强阳离子交换色谱柱的再生溶液

Ⅰ 一篇看懂液相色谱柱的分类、选择及维护！

液相色谱柱的分类及选择与维护是进行高效液相色谱分析的关键。

一、液相色谱柱的分类

按照色谱固定相基质，液相色谱柱可以分为以下几类：

1. 硅胶基质

1.1 反相色谱柱：使用以硅胶为基础，表面键合有弱极性官能团的键合相。流动相通常为水、缓冲液与甲醇、已腈等混合物。样品流出顺序为极性强的先被冲出，极性弱的后被冲出。

1.2 正相色谱：使用硅胶作为固定相，其他具有极性官能团的键合相填料。流动相极性相对较低。分离顺序依据样品中各组分极性大小。

1.3 离子交换色谱柱：使用磺化交联强阴/阳离子键合硅胶色谱柱，如强阴离子色谱柱(SAX)和强阳离子交换色谱柱(SCX)。

2. 聚合物基质

聚合物调料如聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，优点是在PH值为1～14均可使用，对大分子物质分离有效。

3. 其他无机填料

如石墨化碳、氧化铝等，具有特殊性质，适用于特定用途。

二、色谱柱的选择

液相色谱柱的选择主要依据分析物的性质，如硅胶基质填料用于小分子量物质，聚合物填料用于大分子物质。

三、色谱柱的维护

1. 色谱柱的平衡：使用甲醇或乙腈冲洗色谱柱，确保分析样品流动相与冲洗溶剂互溶。

2. 色谱柱的再生：长期使用后柱效下降，可进行再生处理。

3. 色谱柱的维护：使用预柱保护分析柱，避免流动相组成及极性的剧烈变化，使用前经脱气和过滤处理。

Ⅱ 磺酸基阳离子交换键合硅胶色谱柱，怎样维护保养及活化

首先在开始使用系统以前检查柱子有否微生物生长，否则柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。然后，不接检测器，正向安装色谱柱，使用纯甲醇以0.6ml/min流速冲洗约10倍柱体积。
再连接检测器，用纯甲醇以0.6ml/min流速冲洗约20倍柱体积。
然后使用去离子水以0.6ml/min流速冲洗约20倍柱体积。
最好再确保连接好保护柱（多使用相应柱制造商针对性提供的保护柱），再用选用的洗脱液以0.6ml/min流速平衡1h以上，进样检测。同样，若洗脱液中含有缓冲盐类，在用分析洗脱液平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例洗脱液过渡，冲洗约10倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。
特别注意：
①洗脱液要求是新制的缓冲液。对于阳离子交换柱，多用柠檬酸或酒石酸缓冲液（或其混合溶液）、邻苯二甲酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5；对于阴离子交换柱，多用磷酸缓冲液、硝酸铵溶液（1mMol/L），邻苯二甲酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5。绝对禁止使用水杨酸缓冲液，因水杨酸分解产物会改变固定相的性质。洗脱液在使用以前必须用0.45um滤膜过滤并彻底脱气，以防止发生检测和泵送问题。
②提倡在室温环境使用，为了提高分析的稳定性，可以设置高于室温5～10℃的柱温，最好不要在40℃以上使用。
③使用过程中不要超过其耐受最高压力。
④增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止柱床的扰动。更换柱子，必须先降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子，压力变化到0（约2min）后再更换。
⑤必须防止将来自流动相或者样品中的疏水性或与流动相极性差别很大的化合物进入色谱柱，特别地，要绝对禁止导入颗粒杂质，以防止操作压力增高，污染物难以或者不能去除。
（6）分析完毕，净化程序基本同C18柱，先用去离子水以0.6ml/min流速冲洗约20倍柱体积。然后用甲醇以0.6ml/min流速冲洗约10倍柱体积，纯甲醇饱和后密封保存即可。（注意：一定要确保在柱子内没有缓冲液或者其他含盐类的洗脱液的情况下保存色谱柱。）
（7）长时间保存后重新使用，重复上述（1）～（6）即可。

Ⅲ 氨基酸分析法的方法分类

本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为0.025～1.25µmol/ml。
试剂 （1）流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
（2）流动相B 乙腈－水（8：2）。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm， 5μm）；流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为254nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下： 时间(min) 流动相A（%） 流动相B（%） 0 100 0 14 85 15 29 66 34 30 0 100 37 0 100 37.1 100 0 45 100 0 测定法 精密量取氨基酸对照品溶液200μl，置一2ml塑料离心管中，精密加入1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，混匀，精密加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，混匀，室温放置1小时，加0.8ml正己烷，剧烈振摇，放置10min，精密取下层溶液2μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液200μl，自“置一2ml塑料离心管中”起同法测定。 本法系根据氨基酸与6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）反应，生成有紫外与荧光响应的不对称尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸经反相高效液相色谱后用紫外或荧光检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为2.5～200nmol/ml。
试剂 （1）流动相A 取醋酸铵10.8g或无水醋酸钠11.5g，加水900ml溶解，用磷酸调pH至5.0，然后加水至1000 ml。
（2）流动相B 乙腈－水（3：2）。
（3）0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 8.8) 取硼酸12.36g，加水400ml溶解，用40%氢氧化钠溶液调pH至8.8，然后加水稀释至500ml。
(4) AQC溶液 取AQC适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用新试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm， 5μm）；流速为每分钟1.4ml；柱温为37℃；检测波长为248nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下： 时间(min) 流动相A（%） 流动相B（%） 0 88 12 14 88 12 29 80 20 30 59 41 37 59 41 37.1 88 12 45 88 12 测定法 精密量取对照品溶液10μl，置一直径为0.4cm、高度为5cm的小试管中，精密加入0. 4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 8.8) 70μl，在涡旋混匀器上混匀，精密加入AQC溶液20μl，混匀，精密量取5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液10μl，自“置一直径为0.4cm”起同法测定。 本法系根据一级氨基酸，在巯基试剂存在下，首先与邻苯二醛（OPA）反应，生成OPA-氨基酸；反应完毕后，加入9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC），剩余的二级氨基酸与FMOC继续反应，生成FMOC-氨基酸，两次反应生成的氨基酸衍生物经反相高效液相色谱分离后用紫外或荧光检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为0.025～2.5µmol/ml。
试剂 （1）流动相A 称取醋酸钠7.5g，加水4000ml溶解，加三乙胺800μl，四氢呋喃24ml，混匀，用2%醋酸调pH至7.2。
（2）流动相B 称取醋酸钠10.88g，加水800ml溶解，用2%醋酸调pH至7.2，加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混匀。
（3）0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.4) 取硼酸24.73g，加水800ml溶解，用40%氢氧化钠溶液调pH至10.4，然后加水稀释至1000ml。
（4）OPA溶液 取 OPA 80mg，加0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.4) 7ml，加乙腈1ml， 3-巯基丙酸125μl ，混匀 。
（5）FMOC溶液 取FMOC 40mg , 加乙腈8ml溶解。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×150mm， 5μm）；柱温为40℃；检测波长为338nm（一级氨基酸），262nm（二级氨基酸）。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度及流速如下： 时间(min) 流动相A（%） 流动相B（%） 流速（ml/min） 0.0 100 0 1.0 17.0 50 50 1.0 45.0 0 100 1.0 45.1 0 100 1.5 50.0 0 100 1.5 50.1 100 0 1.0 53 100 0 1.0 测定法 精密量取对照品溶液50μl，置一1.5ml塑料离心管中， 精密加入0. 4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.2) 250μl，混匀，精密加OPA衍生剂50μl，混匀，放置30秒，精密加入FMOC衍生剂50μl，混匀，精密量取4μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液50μl，自“置一1.5ml塑料离心管中”起同法测定。
附注：1、由于OPA-氨基酸不稳定，因此衍生后应立即进行分离测定。
2、本方法的衍生过程也可由自动进样器完成。 本法系根据氨基酸与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应，生成有紫外响应的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸经反相高效液相色谱分离后采用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性响应范围为30～140 pmol。本法所用的2，4－二硝基氟苯属易爆、剧毒物质，有强致癌性，且该法对色谱柱要求较高，易损坏色谱柱，衍生试剂水解生成的2，4-二硝基苯易干扰丝氨酸的测定。除另有规定外，一般不宜采用本法。
试剂 （1）流动相A） 0.05mol/L醋酸钠溶液(取 4.1g无水醋酸钠，加水800ml溶解，加二甲基甲酰胺10ml，用稀醋酸调pH至6.4，用水稀释至1000 ml)。
（2）流动相B 流动相A-乙腈（1：1）。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用新试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm， 5μm）；流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为360nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下： 时间(min) 流动相A（%） 流动相B（%） 0 75 25 6 75 25 6.1 65 35 11 59 41 14 59 41 14.1 50 50 22 45 55 32 10 90 37 10 90 39 75 25 50 75 25 测定法 精密量取氨基酸对照品溶液2ml，置一50ml量瓶中，加0.5mol/L碳酸氢钠溶液2ml，2，4-二硝基氟苯衍生化试剂（量取2，4－二硝基氟苯1ml ，用乙腈稀释至100ml）1ml，混匀，在60℃水浴中反应 1小时，取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液2ml，自“置一50ml量瓶中”起同法测定。 本法系根据氨基酸经阳离子交换色谱柱分离后，与茚三酮反应，一级氨基酸生成在570nm处具有最大吸收的紫色化合物，二级氨基酸（如脯氨酸）生成在440nm具有最大吸收的黄色化合物，分别在570nm和440nm下检测上述反应产物，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性响应范围为20～500 pmol。
试剂 （1）流动相A 取无水柠檬酸钠1.7g，盐酸1.5ml，加水溶解并稀释至100ml，用盐酸调pH至3.0。
（2）流动相B 取无水柠檬酸钠1.7g，盐酸0.7ml，加水溶解并稀释至100ml，用盐酸调pH至4.3。
（3）流动相C 取氯化钠5g，无水柠檬酸钠1.9g，苯酚0.1g，加水溶解并稀释至100ml，用盐酸调pH至6.0。
（4） 色谱柱再生溶液 取氢氧化钠0.8g，加水溶解并稀释至100ml，用盐酸调pH至13。
（5）柱后衍生试剂 取茚三酮18g，茚氮兰0.7g，加76.7%二甲基亚砜－0.7二水合醋酸锂－0.1%醋酸溶液900ml使溶解，在氮气下混合至少3小时。
（6）样品缓冲液 2%无水柠檬酸钠-1%盐酸-0.5%硫代二乙醇－0.1%苯甲酸溶液。
对照品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备。
色谱条件与系统适用新试验 用磺化苯乙烯－二乙烯苯共聚物为填充剂（4.0×120mm， 7.5μm）；流动相流速为每小时14.0ml；柱后衍生试剂得流速为每分钟7ml，反应器温度为135℃；检测波长为440nm(一级氨基酸)，570nm（二级氨基酸）。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下：开始时用流动相A平衡色谱柱，在25分钟流动相的组成变为100%流动相B，在37分钟，流动相组成变为100%流动相C，在75min，最后一个氨基酸被洗脱后，用色谱柱再生溶液再生色谱柱1分钟。柱温程序如下：开始时柱温48℃，11.5分钟后，以每分钟3℃的速率升至65℃，约35分钟后，以每分钟3℃的速率升至77℃，最后在约52分钟后，以每分钟3℃的速率降至77℃。
测定法 精密量取氨基酸对照品溶液适量，注入氨基酸分析仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液适量，同法测定。
附注：不同品牌的氨基酸分析仪，应根据仪器的要求，对流动相、色谱柱再生溶液、衍生试剂、缓冲液和洗脱梯度作适当调整。

Ⅳ 磺酸基阳离子交换键合硅胶色谱柱，怎样维护保养及活化

在使用系统之前，首要任务是检查色谱柱是否受到微生物污染，否则可能会导致柱子堵塞，使得柱压升高到无法接受的水平。首先，不连接检测器，正向安装色谱柱，使用纯甲醇以0.6ml/min流速冲洗大约10倍柱体积。接着，连接检测器，继续使用纯甲醇以相同流速冲洗约20倍柱体积。随后，改用去离子水以相同流速冲洗约20倍柱体积。

为确保色谱柱的最佳性能，建议连接保护柱（通常由制造商提供），然后用选定的洗脱液以0.6ml/min流速平衡柱子至少1小时。在用分析洗脱液进行平衡前，如果洗脱液中含有缓冲盐，应先使用不含缓冲盐的同比例洗脱液过渡，冲洗约10倍柱体积，以避免缓冲盐在分析柱内析出。

在进行洗脱液选择时，需注意阳离子交换柱多使用柠檬酸或酒石酸缓冲液（或其混合溶液）、邻苯二甲酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5；阴离子交换柱则多使用磷酸缓冲液、硝酸铵溶液（1mMol/L），邻苯二甲酸缓冲液，pH范围同样从2.5到6.5。绝对禁止使用水杨酸缓冲液，因为水杨酸的分解产物会改变固定相的性质。洗脱液在使用前必须通过0.45um滤膜过滤并彻底脱气，以避免检测和泵送问题。

为了提高分析的稳定性，建议在室温条件下使用色谱柱，如果需要，可以将柱温设置为高于室温5～10℃。避免在40℃以上使用，以防损坏色谱柱。

在使用过程中，切勿超过色谱柱的耐受最高压力。调整流速时，应采取小的间隔变化以避免柱床扰动。更换柱子时，务必先将流量降至0，等待洗脱液完全流出柱子，压力变化到0（约2min）后再进行更换。

防止将来自流动相或样品中的疏水性或与流动相极性差别很大的化合物进入色谱柱，尤其要避免导入颗粒杂质，以防止操作压力增高，污染物难以或不能去除。

分析完毕后，采用与C18柱类似的净化程序，首先用去离子水以0.6ml/min流速冲洗约20倍柱体积，然后用甲醇以相同流速冲洗约10倍柱体积，确保纯甲醇饱和后密封保存。

对于长时间保存后的重新使用，重复上述步骤即可。