氨基酸的离子交换色谱实验报告

『壹』 氨基酸分析仪的辨别

1、原理。基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（IEC）。此类方法由Stein和Moore两人1958年发明，并于1972年获诺贝尔奖，是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法。
2、重要指标。满足分析需要的技术指标如分离度、重复性等要求，而其中的分离度又是更为重要的指标，因为，色谱理论一般以分离度达到1.2作为两峰基本分离的判定前提，只有峰分开了，才有意义去讨论定性和定量的重复性。
3、指标的真实性。有些厂家只标出个别氨基酸的指标如Asp或Arg，或只用平均数据替代全部数据等等，而仪器性能好，经营信誉较高的厂家就会标出全部氨基酸的指标供用户参考。
4、仪器的可靠性。如果仪器今天堵了、明天漏了，用户不仅要付出大量人力财力，分析结果的可信度也将大打折扣。
5、仪器的运行成本。例如是否可以使用国产试剂、柱子寿命（以多少次进样计算、而不以多少年计算）等。
6、仪器设计是否有利于氨基酸分析。例如是否有惰性气体保护（茚三酮极易被氧化）、是否提供在线脱气、是否提供溶液和样品的制冷控制等。
7、售后服务。分析过程中遇到困难是在所难免，厂家必须能够快速响应、尽快解决问题。另外，常用备件的价格也是一个重要因素，因为用户在购买前一般难以注意到售后的问题，而很多厂家也没有公示自己的常用备件价格，这就为将来的使用埋下了隐患，事实上，也的确有很多仪器在出现一些看似微小的故障之后，就因为维修费用太高而被“束之高阁”。
我想，您要是按照以上的标准去选择氨基酸分析仪的话，一定能够选到满意的仪器，成为您工作中得力的助手。

『贰』 如何用液相色谱仪测氨基酸

反相高效液相色谱法测定烟叶中的游离氨基酸
氨基酸是烟草中的一类重要化学物质，在烟草调制、醇化或发酵、加工直至燃烧过程中，游离氨基酸与还原糖之间可发生酶催化及非酶催化的棕色化反应，生成多种具有蒸煮、烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶类等杂环化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸还可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。氨基酸含量与烟草制品的吃味有着密切的关系，氨基酸在燃烧裂解过程中一般形成具有刺激性的含氮化合物，对烟气香吃味产生不良影响，个别氨基酸还产生HCN等危害健康的烟气成分。一般说来，氨基酸含量太高，烟气辛辣、味苦、刺激性强烈；含量太低时烟气则平淡无味缺少丰满度。因此对氨基酸的分析是一项很有意义的工作，二十世纪60年代以来，国内外在这方面做了大量的工作[1-5]。
植物游离氨基酸样品的制备，国内外采用的提取剂和纯化方法各不相同。据文献报道[6-7]，盐酸、不同浓度的乙醇溶液均可以用来提取植物组织中的游离氨基酸；提取液纯化则有用阳离子交换树脂、5%磺基水杨酸、活性炭或乙醚等方法。本实验对不同的提取方式和不同的纯化方法进行了对比研究，确定提取烟叶中游离氨基酸的较佳提取剂和纯化方法。提取、纯化后的样品，采用OPA、FMOC联合柱前衍生反相高效液相色谱法对烟叶中的游离氨基酸进行了测定。该方法使带氨基和亚氨基基团的氨基酸能够被同时测定，且得到较好的定性定量结果。
1 实验
1.1 仪器
Agilent公司HP1100型高效液相色谱仪(带可变波长紫外检测器和自动进样器)，PE公司Lambda Bio40 紫外-可见分光光度计。
1.2 试剂
正缬氨酸（Norvaline，内标），OPA ，FMOC，均为色谱纯，Agilent公司提供；硼酸缓冲溶液，Agilent公司提供；
醋酸钠(NaAc)，分析纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；三乙胺（TEA），四氢呋喃（THF），乙腈（CH3CN），甲醇(MeOH)，均为色谱纯，Fisher公司试剂；
氨基酸标样包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），均为生化试剂，中国医药（集团）上海化学试剂公司；
苯乙烯阳离子交换树脂（732型），天津树脂厂。
1.3 样品处理
将烟叶在烘箱中恒温40℃烘干至恒重，粉碎，过80目筛，筛下物为实验用烟样粉末，置于广口瓶中备用。准确称取烟样粉末1.000g于干燥的洁净试管中，用一定浓度的乙醇溶液室温超声波提取半小时，过滤，相同浓度的乙醇溶液洗涤，再提取一次，合并后的滤液用阳离子交换柱洗脱，然后用95ml 4mol/L氨水淋洗阳离子交换柱，淋洗液恒温浓缩至干，最后用3ml 0.1mol/L稀盐酸溶液溶解浓缩物，将此溶液离心分离20min，0.45μm微孔滤膜过滤，加入浓度为5nmol/μ1的内标10μ1，定容至50ml，HP1100液相色谱仪进行氨基酸分析。
样品自动柱前衍生化：Agilent公司G1313A自动进样器进样。程序为：吸取5μl硼酸缓冲液，再吸取1μ1 OPA试剂，洗针一次，吸取样品2μl，原位混合6次。吸取1μl FMOC试剂，洗针一次，原位混合3次，进样。
1.4 色谱条件
色谱柱：Hypersil AA-ODS C18 2.1×200mm
流动相A：1.36±0.025g醋酸钠，加入500ml纯水溶解，加90μl三乙胺，用1%醋酸调pH=7.20±0.05，再加入1.5ml四氢呋喃，混合均匀。
流动相B：1.36±0.025g醋酸钠，加入100ml纯水溶解，用1%醋酸调pH=7.20±0.05，将此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中，并混合均匀。
流速：0.45ml/min
柱温：40℃
紫外检测波长: 0～16min， 338nm； 16～25min，262nm
淋洗梯度：见表1
表1 流动相的淋洗梯度表
Table 1 The gradient time table of mobile phase
序列 时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 流速（ml/min）
1 0.00 100.0 0.0 0.450
2 15.50 40.0 60.0 0.450
3 18.00 0.0 100.0 0.450
4 21.00 0.0 100.0 0.800
5 23.90 0.0 100.0 0.800
6 24.00 0.0 100.0 0.450
7 25.00 100.0 0.0 0.450
1.5 氮基酸的定性
用标样色谱图、文献参照和标样加入的方法，通过对照保留时间进行定性，对氨基酸的出峰顺序加以确认。
1.6 内标法定量
准确移取浓度为10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合标样100μl于带内衬管的样品瓶中，再加入250pmol/μ1内标溶液100μl，充分混合，液相色谱分析，仪器自动计算各氨基酸的标准曲线。
2 结果与讨论
2.1 萃取溶剂的比较
氨基酸可溶解于水、乙醇、甲醇、稀酸等，因此它们均可作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂，传统的方法是用乙醇和0.1mol/L的盐酸。实验发现，乙醇和0.1mol/L的盐酸萃取方法比较，提取出的烟叶中的游离氨基酸的总量变化不大，但用盐酸提取的样品分析时RSD%较大，平均8.51%，其中超过10%的有4个，甘氨酸的RSD%最大为20%；而用乙醇提取的样品分析时RSD%相对较小，平均5.12%，超过10%的只有1个。而且盐酸提取液过滤速度慢，需要30-40min，而乙醇提取液过滤只需10min左右；因此，本实验选择乙醇作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂。
2.2 乙醇浓度的选择
选择五种不同浓度的乙醇溶液进行了烟样中游离氨基酸的提取，测定不同条件下提取液中游离氨基酸的总量，结果如图1。图中显示，在乙醇溶液浓度为80%时，烟样中总游离氨基酸的提取量最大。而且不同浓度下游离氨基酸的RSD%没有明显的变化，因此，选择80%的乙醇溶液来进行烟样中游离氨基酸的提取。

2.3 不同纯化方法的确定
在最佳乙醇溶液浓度下，分别用活性炭加入提取液吸附杂质、乙醚加入提取液萃取分离杂质、5%磺基水杨酸加入提取液沉淀去除杂质和阳离子交换树脂吸附杂质四种方法进行了纯化实验。结果发现，活性炭作为纯化剂时其色谱图中杂质峰较少，但同时氨基酸峰亦有多个消失，主要是因为活性炭对氨基酸也有较强的吸附，它在吸附杂质的同时也吸附了需要检测的氨基酸，故活性炭不适合作为纯化剂使用。乙醚和5%磺基水杨酸作为纯化剂时，杂质去除不完全，其色谱图均表现为杂质峰较多，湮没了大量氨基酸峰，且基线漂移严重，给定性定量工作带来困难。当用阳离子交换树脂进行纯化时，其色谱图中杂质峰较少，基线平稳，氨基酸峰分离较好，均可以进行定性和定量分析，故本实验选择了阳离子交换树脂作为纯化手段。
2.4 色谱分离
2.5 线性范围及标准曲线
分别取浓度为10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合标样加入等体积的250 pmol/μ1的内标溶液，进行HPLC分析，以氨基酸浓度为横坐标，氨基酸与内标的面积比为纵坐标，得到各个氨基酸的标准曲线，如表2所示。从表中可以看出，各氨基酸在10-1000 pmol/μ1的浓度范围内均有良好的线性，各氨基酸标准曲线的线性相关系数均大于0.99。
表2 氨基酸的标准曲线
Table 2 Standard curves of 17 amino acids
氨基酸 线性方程 相关系数
Asp Y=0.007037x+0.004689 0.9972
Glu Y=0.007520x+0.005375 0.9961
Ser Y=0.006903x+0.038212 0.9988
His Y=0.003719x+0.020168 0.9945
Gly Y=0.005851x+0.018235 0.9966
Thr Y=0.006932x+0.021072 0.9978
Ala Y=0.006275x+0.015314 0.9912
Arg Y=0.006088x+0.016113 0.9920
Tyr Y=0.006734x+0.015022 0.9993
Cys Y=0.006004x+0.009876 0.9985
Val Y=0.006432x+0.009932 0.9927
Met Y=0.006574x+0.010346 0.9905
Phe Y=0.005098x+0.019023 0.9962
Ile Y=0.005976x+0.016235 0.9953
Leu Y=0.006044x+0.015332 0.9964
Lys Y=0.006833x+0.010437 0.9969
Pro Y=0.022455x+0.009376 0.9922
2.6 重现性实验
取云南C2F99烟样做平行实验（n=5），进行烟叶中游离氨基酸含量的检测，结果发现： Asp和 Glu含量的RSD%分别为8.0%和8.6%，这可能是二者的分离度不高引起的；His的RSD%为9.0%，这可能与其含量较低，分离效果不好有关。其它氨基酸含量的RSD%均处在3%～7%。
2.7 回收率实验
用标样加入法进行回收率实验，结果见表3。 Thr的回收率仅为68.0%，原因可能与其含量较少有关；其它15种氨基酸的回收率在81.0%～110.5%，平均回收率为93.9%，说明该方法的回收率结果令人满意。
表3 分析方法的回收率
Table 3 Recovery percents of the analytical method
氨基酸 加入量（mg/g烟样） 样品含量（mg/g烟样） 测定值（mg/g烟样） 差值（mg/g烟样） 回收率%
Asp 0.200 0.320 0.499 0.179 89.5
Glu 0.200 0.309 0.484 0.175 87.5
Asn 0.200 0.986 1.208 0.222 110.0
Ser 0.200 0.172 0.334 0.162 81.0
Gln 0.200 0.186 0.368 0.182 91.0
His 0.200 0.106 0.297 0.191 95.5
Gly 0.200 0.064 0.279 0.215 107.5
Thr 0.200 0.052 0.188 0.136 68.0
Ala 0.200 0.642 0.835 0.193 96.5
Arg 0.200 0.266 0.463 0.197 98.5
Val 0.200 0.090 0.259 0.169 84.5
Phe 0.200 0.218 0.406 0.188 94.0
Ile 0.200 0.026 0.191 0.165 82.5
Leu 0.200 0.028 0.199 0.171 85.5
Pro 0.200 1.432 1.653 0.221 110.5
Tyr 0.200 0.062 0.245 0.183 91.5
2.8 样品分析
利用该方法对不同等级的烟叶中游离氨基酸的含量进行了分析，结果见表4。从表中可以看出，在所分析的样品中，烤烟烟叶中含量最高的氨基酸是Pro，白肋烟烟叶中含量最高的氨基酸是Asp和Asn；白肋烟烟叶中氨基酸的含量高于烤烟烟叶；相同等级的烤烟烟叶，云南烟叶中的氨基酸含量高于其它产区。
表4 不同等级烟叶中游离氨基酸的含量（mg/g烟样）
Table 4 Amounts of free amino acids in different
grade tobacco leaves（mg/g tobacco leaves）
氨基酸 云南烤烟C1F 云南烤烟C2F 云南烤烟C1L 云南烤烟B1F 云南烤烟B2F 福建烤烟B1F 福建烤烟C1F 四川烤烟C1F 四川烤烟B1F 贵州烤烟C1F 贵州烤烟B1F 贵州烤烟C1L 鄂西白肋中一 鄂西白肋中二
Asp 0.24 0.31 0.60 0.40 0.38 0.37 0.26 0.37 0.26 0.26 0.32 0.35 1.73 1.59
Glu 0.36 0.32 0.21 0.17 0.16 0.11 0.15 0.20 0.30 0.32 0.29 0.25 0.54 0.61
Asn 0.91 0.34 1.50 0.95 0.38 0.18 0.25 0.35 0.32 0.44 0.55 0.48 7.70 7.62
Ser 0.16 0.10 0.18 0.16 0.10 0.12 0.24 0.21 0.19 0.20 0.19 0.15 0.62 0.58
Gln 0.19 0.05 0.22 0.17 0.04 0.06 0.10 0.11 0.10 0.11 0.15 0.10 0.18 0.20
His 0.11 0.02 0.14 0.10 0.06 0.06 0.11 0.09 0.07 0.09 0.08 0.09 0.20 0.22
Gly 0.10 0.09 0.19 0.17 0.07 0.08 0.12 0.15 0.12 0.15 0.13 0.12 0.16 0.19
Thr 0.05 0.05 0.08 0.06 0.05 0.04 0.08 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.19 0.16
Ala 0.65 0.55 0.84 0.69 0.54 0.51 0.65 0.59 0.55 0.48 0.53 0.70 0.57 0.55
Arg 0.29 0.21 0.32 0.28 0.18 0.26 0.32 0.28 0.25 0.33 0.29 0.33 0.48 0.42
Tyr 0.06 0.07 0.06 0.07 0.06 0.05 0.07 0.05 0.06 0.06 0.07 0.06 0.10 0.15
Val 0.10 0.10 0.12 0.11 0.10 0.14 0.15 0.13 0.12 0.15 0.14 0.13 0.21 0.25
Met 0.07 0.07 0.09 0.08 0.06 0.06 0.08 0.08 0.08 0.07 0.09 0.08 0.12 0.13
Phe 0.26 0.12 0.28 0.23 0.10 0.21 0.25 0.21 0.25 0.28 0.30 0.33 0.44 0.59
Pro 1.14 0.83 2.13 1.51 0.69 0.66 1.03 1.23 1.11 1.32 1.18 1.09 0.25 0.35
总量 4.69 3.23 6.96 5.15 2.97 2.91 3.86 4.14 3.86 4.33 4.37 4.31 13.49 13.61
3 结论
本烟叶中游离氨基酸的分析方法采用80%的乙醇作为萃取溶剂，阳离子交换树脂对提取液进行纯化，能够最大程度地提取烟叶中的游离氨基酸并较好地去除了影响氨基酸测定的杂质，使色谱图中杂质峰较少；OPA、FMOC联和柱前衍生使带氨基和亚氨基基团的氨基酸同时得到测定；良好的梯度洗脱使各个氨基酸峰得到较好的分离，并使定量结果更加可靠。

『叁』 离子交换色谱法简介

离子交换色谱法（Ion Exchange Chromatography, IEC），一种起源于20世纪70年代并于80年代迅速发展的高效分析手段，特别适用于无机化合物，特别是无机阴离子的混合物分析。

该方法基于一个基本原理，即被分离的化合物与其固定相之间通过离子交换作用实现分离。固定相的核心是离子交换树脂，其分子结构中分布着许多可电离的活性位点。在分离过程中，待分析组分中的离子会与这些活性位点发生离子交换，形成一个动态的离子交换平衡。在这个平衡状态下，待分离离子与固定相中的固有离子竞争占据交换中心，随着流动相的移动，这种竞争导致它们在流动相和固定相之间发生相对移动，从而实现了有效的分离。

离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法进行分离。现在它不仅适用于无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，因此应用范围较广。

『肆』 为什么说离子交换色谱法是分离蛋白质的最佳方法

它是根据蛋白质的组成物质氨基酸的物理性质（基于氨基酸电荷行为）为分离基础的方法。相对透析和超过滤及凝胶过滤来说，可以针对多种蛋白质中的某一种（前提是知道蛋白质的氨基酸组成及其离子交换树脂的亲和度及洗脱强度）进行分离。（而透析和超过滤还有凝胶过滤方法更大的取决于相对分子质量及其结构 分离出的单一蛋白质纯度相对要低 并且凝胶过滤要求凝胶对要求组分不能有吸附作用 适用性较低 ） 相对盐溶和盐析来说，分离单一蛋白质的纯度要高，且更好的保留其天然理化性（盐溶要求蛋白质分子吸附某一盐离子从而改变其溶解性 但有些蛋白质吸附某些盐离子后其蛋白质构象及理化性会发生改变）。 相对有机溶剂分级分离法，更好的保留其天然理化性（有机溶剂分类法易造成蛋白质不可逆变形 且适用范围窄） 相对凝胶电泳和等电聚焦来说 更易于实现大量制备分离 且不改变蛋白质结构和功能（电泳会影响蛋白质结构 且操作繁琐 成本高） 相对亲和层析来说 它更加易于实现且成本低廉效果也不错（亲和层析需要制备其配体并与载体交联 因而制备难且成本较高）
PS: 最好的分离方法不是例子交换色谱法 而是高效液相色谱法 相对离子交换色谱来说有着更高的效率、更高的分辨率和过柱速度

『伍』 离子交换色谱法表达式

离子交换色谱法是一种分离和分析技术，其核心概念是基于离子与树脂之间的亲和力差异。在这个过程中，一个重要的参数是分配系数，也被称为选择系数，它用以衡量离子在树脂上结合和在流动相中游离的程度。这个参数的数学表达式为：

K_s = frac{[RX^+]}{[X^+]}

在这里，[RX^+] 代表与离子交换树脂活性中心结合的特定离子（RX+）的浓度，它反映了离子在树脂上的吸附程度。而 [X^+] 则表示在流动相中未被树脂吸附的同种离子（X+）的浓度，代表了离子在流动相中的浓度。通过这个表达式，我们可以评估离子在色谱过程中的保留行为，从而进行有效的分离和分析。

离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法进行分离。现在它不仅适用于无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，因此应用范围较广。