蛋白浓缩超滤管用pbs吗

1. 牛血清白蛋白的提取和鉴定方法(设计性实验报告)

牛血清白蛋白的提取操作步骤：

1、盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（2000r/min）10min，将上清液倾入试管中。

2、取干净的比色板，在各孔内滴加一滴纳氏试剂 

3、取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。

4、每隔2分钟检查一次，更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化并记录，直至袋内盐分透析完毕。

5、将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。

牛血清白蛋白的鉴定方法：

1、点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5㎝处做点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。标准液点一次，待测液点三次。

2、电泳将点样后的膜条致于电泳槽架上，放置时膜条无光泽面向下，点样端致于阴极，待平衡5min后，打开电源，调节电源，调节电泳仪的电压为160伏，通电60min，关闭电源后用镊子将模条取出。

3、 染色将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟后取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液1、2、3中各漂洗5min，直至背景漂洗干净为止，用滤纸吸干薄膜。

4、鉴定比较样品和待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位置是否一致。

(1)蛋白浓缩超滤管用pbs吗扩展阅读：

牛血清白蛋白

牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/1000ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。

血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 Da，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。

2. 外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（十九）

分享一篇发表在J Extracell Vesicles（2020年IF=25.83）上的文章，标题为《Active cargo loading into extracellular vesicles: Highlights the heterogeneous encapsulation behaviour》。细胞外囊泡(EVs)是生物纳米颗粒，来源于大多数细胞类型，用于调节细胞间通信。它们作为天然分泌的纳米囊泡，在药物传递领域展现出巨大潜力，因其固有的生物相容性、合适的尺寸和固有的细胞靶向能力。

尽管EV治疗具有独特优势，但封装大量治疗分子以稳定使用作为输送载体仍是一个挑战。研究主要分为两类载药方法：预装载和后装载。预装载涉及将小分子药物与亲本细胞共孵育或转染药物编码DNA到亲本细胞，然后分离自然携带治疗分子的EV。然而，这种方法仅限于培养细胞来源的EV，难以应用于血浆或食物来源的EV。后装载方法则在被动或主动刺激下，如孵育、超声、冻融和电穿孔，将药物载入纯化的EV。尽管如此，所有方法都遇到了装载能力较差的问题，特别是对于亲水分子的封装。

为了提高装载效率并促进治疗药物封装，研究提出了一种高效载药方法，名为“超声和挤压辅助主动负载”(SEAL)。该方法通过在硫酸铵中重悬并超声mEVs，暂时渗透膜以建立主动加载所需的跨膜铵梯度。挤压操作缩小mEVs，使颗粒尺寸均一，从而重塑不利于载药和递送的非球形或多层囊泡。然后用PBS透析散装溶液，并用阿霉素孵育进行活性负荷。

通过TritonX-100裂解mEVs样品，检测荧光信号以确定SEAL的效率。与被动孵育相比，由于药物封装更有效，荧光强度增加了10.5倍。显著的荧光猝灭进一步证实了更多药物在SEAL制备的mEVs腔内累积。在脂质体模型中也获得了一致的结果。Western blot检测显示超声和挤压处理没有显著影响mEVs的蛋白含量。

为了优化SEAL的技术参数以改善载药量，研究发现2-4分钟的超声处理和0.5-1M硫酸铵溶液条件效率最佳。延长超声处理时间或使用更浓缩的溶液都不能在不影响结构完整性的情况下提高封装效率。挤压操作结果显示，超声处理后的3个挤压循环足以减小mEVs的尺寸，提高封装效率。通过多参数分析，揭示了mEVs的封装异质性与成分方差之间的相关性，进一步指导了纯化过程中去除不需要的组分，提高纯度。

为了彻底揭示异质性，研究应用nFCM系统对SEAL制备的Dox-mEVs进行单颗粒分析。这提供了更定量的方法来表征载药能力，包括活性载率和活性加载效率。研究发现未/低负载颗粒的共存是显著的，因此采用超滤(UF)、尺寸排除色谱(SEC)和胰蛋白酶处理三种EV纯化方法进行了研究，发现SEC和胰蛋白酶处理能够增加活性负载率，而UF纯化导致样品损失。

研究还分析了封装异质性与脂质包涵体的相关性，证明只有具有脂质包涵体的颗粒是可主动加载的。脂质探针介导的磁分离技术(LPMIT)用于选择性去除非脂质封闭颗粒，提高Dox-mEVs样品的纯度。纯化的Dox-mEVs样品的活性负载率进一步提高到63.2%。

牛乳中含有大量酪蛋白，使mEVs的纯化和应用更加复杂。因此，研究引入了免疫磁性分离技术(IMIT)以去除所观察到的酪蛋白成分，并进一步提高活性负载率到83.6%。

研究最后进行了细胞毒性分析和细胞内化行为分析，证明由SEAL制备的装载mEVs的治疗潜力以及样品纯度对整体治疗性能的影响。细胞毒性分析显示空白mEVs的细胞毒性可以忽略不计，而Dox-mEVs表现出强大的细胞毒性反应。细胞内化行为分析则表明转铁蛋白偶联后Dox-mEVs增强了细胞毒性，进一步证实了配体促进的内化。

文章的目的是分享在提高EV药物封装效率和改善治疗性能方面的最新研究成果。通过引入高效载药方法和优化纯化过程，研究揭示了药物封装异质性对治疗结果的潜在影响，并证明了SEAL制备的mEVs制剂具有优越的治疗性能。有兴趣的读者可以自行查找原文进行更深入的了解和研究。

3. 抗体透析时夹透析袋的夹子开了，抗体进入了5mM PBS透析液中怎么办如何从透析液中提取抗体呢

这个基本没有办来法。
你透析源液多在体积？如果体积小一点的话。你先把透析液分装一下。－20冻起来.留下一小部分用于你的实验看一看。如果行的话就这样用。如果浓度太低，那就没办法。
当然，你也可以试着用A蛋白纯化柱或者G蛋白纯化柱试着回收，但一个这种柱子太贵，另一个，能否回收得到还是个问题。

4. 纯化的单克隆抗体，超滤浓缩的时候会把磷酸盐离心掉导致抗体的缓冲环境变成水吗

不会的。。。
超滤浓缩对于缓冲液成分不会有任何改变的，因为PBS中的磷酸根离子回也好答，氯离子也好，钠离子也好都是很小的离子，可以在溶液中自由扩散，不会因为超滤离心就被甩到下层滤液中去。
你可以做个简单的实验，取一定体积PBS溶液测一下pH值和电导率值，之后用超滤管去离心。取出上层未被滤完的溶液再测一下pH值和电导率值，会发现pH值和电导率值和之前测的是一样的。即可证明未被滤完的溶液还是PBS溶液，而不是水。

5. 蛋白质提取分离纯化鉴定的实验方案

一.血清ǐ-球蛋白的初步提取
1. 血细胞与血清分离：
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm离心20min .弃沉淀,留上清备用(沉淀为血细胞，上部为血清).
2. 乳糜粒分离：4000rpm 10°C离心10分钟,采用密度梯度离心
梯度液配置：离心管下部3/4容积加血浆，上部1/4容积加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮，将乳糜粒吸出,留其余液体备用。
3. 血清蛋白分离：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白质。
5000rpm 10°C离心1h,密度梯度离心
梯度.液配置：管容量1/3为血清，2/3为1。31g/ml,NaCl+NaBr,搅拌后终密度为1。21g/ml .管上部1/6容积为血清脂蛋白，下部5/6为其它蛋白。
4.取2ml下部5/6血清于小试管中,加0.9％氯化钠溶液2.0ml，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml，加入PBS洗脱液2ml,混匀后于室温中放置10min，此步骤可重复1～2次
3000rpm 离心5min.沉淀物即是ǐ-球蛋白.
二.凝胶层析提纯血清ǐ-球蛋白(1)装柱：海绵垫装入玻璃柱底端,作为柱底支持物,装入定量的蒸馏水(约为柱体积的1/5),以避免胶粒直接冲击柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.将密实洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。边搅拌凝胶,边向柱内缓慢,连续,均匀地加入凝胶,(打开柱底端的螺旋夹)不要中断,使胶粒均匀沉降,以免胶面一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部倾斜和发生断层;检查装好的凝胶柱用眼观察有无凝胶分层.沟流和气泡现象.最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。用缓冲液平衡凝胶柱,流速控制在3-5s/滴.(2)上样与洗脱：小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析法制备的球蛋白混合样品，将装有上样液的滴管头插入床面以上1-2cm处,小心缓慢地贴壁加到凝胶床表面。柱上样量控制在柱体积的2%-5%.打开下端出口，将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。(3)洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底)，按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加双缩脲2滴，出现蓝色混浊即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂l滴，以观察NH4+出现的情况。 合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。三．纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度，并用0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20％磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。四．浓缩经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ－球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定，常需浓缩。收集较浓的纯化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干胶，摇动2～3min， 3000r／min 离心5min。上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。五. 乙酸纤维素薄膜电泳鉴定ǐ-球蛋白(一)仪器与薄膜的准备1.醋酸纤维素薄膜的润洗与选择用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿中，若漂浮于液面的薄膜在15—30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以免影响电泳结果。将选好的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后，方可用于电泳。
2.电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。
3.电极槽的平衡用平衡装置(或自制平衡管)连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15——20min。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。
(二)点样
1.制备点样模板取一张干净滤纸(10×10cm)，在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。
2.点样用竹夹子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上，使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm处。点样时，先用玻璃棒或血色素吸管取2—3�0�8L血清，均匀涂在加样器上，再将点样器轻轻印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。
(三).电泳用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)，另一端平贴在阳极端支架上，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA(8片薄膜则为4.8mA)。通电10—15min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA(8片共8 mA)，电泳时间约50—80min。电泳后调节旋扭使电流为零，关闭电泳仪切断电源。
(四).染色与漂洗
1.血清蛋白染色与漂洗脱色用解剖镊子取出电泳后的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min，取出后再用漂洗液浸洗脱色，每隔10min 换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜吹干。
(五)透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不能有气泡，约2—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次，垂直放置待其自然干燥，或用吹风机冷风吹干且无酸味。再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取下，用滤纸吸干所有的水分，最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min，再用滤纸吸干液体石蜡，压平。此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。
(六)结果判断与定量血清蛋白电泳经蛋白染色后，可显示出区带，未经透明处理的电泳图谱可直接用于定量测定。可采用洗脱法或光吸收扫描法，测定各蛋白组分相对百分含

6. Western Blot实验技术全攻略之二（蛋白样品制备操作）

悬浮细胞的蛋白样品制备：直接离心收集细胞，用 PBS 等洗涤去除血清和杂质，随后裂解。操作简便，只需注意充分裂解，如有必要，可使用冰浴超声以确保裂解充分。裂解后，离心取上清进行后续蛋白浓度测定和上样前的预处理。

贴壁细胞的蛋白样品制备：吸净培养液，加入裂解液裂解。若条件允许，推荐直接裂解，以便细胞充分接触裂解液，提高裂解效率。在裂解不充分时，可考虑使用冰浴超声辅助。同样，裂解后离心取上清，进行后续步骤。

组织蛋白样品制备：首先，清洗去除血液和脂肪等非目标组织，使用 PBS 或生理盐水洗涤。对于富含血液的组织如脾脏、心脏和胎盘，需特别注意清洗血液以避免干扰。获取组织后，使用匀浆法或研磨法进行破碎，以确保充分裂解。裂解后离心取上清，进行后续处理。

操作过程中的注意事项：

• 防止降解：使用蛋白酶抑制剂、低温操作、控制样品处理量等方法减少蛋白降解风险。




• 避免杂质干扰：使用清洁器具，减少器材污染；处理核酸和脂类，使用超声处理或特定方法减少干扰。

蛋白浓度测定：使用 BCA 法或 Bradford 法测定样品浓度，确保上样量稳定可控。通过电泳、考马斯亮蓝法染胶或丽春红染色等方法，检查上样量、蛋白裂解情况及是否存在降解。

调整上样量：根据实验需求，将高浓度样品稀释或使用超滤法浓缩样品，确保每个泳道的上样量一致，提高实验结果的可靠性。