⑴ 一文了解离子色谱（IC)
离子色谱，一种高效液相色谱技术，又称高效离子色谱（HPIC）或现代离子色谱。其检测原理基于溶液中电离物质的电导性，通过检测电导值来分析物质的电离程度，适用于亲水性阴、阳离子的分离。
离子色谱的分离原理基于离子交换树脂与流动相中溶质离子间的可逆交换和分析物溶质对交换剂亲和力的差异，使得离子在柱中分离。以检验亚硝酸盐为例，亚硝酸根离子首先与分析柱的离子交换位置进行离子交换，并被淋洗液中的OH-基置换洗脱。依据离子对树脂亲和力的强弱，分析物离子依次洗脱，实现分离。
抑制器在离子色谱中扮演重要角色，它降低淋洗液背景电导并提升被测离子的电导率，改善信噪比。在进行微量或超微量分析时，避免污染是关键，需在采样、存储和分析阶段采取严格措施。对于高浓度样品，适当稀释有助于减少干扰。
离子色谱的仪器构成包括流路系统、抑制器、淋洗液发生器、试剂与试剂水、标准贮备液、离子色谱仪、分析柱、样品定量环、容量瓶与样品瓶等。试剂水及淋洗液的纯度直接影响检测限，建议使用高纯水器配制。分析柱的选择应根据具体需求进行。
离子色谱方法包括离子对色谱、离子交换色谱与离子排斥色谱。离子交换色谱是离子色谱中最重要的分离方式，通过固定相与流动相的极性差异，实现离子的分离。离子对色谱通过加入亲脂性物质，生成非极性分子在反相模式下分离。离子排斥色谱利用固定相表面的Donan膜，依据分子的离解常数进行分离。
离子色谱广泛应用于多个领域。在食品检测中，可用于粉丝、腐竹、面粉等水发食品中吊白块的检测，奶制品中三聚氰胺、亚硝酸根和硝酸根的检测，饮用水中消毒副产物的检测，以及食品中添加剂和防腐剂的检测。在环境检测中，可用于水体中生物多胺的检测，碳酸饮料中甜味剂和防腐剂的检测。在化工领域，离子色谱在电镀、石油、制药废水和日用化学品中的应用广泛。此外，离子色谱还可用于科研中的离子液中吡啶和咪唑盐类物质的检测，以及安全治安中无机炸药中阴离子的检测。
离子色谱在多个领域展现出强大的应用潜力，提供了一种高效、准确的分离和检测离子型化合物的方法。
⑵ 原核表达产物纯化后有一条非目的蛋白条带，怎么办
如果有抗体，做个western blot判断下，是杂带还是降解片段；
如果是杂带，优先考虑优化你使用的纯化方案，如Ni柱，考虑延长washing buffer的时间和提高咪唑浓度，使用分辨率更好的填料；
还去不掉，考虑用2步或3步纯化，比如用离子交换、凝胶过滤。
个人见解，仅供参考，祝一切愉快！
⑶ 我也是做蛋白纯化的，有种蛋白第一次纯化时，也是非常杂，你之前又遇到过类似情况有什么经验吗xiexie
一般可溶性表达都会遇同类问题，个人觉得有如下方面可以考虑：
仔细研究填料的说明书，同样是His-tag或GST标签的填料，但不同厂家，或者不同分辨率，其缓冲液和洗脱浓度都是有差异的，务必注意！比如，在选择填料时，可选择颗粒稍微细些的填料，分辨率会更好些。
在样品的各阶段都要控制杂蛋白，以最常见的His-tag，可溶表达为例，上样时，加入低浓度（5-10mM咪唑）；上样后，多洗几个柱体积的缓冲液及低浓度咪唑（20-50mM），更多的洗掉杂蛋白（请注意，在这个过程也会伴随目标蛋白的缓慢洗脱，会一定程度降低得率，所以需要优化时间和浓度）；再采用梯度咪唑洗脱目标蛋白。（所以，第一次用连续梯度洗脱，观察最佳洗脱的咪唑浓度是很有必要的）；
如果一种方法（如亲和）经过优化，某些杂蛋白可能就是难以分离，仍不足以得到理想的纯度，完全可以采用第二步纯化，如离子交换，往往会达到事半功倍的效果，比你总折腾一种方法划算。
个人见解，欢迎继续讨论，祝实验顺利！
⑷ 干货分享 | 蛋白提取纯化具体步骤
蛋白提取纯化详解：步骤、方法与注意事项
蛋白提取纯化主要分为三个步骤：前处理、粗分离与精细分离。
- **前处理**：确保组织或细胞中的目标蛋白以溶解状态释放，保持其天然状态，避免生物活性的丢失。动物材料应剔除结缔组织与脂肪组织，种子材料去壳或种皮，油料种子先脱脂。组织和细胞的破碎采用电动捣碎机、匀浆机、超声波或化学试剂进行，随后使用缓冲液提取所需蛋白，去除细胞碎片，通过离心或过滤分离出目标蛋白。
- **粗分离**：将蛋白提取液与杂质分开，常用方法包括超滤、盐析、等电点沉淀与有机溶剂分级分离。这些方法便于处理大量样本，同时有效去除杂质，浓缩蛋白溶液。
- **精细分离**：利用层析法，如离子交换层析、亲和层析、疏水层析与分子筛，进一步纯化蛋白。电泳法如区带电泳、等电点聚焦也可作为最后的纯化步骤。这些方法对纯化精度要求高，适合小规模分离。
- **提取方法**：蛋白质提取主要依赖溶剂，水溶液提取法使用稀盐和缓冲系统，适用于大部分蛋白质。有机溶剂提取法用于与脂类结合牢固的蛋白质，需在低温下操作。
- **分离纯化**：根据蛋白质溶解度的不同选择分离方法。如盐析法通过调整盐浓度改变蛋白质溶解度，实现分离；等电点沉淀法利用pH调节使蛋白质沉淀；低温有机溶剂沉淀法通过改变溶剂环境实现分离。
进行蛋白纯化时，需注意维护蛋白质的稳定性与活性。选择合适的标签有利于纯化与保持活性。了解蛋白纯化标签的特性和适用范围至关重要。疏水性质的反向HPLC方法适合于分离特定物质。重组蛋白A琼脂糖凝胶FF能有效纯化血清IgG。处理常见问题时，如杂带多、镍柱使用问题、蛋白浑浊、无法纯化等，通过调整超声功率、改变结合缓冲液、增加去垢剂使用、调整洗脱条件等方法，可有效解决问题。
- **标签选择**：His标签、GST标签、MBP标签、NusA标签、Strep标签等各有优缺点，根据蛋白特性选择合适的标签。
- **纯化技巧**：利用蛋白酶抑制剂保护蛋白活性，调整杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，使用去垢剂消除杂蛋白，通过超声前加入去垢剂等方式提高纯化效率。
- **问题**：蛋白纯化过程中常见问题，如杂带多、镍柱使用问题、蛋白浑浊、无法纯化等。
- **解决方法**：通过改变超声功率、检测pH及样品组成、使用特定金属离子、调整洗脱条件等方法，逐一解决。
通过上述步骤与方法，有效实现蛋白的提取与纯化，为后续的研究提供高纯度、活性的蛋白样本。
⑸ His标签蛋白纯化那些事儿，你知道吗
His标签蛋白纯化是一门技术活，需要细致的步骤和方法。是否熟悉His标签纯化的基本知识，决定着蛋白纯化的效果。以下是一些常见的His标签纯化问题和解决策略，希望能帮助你提升纯化效率。
在进行His标签纯化时，推荐的缓冲液条件是：Binding buffer为20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 20–40 mM imidazole, pH 7.4；而Elution buffer则为20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4。His标签在中性或碱性条件下与Ni2+结合力更强，所以推荐使用磷酸缓冲液。
镍柱的蛋白结合载量为至少40mg (His) 6重组蛋白，可以根据填料的结合载量选择预装柱和填料的规格。如果目标蛋白中的咪唑需要去除，可以选择适合的上机脱盐柱或手动脱盐柱。
HisTrap柱子应储存在20%乙醇中，于4℃-30℃条件下，以确保其长期稳定。使用柱子后，正常用缓冲液冲洗即可再次使用。如果柱子出现堵塞、变色等问题，需进行脱镍和挂镍操作，推荐使用20 mM sodium phosphate， 0.5 M NaCl， 50 mM EDTA， pH 7.4的stripping buffer清洗柱子，然后用binding buffer和蒸馏水清洗。
如果裂解液粘性过高，可以使用连续超声或加入5 μg/ml的DNase I、1 mM的Mg离子在冰上孵育来降低粘性。如果目的蛋白不挂柱，可能是His标签没有充分暴露或丢失，可通过加入尿素或盐酸胍等变性剂检查，或者调整His标签的位置。缓冲液条件不合适、洗脱时间过短、样品量过大等情况也可能导致此问题。在纯化过程中，若蛋白挂柱后洗脱不下来，可能是洗脱条件太温和或蛋白在柱子中沉淀，此时可调整咪唑浓度或pH值，使用添加剂或改变NaCl浓度，或尝试在变性条件下洗脱。对于洗脱不纯的蛋白，需要检查是否被蛋白酶降解，是否存在高度亲和镍离子的污染物，或有相互作用的污染物，这时可以通过增加添加剂浓度或使用离子交换层析、分子筛进一步纯化。
优化金属离子和宿主蛋白中His标签的结合能力，可以提高蛋白纯度。若遇到纯度问题，尝试更换成结合能力较弱的Co2+，以减少宿主蛋白的杂质。
以上是一些His标签纯化过程中的常见问题及解决策略，希望能帮助你提升蛋白纯化的成功率。如果你有任何疑问或需要进一步的帮助，欢迎咨询优宁维代理的Ni Sepharose FF 填料。
⑹ 纯化后的蛋白在含有高浓度nacl的情况下浓缩容易沉淀吗
理由相信，浓度越高，对保存蛋白质越有利。加入 PEG 和更换 缓冲液种类是一种值得试验的方法，但结果如何还在两可之间，没试过就不会知道。
镍柱下来以后，溶液中混有相当多咪唑和议定含量的Ni，都有可能引起蛋白质不稳定变性沉淀。
我在纯化一种蛋白质时，也遇到过相同的情况，虽然蛋白质不同，但是也许能有帮助。
镍柱后，用含 EDTA 的缓冲液透析，除去 Ni ，再过 DEAE 离子交换柱，之后透析再浓缩，分装小管，-80度保存。一次使用一支。
理论上说蛋白质应在高浓度情况下保存，但当缓冲溶液中含有大量盐而且目的蛋白中含有大量输水氨基酸的情况下，高浓度就不利于保存。
在这种情况下，如果你不想太多的稀释蛋白，可以选择适当脱盐，如透析、凝胶过滤、超滤等，但应保持缓冲液具有一定的离子强度（500mM NaCl这个浓度太高，可以降到100），如果还不行的话，可以添加甘油至终浓度5%左右。
Ni纯化最好不要用Tris，可能会影响Ni的结合。