pbs离子交换层析

『壹』 单克隆抗体的纯化技术操作步骤

从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体，不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。如果用于免疫标记测定，须分离和纯化。可用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀，进行初步浓缩和纯化；可用亲和层析法进一步纯化。

一、腹水型单抗的纯化

在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。

1、二氧化硅吸附法

新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。

2、过滤离心法

用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。

3、混合法

即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。

二、单抗的粗提

1、硫酸铵沉淀法

（1）饱和硫酸铵溶液的配制

500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8。

（2）盐析

吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。

（3）脱盐

常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。将盐析样品装入透析袋中，对50-100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析（4℃）12-24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂（碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20% NaOH 50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。

（4）蛋白质含量的测定

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数；或（Pr）=OD280×稀释倍数/1.3

（5）分装冻存备用

2、辛酸-硫酸铵沉淀法

该法简单易行，适合于提纯IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。其主要步骤如下：取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调PH至4.8；按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤（125um），加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调PH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。

3、优球蛋白沉淀法

该法适用于IgG3和IgM型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变，对IgG3单抗的回收率高于90%，对IgM单抗的回收率为40-90%不等。其操作步骤如下：取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的浓度分别达0.2mol/L和25mmol/L，随之可见纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，滤液对100倍体积的去离子水透析，4℃ 8-15小时（若是IgG3单抗，也可室温2小时），其间换水1-2次；取出后22000g离心30分钟，弃上清；将沉淀溶于PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重复上述的透析与离心；将沉淀的优球蛋白浓度调至5-10mg/ml，分装冻存备用。

三、单抗纯化的方法

单抗纯化的方法有很多种，应根据具体单抗的特性和实验条件选择适宜的方法，常用的技术有DEAE离子交换层析柱、凝胶过滤法和亲和层析法三种。

1、离子交换层析：

分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素(CM纤维素) 和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来

2、凝胶过滤法：

一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时，大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小，小分子则在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。

缺点：从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度(即洗脱体积的大小)并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径，利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时，标准蛋白质(已知分子量和斯笃克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)，否则不能得到比较准确的分子量。分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。而且柱子成本比较高，整个实验过程耗时很长。

3、免疫亲和层析法：

是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低。

用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析法则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。

『贰』 酶的分离纯化一般经过哪些步骤应注意哪些问题

酶是一种特殊的蛋白质，在分离纯化过程中需要注意温度以及PH值等的控制，注意在纯化过程中所使用的缓冲溶液的离子强度的控制（常用PBS缓冲溶液），在实际纯化过程中，一般要在低温冰箱中进行，缓冲溶液中注意加入EDTA二钠盐（1-5mM）螯和重金属离子一般避免酶失活。常用分离步骤包括分子筛层析、离子交换、疏水层析等步骤。

『叁』 有人知道金属硫蛋白吗

1957年Margoshes和Vallee在研究金属生物学作用时，从动物器官分离出一种新的蛋白质，它含有丰富的巯基，能螯合大量的金属离子，此物质称为金属硫蛋白（英文为Metallothionein，简称MT）。人体内、动物、植物以及微生物均含MT，而且其理化特性基本一致。MT分子呈椭圆形，分子量为6500道尔顿，直径30-50A，分两个结构域，每个分子含7-12个金属原子，具有特殊的光吸收。MT构象较坚固，具有较强的耐热性。

MT是科技界在动物体内发现的一种最重要、最奇异、生理功能最多的活性物质。它所具有的生物功能使科学家为之称奇，由于MT分子中含有20个游离的巯基（-SH）基因以及由它们组成的多个巯基簇，从而使它生物体中同时具有六大功能：

一、清除体内自由基、防止基体衰老 ：MT是体内清除自由基能力最强的一种。清除羟自由基（.OH）的能力约为SOD和谷胱甘肽（GSH）的10,000倍，清除氧自由基（O）的能力约是GSH的25倍。

二、解除重金属的毒性：MT的巯基基因（-SH）能强烈螯合有毒金属汞、银、铅、镉、砷、铬、镍等，其中螯合铅的强度比锌大200倍，而螯合镉的强度又比铅大10倍，并可将之排出体外，从而使它们无法毒害人体，同时对体内锌等微量元素无影响。MT是目前临床是最理想的生物解毒剂，其它无可代替。

三、参与体内微量元素的代谢：在体内，MT可根据体内微量元素的状况对锌、铜、锰、铁、钼、硒、钴、碘的吸收、储存、运输和释放等进行精细调节，使机体达到最佳生理状态。

四、增强机体对各种不良状态的适应能力：当机体处于各种不良状态时（如遇各种炎症、烧伤、寒冷、饥饿、疲劳、辐射、金属中毒等），体内MT含量增加，从而提高锌、铜、锰、铁、钼、硒、钴、碘等微量元素的浓度，以激活体内各种应激酶的活性，机体适应能力随之增强。

五、锌元素的贮存库：每100毫克锌金属硫蛋白含6.9毫克锌，肝、肾中的锌元素主要是以金属硫蛋白的形式贮存，根据机体对锌元素的需求它便可迅速释放锌以满足人体中200多种酶对锌元素的需要，维持机体的正常代谢。

六、防止细胞癌变：MT可消除自由基、重金属（砷、汞、镉、铬、镍）、烷化剂、电离辐射以及紫外线对DNA、RNA、酶、蛋白质以及细胞膜的损伤，从而可以防止它们的致癌、致突变作用，以维持细胞的正常代谢和分裂；另外还可以激发机体的免疫功能，增强机体的防癌和抗癌能力。

自从MT被发现以来，它成为基础科学研究的热点之一。从1978年到1999年共举行了四次国际专题研讨会，我国将MT列入[863]重大攻关计划，1995年列入国家级[火炬计划]。同时各国科学家也在努力开发MT的新用途，大量的科学实验和临床结果表明：MT在抗电离辐射、紫外线照射、解除金属毒素、治疗消化道溃疡、心肌梗塞、各种炎症、各种癌症、美容护肤、减轻吸烟及环境污染对人体的危害及抗过敏等方面均有显著疗效。

MT具有广谱高效的保健效果和极高的医疗价值，其用途大致如下：

一、保健食品 用MT制成的口服液或胶囊具有清除人体的自由基的作用，根据人体的需要配制而成。不断清除自由基是保持人体健康的最有效方法，从而增强人体的免疫功能、降低血脂、清洁血液达到延缓衰老的目的，提高生活质量。)

二、重金属解毒素 有毒重金属一般是指铅、砷、汞等，一旦中毒是很难治愈的，MT可以与铅、砷、汞等有毒金属紧密结合，使它们无法毒害其它生物大分子，从而起到解除重金属对人的毒性，这对保护大脑、肝、肾等人体重要器官具有极其重要意义。用MT制成的解毒剂主要用于重金属中毒人员抢救治疗，可用于矿工、冶炼工人和受重金属污染地区人员的日常保健。

三、抗辐射剂 X-射线、紫外线及各种电离辐射对身体造成损伤的主要机理之一，就是产生大量自由基和具有高度的活性物质，这些产物可破坏生物大分子，如蛋白质、不饱和脂肪酸、DNA、酶及细胞膜，而使它们不能发挥正常的生理功能，久而久之，被辐射的人员出现早衰、寿命缩短、患皮炎、血液病、肿瘤、癌症。MT能有效消除各种自由基，所以它具有抗辐射能力，用MT制成的抗辐射剂适用于医院X-光透放操作人员、同位素接触人员、飞行员、空姐及放疗病人。

四、护肤美容 MT不仅可以清除体内产生的自由基及调节人体代谢平衡，而且还可以有效抵抗各种有害气体（如汽车尾气、工业废气、烟雾等），它可以加速面容各种炎症（如青春痘）的康复，用MT制成的护肤美容品，其保健效果奇佳，各类人员均可使用。

五、肠胃溃疡康复剂 将MT静脉注射给大鼠动物实验，结果证明MT能加强溃疡屏蔽系统的形成，从而促进肠胃疾病的康复。

六、防癌抗肿瘤 在肿瘤预防和治疗中，MT可保护细胞抵抗自由基、重金属、烷化剂、辐射及紫外线致癌，所以MT具有广泛的防止细胞癌变和抗肿瘤作用。

七、补锌剂 严格地讲，我们生产的MT应该称为Zn-MT（即锌金属硫蛋白），是结合Zn的MT，所以有人把MT也称为生物锌，一个分子的MT能结合5-7个锌原子。如5mg的MT中的含锌量为5×1016个。锌为人体必需的一种元素，俗称“生命之光”。锌的缺乏会引起多种机能障碍：如生长不良及生殖器官发育受损、儿童常见的多动症、伤口愈合不良、对味道的敏感减弱、性功能衰退等。实验证明，口服锌金属硫蛋白半小时后，人体中锌值明显升高，一小时达到最高值，并能维持8小时以上。因此补充锌能使生命充满智慧、活力和激情。

由于MT的保健、医疗价值非凡，纯生物制品是一种高附加值产品，提取技术难度大，国际报价达66.50美元/毫克，等于每公斤合人民币5亿元，可谓价值连城。可以预料，在21世纪中，MT这朵生物奇葩必将绽放更绚丽的光彩。