细胞培养箱超纯水未高压

1. 二氧化碳培养箱污染怎么办

二氧化碳培养箱在放好后，再对箱体和内部进行消毒处理，并且对各项指标进行系统校正，等各项数值稳定一段时间后方可使用。因CO2气体对于健康是有害的，因此细胞室需安装足够的通风装置。空气中的粉尘气溶胶易造成二氧化碳培养箱的污染，需要一个流通的空气环境。将二氧化碳培养箱的管理任务分派给有经验的检查人员是十分重要的。如长期不使用二氧化碳时，应将CO2开关关闭，防止CO2调节器失灵，避免给实验室带来安全性事件。

2. 细胞培养常用器材有哪些

1. 超净工作台

目前绝大部分细胞实验室使用超净工作台实现无菌操作，具有操作简单、安装方便、占用空间小且净化效果很好。安徽人和净化为您介绍两种主要超净工作台-侧流式（垂直式）和外流式（水平层流式）。工作原理一般是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。

（1） 侧流式工作台：空气净化后的气流由左或右侧通过工作台面流向对侧，也有从上向下或从下向上流向对侧，形成气流屏障保持工作区无菌，工作台结构为封闭式；

（2） 外流式工作台：净化后的空气面向操作者流动，因而外方气流不致混入操作，工作台结构为开放式，但进行有害物质实验操作对操作者不利。超净工作台应需要定期请有关部门检查洁净度，符合要求的超净工作台其洁净度应达到100级，用尘埃粒子计数仪检测粒径≤5μm的尘埃粒子数量不应超过3.5个/L；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，根据无菌状况必要时需要置换过滤器。

2. 显微镜

倒置式显微镜是细胞培养实验室日常工作常规必备设备，主要用于日常了解细胞的生长情况并观察有无污染发生。如资金允许，建议选用配置有照相系统的高品质相差显微镜、解剖显微镜、荧光显微镜、录像系统或缩时电影拍摄装置等，可随时拍摄并记录细胞生长情况。

3. 培养箱

体外培养的细胞和体内细胞一样，需要在恒定的温度下生存，一般最适生长温度为37℃，温差变化不应超过±0.5℃。温度升高2℃时，变不利于细胞生存，温度达到40℃以上细胞将很快死亡。因此，可精确控温的恒温培养箱、CO2培养箱是最佳选择。

（1） 恒温培养箱：应选隔水式或晶体管式自控温培养箱，此类培养箱灵敏度高，温度控制较稳定。一般的恒温培养箱价格较便宜，其缺点是只宜于作密闭式培养。

（2） CO2培养箱：目前多数的细胞培养室已广泛使用。CO2培养箱的优点是能够提供进行细胞培养时所需要的一定量的CO2（常用浓度为5％），易于稳定培养液pH，适用于开放或半开放培养。使用培养瓶时，为使培养瓶内与外界保持通气状态，可将瓶盖略微旋松，为避免细胞被污染，使用这种培养方式时，培养箱内空气必须保持清洁，需定期用紫外线照射或酒精消毒，同时培养箱内应放置盛有无菌蒸馏水的水槽，防止培养液蒸发，保持箱内相对湿度在100%。

（3） 细胞培养耗材：培养细胞的器皿可用培养皿、培养板或培养瓶。

4. 烘箱（干燥箱）

用于细胞培养的一些器械、器皿必须烘干后才能使用，玻璃器皿等须干热消毒。干热消毒时，烘箱内温度一般要达到160℃以上，通常使用鼓风式烘箱。其优点是温度均匀、效果较好，缺点是升温过程较慢。升温时不能先升温后鼓风而应鼓风与升温同时开始，至100℃时，停止鼓风。需注意避免包裹器皿的纸或棉花烧焦，烧焦的碎屑可影响细胞的生长。消毒后不能立即打开箱门，以免骤冷导致玻璃器皿破裂，应等温度自然下降至100℃以下后可开门。

5. 水纯化装置

细胞培养对水的质量要求较高，细胞培养、细胞培养相关液体的配制用水以及清洗细胞培养器皿用水都必须事先经过严格的纯化处理。目前有多种纯化方法相结合，可使普通水纯化为纯水和超纯水的纯水装置使用非常灵活方便，可挂壁式、台式、可配储水箱、也可直接用分液枪、还可根据各类实验用水要求选择配置杀菌功能，有效去除DNA酶、RNA酶、蛋白酶等，更有可有效去除掉热源、内毒素的超滤型纯水装置。

6. 冰箱

细胞培养实验室必备设备，应专用，不得存放易挥发、易燃烧等对细胞有害的物质，且应保持清洁。一般包括普通冰箱、低温冰箱和超低温冰箱。

普通冰箱：储存培养液、生理盐水、Hanks液试剂等培养用的物品，可短期保存组织样本。

-20℃低温冰箱、超低温冰箱：用于储存需要冷冻以保持生物活性以及需长时期存放的制剂，如酶、血清等。

7. 细胞冷冻储存器

储存器常用的液氮容器，根据使用需要分为不同类型和规格。选择液氮容器时需要考虑三个因素：容积大小、取放使用方便、液氮挥发量。液氮容器的大小一般在25-500L，可以储存1ml的冻存管250-15000个左右。液氮温度最低文帝可达-196℃，使用时应注意避免冻伤。由于液氮易挥发，需注意观察剩余液氮量，及时补充，避免液氮不足使细胞受损或死亡。目前有许多智能型细胞冷冻储存器可供选择，可配置有电子控制器的液氮储存器，实现冻存自动化；并可监测液氮水平和样品温度，确保样品温度始终处于设定温度点；可配置报警系统，设置液氮液面、温度、电池、电压、电源等失常情况下报警；同时具备热气体旁路系统，防止高于-130℃的暖空气进入液氮罐，从而更有效地保护样品，防止容器内升温。另外，可选择液氮供应罐通过连接管给储存罐补充液氮，保证样品安全。

8. 离心机

细胞培养时，通常使用离心机制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤和收集细胞。一般常规配置4000rpm台式离心机；若要做细胞沉降，需要使用80-100G离心力，因为离心力过大会损伤细胞。根据不同要求，有大容量、可调温度离心机、高速离心机和低温冷冻离心机等更多功能离心机可选择。

9. 天平

常用的有精密天平和分析天平。分析天平的精确度一般为0.1mg、0.01mg和0.001mg。一般根据取样量量和精度要求选择合适的天平：取样量大于100mg宜选用精确度0.1mg的天平；取样量100-10mg，选用精确度0.01mg的天平；取样量10mg宜选用精确度0.001mg的天平。天平需要定期校准，可选择有自动校准功能的天平，方便维护。天平使用需要注意清洁，避免腐蚀性粉末、液体直接接触称量台。答案来自

3. 细胞培养会用到哪些重要的实验仪器如何做到细胞培养的无菌操作(

重要的实验仪器蒸馏器、储品柜、超净工作台、水浴锅、三氧消毒杀菌机。细胞培养的无菌操作需要在无菌台上操作。

具体设备如下：

准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。

配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。

培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。

必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。

无菌操作：

1、凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。

2、靠近酒精灯火焰操作。

3、器皿使用前必须过火灭菌。

4、继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。

5、各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。

如吸管不能碰到废液缸。

6、吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

4. 如何预防细胞培养的污染问题

1、从物品、用品消毒灭菌着手
细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在取样检菌一周后确认无菌才能使用。同时，在无菌过滤操作中，随着滤过体积的增大，滤膜破损的可能性增加，故应选择最后过滤的液体进行检测。定期对二氧化碳培养箱进行消毒。具体操作：75%的酒精搽拭培养箱后，使用可移动的紫外灯至少消毒 30min，加入高压灭菌过的超纯水于培养箱水槽中保持湿度。也可配制300ml的饱和硫酸铜加3L灭菌超纯水混合成硫酸铜溶液加入水槽中。
2、添加抗生素
各种抗生素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后使用好。但反复使用抗生素会使微生物产生耐药性，且对细胞本身也有一定影响，因此为避免诱导抗药细菌，应定期更换悔态培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素处理。
3、从操作者做起
（1）进无菌室前要彻底洗手，按规定穿隔离衣。开始操作前要用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。
（2）操作者动作要轻，安装吸管帽、打开或封闭瓶口等操作应在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意，金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火；烧过的器械要冷却后才能使用；已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内的培养液成分如蛋白质等烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带到培养液中；胶塞、橡皮乳头及塑料的细胞培养用品过火焰是也不能时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞，同时塑料细胞培养用品也会产生变形影响使用。
（3）操作时尽量不要谈话，咳嗽以防止来自唾沫和呼出的气流所造成的污染。
（4）使用培养液前不宜过早开瓶，开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立，以防止下落细菌的污染。不再使用的培养液应立即封闭瓶口，培养的细胞在处理之前勿过早暴露在空气中。
（5）操作完毕后应整理好工作台面，用消毒水浸泡的纱布擦拭台面。
（6） 吸取培养液、细胞悬液时，应专管专用，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去，以防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染。
4、防止细胞交叉污染
所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有的充足的冻存储备，一旦怀疑发生交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定，如发现原有的细胞遗传物发生改变，可以复苏早期冻存的细胞使用。重要细胞系（株）的传代工作应由两人独立进行。
5、无菌室的彻底消毒
1） 新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室。使用前应稀释即配即用。新洁尔灭和酒精相比，最大的优点是便宜，因为新洁尔灭500ml只需5元，而且可以稀释50倍用，而同样量的酒精价格可能是新洁尔灭的几十倍。
2）甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。甲醛价廉，熏蒸消毒时不损坏衣服、家具、皮革、橡胶等。市售的甲醛水溶液中一般含37-40%的甲醛。
其主要用法为：
a）熏蒸消毒：每立方米空间甲醛用量为10~15毫升，熏蒸消毒时应密闭门窗封闭至少4h以上。高锰酸钾加40%甲缓前滑醛（1:1）混合后放入一开发容器中，立即可见白色甲醛烟雾。消毒后可放入25%氨水蒸发中和刺激气味。氨水用量为所用甲醛水溶液的一半，时间为30分钟。甲醛气体毒性非常强，所以操作时一定需带上防毒面具。
b）自然挥发： 将较大量的甲醛水溶液放入一敞开容器扰腊中，室内温度保持在18摄氏度以上，同时室内喷水以保持相对湿度在70%以上，经16小时可达到室内消毒的目的

5. 细胞实验室是否需要纯水，超纯水，设计时要不要把纯水

细胞实验室肯定会用到纯水、超纯水的；不过细胞实验室用水量不会太大，可以选用小型实内验室纯水系统容，现用现制；例如赛多利斯arium® mini 实验室纯水系统是针对实验室用水量低于10L而设计，用于制备非关键应用所需的缓冲液和培养基。

6. 骨髓瘤 培养

杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。

在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，丛颂可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。

淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。

1、动物免疫

(1) 抗原制备制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。

(2) 免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来滑郑孝源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。

(3) 免疫程序的确定免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞

融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平信稿行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。

表6-1 不同免疫抗原的免疫程序

免疫原特性 抗原量 接种次数 间隔时间 单抗的特性 抗体滴度 亲和性

免疫原性强（如细胞、细菌和病毒等） 106-107个细胞或1-10ug 2-4 2-4周 高 中等至强

免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高中等或强

免疫原性弱 A.20-400ug 2-4 随后 2-3 每月 2-3月中等 强

B.10-50ug 其后 200-400ug 2 其后 4 每月 每天 中等 中等

C.10-100ug 2 其后 4 其后“休息” 最后加强 每月 10天 1-2月

中等 中等或强

体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了。如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。因此，针对这些情况，可采用体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞（或淋巴结细胞，或外周血淋巴细胞）取出体外，在一定条件下与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。其基本方法是取4-8周龄BALB/c小鼠的脾脏，制成单细胞悬液，用无血清培养液洗涤2-3次，然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中，再加入适量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，细胞抗原105-106个细胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液；在37℃，6%CO2浓度下培养3-5天，再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。

2、细胞融合

（1） 主要试剂的配制

a、 细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配制方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。

"不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml

100×L.G.溶液1ml

双抗溶液1ml

7.5% NaHCO3溶液1-2ml

HEPES溶液1ml

"不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g

超纯水或四蒸水980ml

NaHCO3 3.7g

双抗溶液10ml

100×L.G.溶液10ml

用1N HCl调试PH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。

"完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml

小牛血清15-20ml

用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。

"HT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml

HT贮存液1ml

"HAT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml

HT贮存液1ml

A贮存液1ml

b、 氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L） : 称取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。

c、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。

d、 L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L） : 称取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。

e、 青、链霉素（双抗）溶液（100×）: 取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。

f、 7.5% NaHCO3溶液 : 称取分析纯NaHCO3 7.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），盖紧瓶塞，4℃保存。

g、 HEPES溶液（1mol/L）: 称取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。

h、 8-氮鸟嘌呤贮存液（100×）: 称取200mg 8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20℃冻存。使用时按1%浓度加入到培养液中（即终浓度为20ug/ml）。

g. 用新配制的10% Giemsa染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保温2小时，加甲醇33ml混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。

h. 镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。

i、 50% PEG: 称取PEG 1000 或4000 20-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，0.6ml分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20℃存放备用。临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许7.5% NaHCO3调PH至8.0，或购买Sigma或Gibco公司现成产品。

⑵ 髓瘤细胞的准备
融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功地得到杂交瘤是最为重要的。目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前肯定不能少于1周。冻存的细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态，长过了的骨髓瘤细胞至少几天才可能恢复。在实验室中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10%小牛血清的培养基中，方法是用6个装5ml培养基的培养瓶，接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞。1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植。典型的倍增时间为14-16小时。
骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下：
a、于融合前48-36小时，将骨髓细胞扩大培养（一般按一块96孔板的融合试验约需2-3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备）。
b、融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。
c、 1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。
d、加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。
e、取骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数=4个大方格细胞数×105/4；或每毫升细胞数=5个中方格细胞数×106/2

⑶ 脾淋巴细胞的准备
取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏（也可用注射器内芯挤压脾脏），使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块，可用200目铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min离心5-10分钟，用不完全培养基离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀，取上述悬液，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108个脾细胞，每只大鼠脾脏可得5×108-10×108脾细胞。

⑷ 饲养细胞（Feeder cells）的制备
在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞。饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了，一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。
常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用，因此使用最为普遍。其制备方法如下：
按上述采小鼠脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。通常对巨噬细胞来说，96孔培养板每孔需2×104个细胞，24孔板每孔需105细胞。每只小鼠可得3-5×106个细胞，因此一只小鼠可供两块96孔板的饲养细胞。也可在细胞融合前1-2天制备并培养饲养细胞，这样使培养板孔底先铺上一层饲养细胞层。做法是，将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml（相当于2滴），然后置37℃ 6% CO2的培养箱中培养。

⑸ 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
细胞融合的程序已报道的有很多种，这里介绍的是作者所在实验室常用的一种。
A、将1×108脾细胞与2×107-5×107骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。
B、 1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。
C、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置40℃水浴中预热。
D、用1ml吸管在1分钟左右（最佳时间为45秒）加预热至40℃的50% PEG（PH 8.0）1ml，边加边轻轻搅拌。
E、用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37℃的不完全培养基；20-37℃静置10分钟。
F、 1000r/min 5分钟；弃去上清。
G、 加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。
H、分装96孔细胞培养板，每孔0.10-0.15ml；分装24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后将培养板置37℃，6% CO2培养箱内培养。
I、 5天后用HAT培养基换出1/2培养基。
J、 7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。
L、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。

3、杂交瘤细胞筛选

杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便，便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果，以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来，在融合之前就必须建立好抗体检测方法，并克服可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”，即检出背景以上的最强与最弱信号之比，依所用的检测抗原是否纯净而定。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的，100%的抗原参与反应，一个阳性/阴性判别系统就够了。另一方面，如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗原，检测系统可能需要能测出微弱信号，则动力学范围至少应为10：1，最好为100：1。另外，检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。如需结合A蛋白的杂交瘤抗体，就要用结合蛋白A的检测方法。

下面简要介绍几种常用的抗体检测方法：

⑴ 免疫酶技术

免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。

A、器材和试剂

a. 包被缓冲液：

碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。

Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。

b. 洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4"12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。

c. 稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。

d. 酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。

e. 底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。

f. 底物使用液：

OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2 0.15ml。

TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。

ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。

g. 抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。

h. 抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。

病毒感染的传代细胞或全菌抗原。

淋巴细胞等悬液。

i. 酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。

j. 细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20℃甲醇。

k. 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。

l. 酶联免疫阅读仪；或光镜。

m. 吸管、加样器及水浴箱、离心机等。

B、 可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）

a. 纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。

b. 以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。

c. 弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。

d. 每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。

e. 洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。

f. 每孔加50-100ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。

g. 加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。

h. 加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液50-100ul，37℃10-30分钟。

i. 以2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。

j. 结果判定：以P/N≥2.1，或P≥N 3D为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。

C、 全菌抗原的ELISAS

a. 新鲜培养的细菌用蒸馏水或PBS悬浮，并调整细菌浓度至1×108个/ml。必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作，最好是灭活处理。

b. 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml 25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小时，蒸馏水洗涤3次；加上述细菌悬液50ul/孔；37-56℃烘干；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。

c. 步骤b也可采用先每孔加50ul细菌悬液，37℃-56℃烘干，然后用-20℃预冷的无水甲醇室温作用15分钟，蒸馏水洗涤3次；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。

d. 洗涤液洗3次；此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。

e. 以下步骤同上法。

D、 用全细胞抗原的ELISA

a. 按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度悬液。

b. 淋巴细胞悬液的制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1500rpm离心30分钟，吸取界面细胞洗涤二次，即为新鲜淋巴细胞悬液。该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加0.83%的氯化铵溶液，室温10分钟，洗涤一次即可。将该细胞悬液稀释至适当浓度。

c. 每孔加100ul上述a或b的细胞悬液，使每孔含细胞5×104个；1500r/min 15分钟，甩去上清；室温干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分钟；可4℃或-20℃保存备用。

d. 以下步骤同上法。

E、抗体捕捉ELISA试验

本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗体捕捉待检样品中的McAb，再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。该法是常用的ELISA中较理想的一种；其操作步骤如下：

a. 以适当浓度的纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板，每孔加100ul，37℃ 2小时或4℃过夜。

b. 洗涤、拍干后加待测的McAb样品，37℃ 1-2小时。

c. 洗涤后加适量的抗原，37℃ 1-2小时。

d. 洗涤后加入酶标多克隆抗体，37℃ 1-2小时。洗涤后加底物显色，判定结果。

7. 生物类实训室对于环境有哪些要求

要求：

1、通风：

实验室在实验过程中会产生大量的有毒有害气体，对人体产生伤害镇备，实验室应保持良好的通风，并装备相应的通风设施。如通风柜、万向排气罩、原子吸收罩及其他局部排风装置。必要时需对整个房间设计整体排风和补风系统。

2、温度和湿度：

为了保障实验室工作人员有一个适合的工作环境，以及仪器设备有一个稳定的工作状态，实验室应保持适宜的温度和湿度。夏季适宜温度为18-28℃，冬季为16-20℃，湿度控制在30%-70%之间，在局部实验区域对湿度和温度有严格要求的可以建立恒温恒湿室。

3、洁净度：

经常保持实验室的清洁非常重要，实验室换气过程中室外尘土及其他污染物容易进入实验室内，导致实验室含尘量过高，空气不洁净影响实验结果。而且尘土及微粒落在仪器设备元件表面，容易形成故障，或其他潜在危险。

通常实验室在补风入口加装过滤网，并及时对室内及设备做清洁。在对洁净度有特殊要求的实验区域，应建立洁净间，根据洁净要求不同可分为百级、千级、万级、十万级等。

(7)细胞培养箱超纯水未高压扩展阅读：

生物类实训室常规设备介绍:

1、超净工作台/生物安全柜

细胞培养需要无菌要求高的环激旅埋境，在进行操作细胞的实验时，需要在100级的空气下进行，那我们就需要购买能提供百级洁净度的超净工作台或生物安全柜了。

2、二氧化碳培养箱

细胞培养所用的缓冲体系是碳酸氢钠+HEPES体系，所以需要二氧化碳提供缓冲能明蚂力维持pH。这时我们就需要一个二氧化碳培养箱来对细胞进行培养。并且由于二氧化碳培养箱通常不具有制冷压缩机，所以需要用户确定其细胞房内在夏天也有全天候的空调制冷，否则会造成箱内温度超标。

3、倒置显微镜

需要倒置显微镜的帮助。对于一些荧光免疫细胞实验（IF），则还需要购买倒置的荧光显微镜。

4、纯水机/超纯水机

细胞培养还需要超纯水系统，普通的纯水和蒸馏水是无法用于细胞培养的，而超纯水主要用于配置一些培养基和试剂，超纯水的进水可为自来水或二级纯水（质量好些的去离子水，电阻10兆欧左右）。

5、移液枪，电动移液枪

细胞实验操作时，需要使用各种吸头及移液管，所以配置移液枪是必要的。

6、离心机

细胞培养需要离心收集传代细胞，一般转速在1000转到1500转之间，所以需要购买低转速的常温离心机，而且要带10ml，50ml及培养板的转子。另外还需要一台高速冷冻离心机用于收集细胞沉淀或细胞上清。

8. 实验室纯水分几个等级

实验室纯水分四个等级，即：

1、蒸馏水：

实验室最常用的一种纯水，虽设备便宜，但极其耗能和费水且速度慢，应用会逐渐减少。蒸馏水能去除自来水内大部分的污染物。

2、去离子水：

应用离子交换树脂去除水中的阴离子和阳离子，但水中仍然存在可溶性的有机物，可以污染离子交换柱从而降低其功效，去离子水存放后也容易引起细菌的繁殖。

3、反渗水：

反渗水克服了蒸馏水和去离子水的许多缺点，利用反渗透技术可以有效的去除水中的溶解盐、胶体，细菌、病毒、细菌内毒素和大部分有机物等杂质。

4、超纯水：

超纯水在TOC、细菌、内毒素等指标方面并不相同，要根据实验的要求来确定，如细胞培养则对细菌和内毒素有要求，而HPLC则要求TOC低。

拓展资料：

实验室纯水的分类与标准：国家实验室纯水标准（GB/T 6682）依据水的纯度（水的导电性）分1、2、3级，1级电导率小于0.1μs/cm；2级电导率小于1.0μs/cm；3级电导率小于5.0μs/cm；

泉瑞QTCJ系列小型去离子水设备可满足用户的不同需求，产水水量10L-50L/h，水质完全符合国家实验室1、2、3级标准，不同级别的水其生产工艺、生产产本相差较大，所以其用途也相以区分。

三级水是**级别的实验室级纯水，推荐用于玻璃器皿洗涤；水浴、高压灭菌锅用水以及超纯水系统的进水。

二级水一般用于常规实验室应用，比如缓冲液、pH 溶液及微生物培养基的制备；为超纯水系统、临床生化分析仪、培养箱、老化机供水；也可为化学分析或合成制备试剂。

一级水往往用于严格的实验应用，如HPLC 流动相制备；GC 空白样制备和样品稀释、HPLC、AA、ICP-MS等高精度分析技术；缓冲液、哺乳动物培养基制备及试管婴儿；分子生物学试剂制备(DNA 测序、PCR 扩增等)；电泳及杂交实验溶液配制等。

通常我们实验室工作人员为了实验的准确与精确性，采用一级标准的水用于二级水的实验应用中。

9. 细胞实验室是否需要纯水、超纯水，设计时要不要把纯水系统设计进去

你做细胞实验基本是离不开纯水和超纯水的，不论你是做动植物实验、细胞免疫化学、PCR实验、蛋白质纯化以及电泳/凝胶分析，都是要用到超纯水的。建议你设计时最好把超纯水系统也设计进去，以后你的几个实验室直接用设计好的超纯水系统的管道取水即可。你可以联系南京权坤。

10. 如何预防和去除细胞培养过程中的污染

试用中心实验方法资讯采购保障中心品牌专区NSFC如何预防细胞培养的污染问题2009-10-11 00:00体外培养的细胞受到严重污染时，有时即使想尽各种办法也难以挽回。因此，防止污染，预防是关键。只有将预防措施贯穿于整个细胞培养的始终，才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手：1、从物品、用品消毒灭菌着手细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在取样检菌一周后确认无菌才能使用。同时，在无菌过滤操作中，随着滤过体积的增大，滤膜破损的可能性增加，故应选择最后过滤的液体进行检测。定期对二氧化碳培养箱进行消毒。具体操作：75%的酒精搽拭培养箱后，使用可移动的紫外灯至少消毒 30min，加入高压灭菌过的超纯水于培养箱水槽中保持湿度。也可配制300ml的饱和硫酸铜加3L灭菌超纯水混合成硫酸铜溶液加入水槽中。2、添加抗生素各种抗生素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后使用好。但反复使用抗生素会使微生物产生耐药性，且对细胞本身也有一定影响，因此为避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素处理。3、从操作者做起（1）进无菌室前要彻底洗手，按规定穿隔离衣。开始操作前要用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。（2）操作者动作要轻，安装吸管帽、打开或封闭瓶口等操作应在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意，金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火；烧过的器械要冷却后才能使用；已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内的培养液成分如蛋白质等烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带到培养带裂液中；胶塞、橡皮乳头及塑料的细胞培养用品过火焰是也不能时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞，同时塑料细胞培养用品也会产生变形影响使用蠢胡闭。（3）操作时尽量不要谈话，咳嗽以防止来自唾沫和呼出的气流所造成的污染。（4）使用培养液前不宜过早开瓶，开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立，以防止下落做皮细菌的污染。不再使用的培养液应立即封闭瓶口，培养的细胞在处理之前勿过早暴露在空气中。（5）操作完毕后应整理好工作台面，用消毒水浸泡的纱布擦拭台面。（6） 吸取培养液、细胞悬液时，应专管专用，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去，以防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染。4、防止细胞交叉污染所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有的充足的冻存储备，一旦怀疑发生交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定，如发现原有的细胞遗传物发生改变，可以复苏早期冻存的细胞使用。重要细胞系（株）的传代工作应由两人独立进行。