧烈震荡15s，置室温2-3分钟。
（3） 4℃离心，10000g×15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。
（4） 仔细吸取上层水相，移至另一EP管中。
（5） 加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇）高盯轮，置室温10min。
（6） 4℃离心，10000g×10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。
（7） 弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml），震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，5500g×5min。弃上清液，空气干燥（或真空干燥）后，沉淀重悬于无 Rnase dH2O中，吹吸几次，55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA，-70℃保存备用。
（8） 抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul，稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280 ratio<1.6。
（9） 分离组织10mg（纯组织）加800ul Trizol试剂。
（10） 扩增产物的鉴定
DEPC处理方法如下：
1. DEPC处理
（1）DEPC水：100ml超纯水加入0.2ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。
（2）Tip头(枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37℃浸泡过夜，高压灭菌。
2. 提取RNA，用DEPC水溶解
3. RT
我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反戚信应管中作的。
4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。
最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1%DEPC水，在灭菌就行了；现在有进口的RNASE FREE的枪头买，直接用不用处理的.
如何消除污染
机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。
（1） 试剂：mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。
（2）加样：原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。
另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。
目 前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。
RNA定量
RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较 不同标本之间就更不准了。
RNA的贮藏，最主要的是温度，－20不够，最好－80，液氮最保险
mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度 的影响
RT-PCR有两种做法：
条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行
一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的
电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达 量，不是绝对表达量
mRNA的分离与纯化中
步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结 合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。
3）保温试验
方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件）， 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
PCR污染与对策
)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，所以，扩增区的仪器什么如枪头等要注意。
还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
1标本处理区，包括扩增摸板的制备；
2. PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；
3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。
切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；
操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度
反应液污染
可采用下列方法之一处理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
1、提取mRNA时所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再烘干。
2、用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。那你用DEPC处理还有什么意义呢？还要用双蒸水洗吗？
3、玻璃器皿干烤：180度，8小时或更长时间；小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。
㈢ 做配药品，稀释引物，PCR实验中，对水的要求要很高么
配制一般化学试剂使用二级水即可。
配制生化试剂，包括引物稀释、PCR所用水，以及转膜、核酸抽提等，必须使用二次蒸馏水或一级水。
㈣ PCR实验室超纯水机怎么选
PCR实验室超纯水机怎么选，下面结合本人的实际工作经验来谈谈如何选择一款适合您PCR实验室超纯水机。
1、智能PLC加真彩触摸屏控制系统，实时远程在线监测并显示设备运行的各种状态信息
2、四级加强型预处理设计，改善反渗透进水水质
3、具有浓水智能回用工艺设计，水利用率高达75%
4、R0系统自动脉冲冲洗程序设计，有效降低膜结垢风险
5、纯化系统自动循环润洗功能，避免微生物滋生
6、一机多用，可同时提供满足实验室标准的I/II/III级用水 网络上面都有。
㈤ 一般实验室用什么样的超纯水机比较好
实验室超纯水设备原理：
通常由原水预处理系统、反渗透纯化系统、超纯化后回处理系统三部分组答成。预处理的目的主要是使原水达到反渗透膜分离组件的进水要求，保证反渗透纯化系统的稳定运行。反渗透膜系统是一次性去除原水中98%以上离子、有机物及100%微生物(理论上)最经济高效的纯化方法。超纯化后处理系统通过多种集成技术进一步去除反渗透纯水中尚存的微量离子、有机物等杂质，以满足不同用途的最终水质指标要求。
实验室超纯水设备标准配置：
1.一体式PPF精密滤芯：过滤泥沙、颗粒物;
2.一体式活性炭滤芯：吸附有机物、余氯 ;
3.反渗透膜装置：第一步脱盐和去除自来水中的细菌和有机物;
4.压力纯水桶：存放反渗透纯水，同时提供取水动力;
5.离子交换柱：第二步脱盐，电阻达10兆欧以上;
6.核级超纯化柱：第三步深度脱盐，电阻达18.2兆欧以上;
7.终端1微米微孔过滤：过滤细小颗粒物质;
8.超纯水专用0.45+0.2微米孔径终端过滤器(选配)：去除细菌及杂质;
9.电子元器件等：提供各种控制功能。