超滤法测血浆蛋白结合率原理

㈠ 蛋白质分离方法有哪些,它们的特点各是什么

1.根据分子大小不同进行分离纯化
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白
质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离.根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等.透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法.透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离.超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程.这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开.它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐.由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小.所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果
离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法.当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开.例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3].使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度.密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低.蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白.凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一.凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外.目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等.在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1].凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7].
2.根据溶解度不同进行分离纯化
影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等.但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的.常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等.
等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法.每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解.因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质.王洪新等[8]研究茶叶蛋白质提取过程发现,pH值为时茶叶蛋白提取效果最好,提取率达到36·8%,初步纯化得率为91·0%.李殿宝[9]在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到3~4,使目标蛋白于等电点沉淀出来.等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取.李凤英等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3·8.他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质,得到了最佳的提取工艺为:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃搅拌40 min,葡萄籽蛋白质提取率达73·78%.另外还可以利用碱法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取[11].利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白,蛋白质产率高达90%[12].
蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析.应当指出,同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃搅拌提取30min,蛋白质提取率为57·25%[10].盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产.由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性.为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐[13].
有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质.例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白[14].由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性.因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决.对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液.冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白.冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用[15].
萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质.双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取.此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高.对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎.目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中.采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响[16].
反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的.反胶团是当表面活性剂
在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体.这种方法的优点是萃取过程中蛋
白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护.程世贤等[17]就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质.
3.根据电荷不同进行分离纯化
根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类.
在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这
种现象称为电泳.聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质.它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少.等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定.利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的.在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带.孙臣忠等[18]研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用.结果发现,聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大.
离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法.离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成.带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂.离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化.当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同.阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来.反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来.李全宏等[19]将离子交换层析应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯.另外,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取[7].
4. 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法.它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高.应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件.近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力[20].亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛[21].范继业等[22]利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428 BAEE·mg-1,纯化回收率达到62·5%.该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广,产品质量稳定.

㈡ 外泌体提取策略

外泌体即细胞外囊泡（简孙纳卜称EVs）是所有细胞主动分泌的纳米级囊泡,活细胞释放不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流,细胞外囊泡越来越多地被认为是有希望的液体活检生物学标志物｡根据相似囊泡的直径大小可将细胞外囊泡分为三类,直径在50-150nm的外泌体,直径在100-1000nm的微囊泡､外粒体和微颗粒,直径在-100-5000nm的凋亡小体｡目前主要认为,外泌体产生的过程是细胞膜内陷形成内体,再形成多泡体,多泡体与质膜融合导致其管腔内囊泡释放到细胞外,产生一种称为外泌体的EV亚型｡

2 外泌体的提取纯化方法

2.1 基于密度的分离方法

2.1.1 超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞;然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器;最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从 上清液 中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度离心法

目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡

2.2 沉淀法

2.2.1  聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡

2.2.2 试剂盒法

最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡

2.3 基于大小的分离方法

2.3.1 SEC SEC

主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法茄吵,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡

2.3.2超滤法

超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改则穗良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡

2.4 基于表面成分亲和力的分离法

2.4.1 蛋白质

外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加 缓冲液 冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡

2.4.2 膜磷脂

虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰 丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡

2.5   ACE分离法

ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡

2.6 微流控芯片法

微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体 活检 中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡

提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。 

㈢ 生物分析 | 药物-血浆蛋白结合率研究的方法和要求

在药物研发的旅程中，药物与血浆蛋白的相互作用起着关键作用，血浆蛋白结合率（PPB）揭示了药物的有效活性成分。这一比率越高，药物在游离状态下的浓度越大，药效往往更为显著。了解PPB是评估药物代谢和分布的重要步骤，测定方法包括平衡透析（ED）、超滤（UF）和超速离心（UC）。

表1/2中，详细列出了依据化合物性质，体外或体内研究中各种技术的使用频率，为实验设计提供了指导原则。[3]

㈣ 心力衰竭超滤治疗有什么价值

摘要

容量负荷过重是心力衰竭患者反复住院的主要原因，钠潴留是核心的病理生理环节，而血液超滤是治疗液体潴留的“金标准”。现有证据表明超滤能改善心力衰竭转归，降低再住院率。本综述阐述了超滤治疗心力衰竭的机制、有效性、安全性、适应症以及未来的研究方向。

关键词：超滤 心衰 钠水潴留

The Future and Current Role of Ultra?ltration in Patients with Heart Failure

Abstract

The high readmission rates of heart failure is e mainly to fluid overload and sodium retention plays a pivotal role in the pathophysiologic process. Ultrafiltration is the gold standard for sodium-volume removal. The available evidence supports Ultrafiltration improve outcomes in patients with acute decompensated heart failure. This review illustrates technical issues, mechanisms, efficacy, safety, indications and directions of ultrafiltration in heart failure.

Key words: Ultrafiltration, heart failure, sodium and water retention

充血性心力衰竭（congestive heart failure，CHF）患者常因心功能失代偿需要反复住院治疗，社会及经济负担巨大，已成为最严重的全球性健康问题之一。容量负荷过重和肺充血是绝大多数急性失代偿心衰（acute decompensated heart failure，ADHF）患者住院的主要原因。血液超滤是治疗钠水潴留的“金标准”，采用超滤技术有效处理充血显示了很好的前景，已成为国际研究热点。

钠在CHF中的重要作用

钠离子是细胞外液最重要的离子，体内钠总量决定了细胞外液的总量。CHF患者水肿发生的主要原因首先是体内钠总量的增加，而不是水。CHF时钠水潴留首先是钠潴留，这是交感-肾上腺系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活，肾小管钠重吸收增加的结果。钠的增加必然伴随体内水的蓄积，最终导致细胞外液量增加。同时，钠潴留也构成了放大神经内分泌激活反馈环的一部分。

钠水潴留导致肺充血和心室充盈压升高，临床表现为呼吸困难、端坐呼吸、舻取M，室壁张力增加会使冠脉灌注减少，导致心内膜下心肌缺血，加速细胞凋亡、坏死。另外，室腔扩大和心室球形重塑引起或加重二尖瓣和三尖瓣返流，造成心功能进一步恶化。这些不良的病理生理后果是最终进一步恶化心室收缩和舒张功能。右心压力上升引起心肌间质水肿、心肌收缩力下降。静脉压升高临床上会导致肾血流下降、肾小球滤过率降低和钠排泌减少。因此，如何安全有效地处理容量负荷是CHF治疗的重要靶标。

利尿剂面临的挑战

利尿剂是目前纠正容量负荷过重、缓解肺充血症状最常用的药物，但是利尿剂的效果不尽人意。大量的研究显示，即使规范化治疗的住院病人，多数CHF病人的容量负荷过重也没有得到有效纠正。ADHERE注册研究中，21的病人出院时体重没有变化甚至增加；住院过程中，体重减少小于10磅者占74，也就是说体重不达标者近3/4。利尿剂抵抗也是心衰利尿治疗难题之一, 约占心衰患者中的1/3。

呋塞米会激活神经内分泌系统，降低肾小球滤过率。静脉使用呋塞米，使肾素、醛固酮、去甲肾上腺素升高。Bayliss等的研究表明，使用呋塞米4周，会使血浆肾素和醛固酮水平持续增加。事实上，神经内分泌激活与病死率直接相关。早在1987年就有学者研究发现，单次静脉使用呋塞米使肾小球滤过率降低15，肾血流也相应下降。Gottlieb等对63例CHF病人的研究发现，呋塞米会明显降低肾小球滤过率。肾小球滤过率越低，需要的利尿剂剂量就越大，病死率就越高。

利尿剂对CHF远期转归的影响，迄今为止尚无随机对照临床试验数据。但ADHERE研究发现，使用利尿剂和肌酐水平升高者死亡率更高，住院时间更长。有肾功能不全且同时使用利尿剂者，死亡率为7.8，不使用者为5.5；肾功能正常同时使用利尿剂者死亡率为3.3，不使用者2.7。死亡率最高的一组是肌酐升高且长期使用利尿剂患者。该研究还发现，无论治疗初始的肾功能如何，长期使用利尿剂治疗的死亡率更高。

在寻证医学的时代，这一目前“最好”的缓解症状的治疗工具，因为自身药理性质的限制，违背了总的治疗目标，可能导致有违初衷的结果。

血液超滤是纠正钠水潴留的“金标准”

采用血液超滤脱水纠正钠水潴留已有30余年历史。与肾小球滤过原理类似，滤器在超滤泵负压吸引下，利用半透膜两侧建立的压力梯度滤出水分及中小分子物质，蛋白和血细胞不能透过滤膜孔而被留存，形成超滤液。超滤液的形成不依赖溶质浓度梯度，钠和水等小分子溶质能自由通过半透膜。临床上可以根据病人的具体负荷状况，确定需要清除的钠和水的总量，实现可调、可控、可预测的机械脱水。超滤液成份相当于原尿，电解质浓度和晶体渗透压与血浆相同。因此，单纯超滤前后血浆钾、钠、氯、碳酸氢盐等变化不明显，不会造成电解质和酸碱平衡紊乱。

超滤缓解钠潴留优于利尿剂。缓解钠水潴留的核心是钠，人体钠总量决定细胞外液总量，决定充血症状的程度。以呋塞米为代表的利尿剂产生的是低张尿，尿钠浓度约为60mEq/L，正常血钠浓度为140时，每排出1L尿，会有80mEq的钠存留体内，如果体内有10L的钠水潴留，充分利尿后会有800mEq（18.4g）钠滞留体内。超滤液钠浓度与血浆相等，因此，与利尿剂比较等量的液体清除，超滤的排钠量更多，排钠能力强于利尿剂。

超滤机械脱水对CHF病人有良好的血流动力学效应。Marenzi等测量了24例CHF患者超滤前后的血流动力学反应。总超滤量为4880±896ml，随着超滤量的增加，肺毛压（PWP）和右房压（RAP）逐步下降，心排量（CO）和每搏量（SV）提高。

临床试验证明超滤治疗优于利尿剂

血液超滤治疗CHF的临床观察已有30余年历史，主要杂志上已发表了100余篇论文。但早期的研究采用的是传统CRRT或血液透析设备，因为临床使用不便，这些研究多为单中心和小样本的零星研究，难以形成有力的证据。随着便携式心衰专用单纯超滤设备的出现，超滤治疗CHF重新引起了临床极大的关注。

Dahle等的研究针对ADHF病人首先验证了采用外周静脉建立体外循环实现血液超滤是可行的。9例ADHF患者使用2个18G静脉导管建立浅表静-静脉超滤，超滤持续33.3±20小时，总超滤量7.0±4.9L，患者体重下降6.2±5.0kg。为CHF现代超滤治疗奠定了基础。

RAPID-CHF试验[9]共入选40例ADHF病人，在入院24小时内随机分配到早期超滤或利尿剂组，超滤组限定单次8小时治疗。超滤组和利尿剂组24小时平均液体清除量分别为4650ml和2838ml（p＝0.001），主要终点体重下降分别为2.5kg和1.86kg（p＝0.240）。在清除液体而言，超滤治疗优于利尿剂，而且超滤过程安全，病人耐受良好。

Costanzo等[10]对20例ADHF伴利尿剂抵抗的患者，入院早期（4.7±3.5小时）开始超滤治疗。结果显示，平均总超滤量达到8654±4205ml，12例患者（60）3天内出院。与超滤前基线数据比较，随访第30天和90天的体重明显下降（p=0.06）,症状明显改善（p=0.003），血肌酐没有明显变化。超滤能够安全有效的缩短住院时间，改善心功能状态，临床获益持续3个月。

UNLOAD研究是迄今最大规模的评价超滤治疗ADHF随机对照试验。该研究共28个中心参加，入选200例收缩期心衰住院患者，随机分到早期超滤组（住院24小时内）或常规利尿组。超滤组住院后48小时内不用利尿剂，超滤量和速度（最大500ml/h）由负责医师确定。常规利尿治疗组静脉使用利尿剂是门诊剂量的2倍以上。

结果显示，超滤组比静脉利尿剂组体重降低更多（5.0±3.1 vs 3.1±3.5kg，p=0.001），呼吸困难缓解两组相似。超滤组90天再住院率更低（18.6 vs 32.2，p=0.04）。安全指标方面，超滤组低血钾更少（1 vs 12,p=0.018）,出院时肌酐升高（＞0.3mg/dl）的比例两组相似（22.6 19.8, p=0.709）。

UNLOAD试验回答了超滤治疗ADHF的几个重要问题。超滤在降低体重和减少再住院等终点指标上，优于常规药物治疗。对于CHF远期转归，超滤明显减少再住院和对医疗资源的占用。试验证明超滤治疗CHF是安全的。

急性失代偿性心衰心肾挽救研究（Cardiorenal Rescue Study in Acute Decompensated Heart Failure ,CARRESS-HF）是近期发表的一项重要研究。该研究入选的是急性失代偿心衰伴肾功能恶化的患者，共纳入188例患者，随机分为阶梯药物治疗或血液超滤治疗组，药物治疗组调整利尿剂和其他药物直到每日尿量达到3-5L。研究主要终点为96 h患者体重和血肌酐水平的变化。结果显示，两种治疗策略在体重减轻方面作用相似（5.5±5.1kg vs 5.7±3.9kg，p=0.58）；阶梯药物治疗组血肌酐无明显变化，而超滤组肌酐明显升高（-3.5±46.9μmol/L vs 20.3±61.9μmol/L，p=0.003）；两组死亡率和因心衰住院率方面无差别，但血液超滤组有更多的严重不良事件（72对57，P=0.03）。

在超滤治疗ADHF研究阳性结果一边倒的情况下，这是一项非常有意义的研究。对于ADHF伴肾功能恶化的患者，超滤治疗并不优于强化药物治疗方案，它可引起更多的肾功能恶化。同时，研究者也注意到，针对心肾综合征这一特定的患者人群，无论采取哪种治疗策略，总体预后都很差，1/3的患者在60天因心衰死亡或再次住院。治疗这些患者仍是一个挑战，需要寻找更好的治疗方法。

在对利尿剂反应差的患者中，血液超滤是很好的替代，该研究未纳入此类患者。研究中患者出现肾功能恶化的原因尚不清楚，肾功能恶化可能是不良事件增多的原因。同时，也有学者认为血肌酐的一过性升高不一定反映了肾功能的恶化，也有可能与血液浓缩有关，减慢超滤速度可能有较好效果。

日常临床实践中，药物治疗缓解充血，每个医院的用药差异很大。达到CARRESS-HF研究药物阶梯治疗的每日3-5L尿量不太现实。ADHERE数据库中，73的ADHF住院期间体重下降＜4.5kg，而该研究中平均体重下降为5.5kg。

ADHF出现心肾综合征是最大神经内分泌激活和严重心肾轴紊乱的表现，针对ADHF病理生理下游的任何治疗（包括超滤）都不会根本改善临床转归。早期使用超滤可能获益最大，而不是到了晚期作为挽救性治疗。

AVOID-HF研究是正在进行的一项随机对照试验，该研究计划入选800例肌酐＜3mg/dl的ADHF患者。研究目的是与静脉利尿剂比较，考察超滤是否能减少这类病人的心衰事件。这是迄今入选样本量最大的研究，期待能回答超滤治疗对心衰事件的影响。

超滤作为治疗CHF的新方法，已发表的临床研究加深了我们对心衰的认识，并显示了很好的治疗前景。但是仍有诸多问题有待回答，比如，明确界定超滤的最佳指证和超滤治疗的最佳时机，什么类型病人获益最大？有没有其他难以预测的副作用？未来需要更多、更大规模临床试验来回答这些问题。

㈤ 滤过作用的原理

1.机械屏障-滤孔
滤过膜由三层结构组成(图)
①内层是毛细血管的内皮细胞。内皮细胞有上许多直径50-100nm的小孔，称为窗孔(fenestration)，它可防止血细胞通过，但对血浆蛋白的滤过可能不起阻留作用。
②中间层是非细胞性的基膜，是滤过膜的主要滤过屏障。基膜是由水合凝胶(hydrated gel)构成的微纤维网结构，水和部分溶质可以通过微纤维网的网孔。有人把分离的基膜经特殊染色证明有4-8nm的多角形网孔。微纤维网孔的大小可能决定着分子大小不同的溶质何者可以滤过。
③外层是肾小囊的上皮细胞。上皮细胞具有足突，相互交错的足突之间形成裂隙。裂隙上有一层滤过裂隙膜(filtration slit membrane)，膜上有直径4-14nm的孔它是滤过的最后一道屏障。通过内、中两层的物质最后将经裂隙膜滤出，裂隙膜在超滤作用中也很重要。
2.电学屏障
滤过膜各层含有许多带负电荷的物质，主要为糖蛋白。这些带负电荷的物质排斥带带负电荷的血浆蛋白，限制它们的滤过。肾在病理情况下，滤过膜上带负电荷的糖蛋白减少或消失，就会导致带负电荷的血浆蛋白滤过量比正常时明显增加，从而出现蛋白尿。
人体两侧肾全部肾小球毛细血管总面积估计在1.5以上，这样大的滤过面积有利于血浆的滤过。在正常情况下，人两肾的全部肾小球滤过面积可以保持稳定。但是在急性肾小球肾炎时，由于肾小球毛细血管管腔变窄或完全阻塞，以致有滤过功能的肾小球数量减少，有效滤过面积也因而减少，导致肾小球滤过率降低，结果出现少尿(每昼夜尿量在100-500ml之间)以致无尿(每昼夜尿量不到100ml)。 肾小球滤过作用的动力是有效滤过压。
肾小球有效滤过压=(肾小球毛细血管压+囊内液胶体渗透压)-(血浆胶体渗透压+肾小囊内压)(图)。由于肾小囊内的滤过液中蛋白质浓度较低，其胶体渗透压可忽力略不计。因此，肾小球毛细血管血压是滤出的唯一动力，而血浆胶渗透压和囊内压则是滤出的阻力。有效滤过压=肾小球毛细血管压-(血浆胶体渗透压+肾小囊内压)。皮质肾单位的入球小动脉粗而短，血流阻力较小；出球小动脉细而长，血流阻力较大。因此，肾小球毛细血管血压较其它器官的毛细血管血压高。用微穿刺法没得肾小球毛细血管平均值6.0kPa(45mmHg)(为主动脉平均压的40%左右)；用微穿法还发现，由肾小球毛血管的入球端到出球端，血压下降不多，两端的血压几乎相等。肾小囊内压与近曲小管内压力相近。囊内压为1.3kPa(10mmHg)。据测定，在大鼠的肾小球毛细血管入球端的血浆胶体渗透压约为3.3kPa(25mmHg)左右。
在入球端，有效滤过压=6.0-(3.3+1.3)=1.4kPa。但肾小球毛细血管内的血浆胶体渗透压不是固定不变的。在血液流经肾小球毛细血管时，由于不断生成滤过液，血液中血浆蛋白浓度就会逐渐增加，血浆胶体渗透压也随之升高。因此，有效滤过压也逐渐下降。当有效滤过压下降到零时，就达到滤过平衡(filtration equilibrium)，滤过便停止了(图)。由此可见，不是肾小球毛细血管全段都有滤过作用，只有从入球小动脉端到滤过平衡这一段才有滤过作用。滤过平衡越靠近入球小动脉端，有效滤过的毛细血管长度就越短，有效滤过压和面积就越小，肾小球滤过率就低。相反，滤过平衡越靠近出球小动脉端，有效滤过的毛细血管长度越长，有效滤过压和滤过面积就越大，肾小球滤过率就越高。如果达不到滤过平衡，全段毛细血管都有滤过作用(图)。