Ⅰ 蛋白纯化过程中,超滤能除咪唑吗
您好!可以的,但是超滤除的不是很干净,用分子筛干净些。
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Ⅱ 瓒呮护鍜孯O鍙嶆笚閫忓紡鍑姘存満鏈変粈涔堝樊寮傦紵
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Ⅲ 家用净水器用RO还是超滤
主要看你们那自来水的水质情况。如果水质比较差,特别是水比较硬,烧水水垢多专,那就用ro反渗透,属除杂质脱盐,出水的问题都能解决。如果水质比较软,烧水没水垢,但是可能有一般杂质或者有绿藻,水比较混浊,有腥味什么的,用超滤就可以了,脱色降浊度。
一般超滤不要电,自来水压力就能驱动,整机价格也低。反渗透需要内置泵驱动,整机价格高。
根据需要选购才合理。
Ⅳ 微滤、超滤、纳滤、反渗透有什么区别
微滤
微滤又称微孔过滤,是以多孔膜(微孔滤膜)为过滤介质。
在压力推动下,截留溶液中的砂砾、淤泥、黏土等颗粒和贾第虫、隐抱子虫、藻类和一些细菌等,而大量溶剂、小分子及少量大分子溶质都能透过膜的分离过程。
微滤技术通过机械截留作用、物理作用或吸附截留作用、架桥作用以及网络型膜的内部截留作用去除这类物质。
微滤、超滤、纳滤、反渗透比较
Ⅳ 样本前处理(三)
蛋白提取的质量控制
我们通过上一篇笔记里介绍的各种方法把蛋白质提取出来以后,这事儿还没完,因为我们需要对提取出来的蛋白进行一下质控,以确认是否成功提取出了足够的蛋白,是否有污染等。
如上图,质量控制分两个部分:
含量测定 :检测是否有充足的蛋白被提取出。注意上图里提到的不兼容问题,如果你样品里加过SDS,就不要用Bradford法来测定蛋白浓度,而可以选用BCA方法;反之,如果你样品里加入了还原剂,就不要用BCA方法来测定蛋白,可以选用Bradford法。
SDS-PAGE :检测蛋白的提取效率,以及是否有污染。比如我们上了50个样,能看到的条带却很少,说明定量不准确。如果想从几组样品中寻找差异蛋白,特别需要做一次SDS-PAGE检测同类样品蛋白的提取效率。
以上图为例,0号样品中间的条带不见了,可能是提取蛋白不充分引起的差异,也可能是样品本身的差异。我们可以重新提取一次,先排除是否是提取造成的差异;如果是样品本身的差异,建议用label free的方法,每个样品单独做定量,而不要用iTRAQ或TMT标记定量,否则会因为中间这个高丰度蛋白的影响,而导致定量不准。
我们再看来几种常见的问题,以及解决方法,如下图:
情况1:提取出来的结果差异很大。这种情况需要重新提取,以检测到底是提取不充分造成的差异,还是样品本身的差异;
情况2:左边是分子量marker,右边是实际样品,可以看到实际样品的条带很少,可能是提取不充分,需要重设提取参数,使用更剧烈的条件,更长的时间,重新提取;
情况3:横纹、纵纹比较多,很可能是核酸或脂蛋白的影响,这种情况需要进行脱盐处理,也就是利用脱盐柱与肽段结合,而与其它物质不结合,从而达到去除污染的目的。
情况4:两个条带很类似,但一条明显比另一条淡。可能造成这种情况的原因有哪些呢?第一种情况,由于这是同样类型的样品,比如都是小鼠肌肉组织,一个样品的蛋白质抽提充分,而另外一个样品蛋白抽提不充分,就会导致两条带不一样,这种情况下需要重新抽提。还有一种可能,考虑到是等量上样跑的SDS-PAGE,如果两个条带显示出的蛋白含量差别很大,则可能因为参考的含量测定结果不准确引起的,这时候需要重新定量。
脱盐
蛋白提取后,还需要做脱盐处理,我们来看看可以用哪些方法实现。
超滤: 可以截留10kDa及以上的蛋白分子,适用于体积较小的样品。操作步骤可以是,从100μL超滤浓缩到40μL,再加缓冲液至100μL,再超滤到40μL,反复几次。事实上,超滤是很难把污染(比如SDS)完全去掉的,最终仍然会有极少量的污染物存在,但当这些污染物的浓度降到一定程度时,则样品的纯净度我们认为是可以接受的了。
Tips :
样品中的尿素浓度需要控制在1M以下才能不对样品造成影响,我们提取蛋白时使用的是8M尿素,直接稀释8倍的话,造成样品体积太大,下一步加入酶后,则酶和蛋白的浓度会特别低,酶解效果受到很大影响。另外,体积太大处理起来也不方便。这时也可以使用超滤的方法,多步稀释,将尿素的浓度降到1M以下。
透析 :也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子,适用于体积比较大的样品,比如尿液,可以将盐透析至外面的透析液里。
丙醇沉淀 :-20℃丙酮(V样品:V冷丙酮=1:3以上)沉淀2个小时以上。
C18色谱柱脱盐法 :Waters公司生产的XBridge C18色谱柱,利用柱子上的填料与蛋白结合,而盐类物质则流穿过去,从而达到分离的目的。
还原烷基化及酶解
脱盐完成以后,接下来我们就要进行相当重要的一步:还原烷基化及酶解。整个流程,大伙儿看下面这张图:
这里面有两件事要先跟大伙儿聊聊。
首先,我们来说说为什么步骤里要把丙酮沉淀放在烷基化以后。通过之前的学习,我们知道丙酮可以溶解样品的去污剂、还原剂等,而蛋白是不会在丙酮中溶解的,而是会沉淀下来,这样就达到了去除杂质的目的。
烷基化以后,球状蛋白变成链状,再通过丙酮沉淀去掉尿素或SDS等污染物,然后复溶(即重新溶解,以备下一步酶解操作),那么链状的蛋白比球状蛋白的复溶效果会更好,可以避免因为复溶不充分而造成的损失。因此,丙酮沉淀要放在烷基化之后再做。
另外,关于酶切这一步,有些抗体如果只用胰酶进行酶切,由于酶切位点太少,导致切出来的肽段太长,不便于质谱检测。这种情况下可以结合其它酶,比如Lys-C,进行多酶酶切,使肽段变得短一些。经过测试我们发现,用Lys-C+胰酶酶切,比只用胰酶酶切,可以提高10%-20%的鉴定率。
酶解需要在buffer体系下完成,比如25mM碳酸氢铵体系(易挥发,pH 7-8)最为常用,或者也可以使用TEAB( triethyl ammonium bicarbonate,三乙基二乙胺盐,10-100mM)。
Tips :
如果做iTRAQ(或TMT)标记,最好用TEAB,而不是碳酸氢铵体系。因为iTRAQ(或TMT)试剂是标记末端氨基,碳酸氢铵上的氨基也会被标记上,影响蛋白的标记效率。
酶的用量可以参考以下的公式:
W(酶):W(底物)=1:20 – 1:50
此外,需要注意的是胰酶酶解的兼容性问题。胰酶只能耐受最多1M的尿素,且不能与SDS同时使用。
蛋白质及肽段的预分级
前面提过,质谱仪是一种离子饱和性仪器,高丰度蛋白的存在会对低丰度蛋白的信号产生抑制,并且质谱仪反应也需要一定的时间。例如,人的细胞内通常会表达20300种蛋白,它们酶解后,每种蛋白会产生10-20种肽段,那么就有几十万种肽段,质谱很难同时检测到这么多种肽段。所以对肽段混合物进行分级,可以降低检测的难度,得到更多的肽段/蛋白鉴定结果。
我们既可以从蛋白水平进行分离,也可以从肽段水平进行分离,还可以将多种分离手段结合起来。从蛋白水平的分离,大家都比较熟悉吧?通常我们用SDS-PAGE或IEF等技术,利用蛋白质的分子量、形状、等电点等理化性质的不同,将混合在一起的蛋白质分开。
第二种分离方案是在肽段水平上进行,根据肽段的不同性质,使用不同填料进行分离。
SCX(Strong Cation Exchange):是以硅胶为基质的强阳离子交换柱,可以与阳离子结合,并通过buffer进行离子交换,将阳离子分离和洗脱出来,达到与其它不带阳离子的肽段分离的目的。
SAX(Strong Anion Exchange):硅胶键合季铵基团的强阴离子交换柱,可以与阴离子结合,并通过buffer进行离子交换,将阴离子分离和洗脱出来,达到与其它不带阴离子的肽段分离的目的。
RPLC(Reverse Phase Liquid Chromatography):反相液相色谱柱,与正相柱在表面键合极性官能团不同,反相柱的表面键合的是非极性的官能团,例如,键合十八烷基官能团,称为C18柱,其它常用的还有C8,C4和C2等。这里我们选用C18柱,根据肽段疏水性的不同,达到分离的目的。
HILIC(Hydrophilic interaction liquid chromatography ):亲水色谱柱可以用来分离极性化合物。由于强极性肽段在反相色谱柱中保留情况都比较差,很难将它们分开,而亲水色谱柱却可以用来固定强极性的肽段,并结合高比例有机相与低比例水相组成的流动相,来实现分离的目的,且这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱(ESI-MS)的灵敏度。
High pH - Low pH RPLC:用pH10的液相条件,结合pH2的RPLC酸性条件,进行分离。
Tips :
通常,我们通过RPLC与质谱联用。因为RPLC体系是用水和乙腈,易挥发,不含盐,可以直接送入质谱进行检测。而像SCX/SAX这类正相柱,需要通过高盐的体系将样品洗脱下来,所以它与质谱不兼容。我们在做多级分离时,前面都会有各种盐的洗脱,最后才是RPLC,然后就可以直接连质谱了。
多维分离:例如,先从蛋白水平进行分离,再从肽段水平进行分离,或者多种肽段水平的分级分离结合起来使用。接下来我们重点聊一下各种多维分离的策略和效果。
我们先来看看上面这张图。左上角的“A图“展示的是通过High pH - Low pH RPLC将样品分成了40个馏分,然后进行叉开的合并,合并为20个馏分,这样的合并可以让样品中的肽段分布更加均匀。
右上角的”B图”展示的是通过SDS-PAGE进行分离,也分成20个馏分,然后用两种合并方案,分别合并为5个馏分和6个馏分,这样做的目的也是为了让样品的肽段分布更加均匀。
左下角的“C图”针对同一种样品,对High/Low pH RPLC和SDS-PAGE两种分离策略进行了比较,发现经过两种分离方法后,有5408个蛋白是都可以鉴定到的,另外有1951种蛋白是只在High/Low pH RPLC分离策略中鉴定到的,而用SDS-PAGE分离,则可以鉴定到其它389种蛋白。从这个图上看,两种方法有互补性。
右下角的四幅小图说明,当我们在做分级分离时,分的级别越多,能鉴定到的蛋白也就越多。不过这种增长并不是呈线性关系的,分级的级数达到一定程度时,能鉴定到的蛋白数量的增长就会饱和。所以比较省时省力又能保证效果的做法时,选择一个合适的分级数即可。
我们来看一下目前发表的文献里,利用多级分离所能鉴定到的蛋白数量。
一篇2013年发表在MCP上的文献报道,采用RP-RPLC两级分离,分成常规的24个馏分,上样量为100μg,在一天内能检测到8000多个蛋白。
一篇2013年发表在Nat Comm上的文献报道,先采用RP柱分级,再使用SAX分离,然后通过1米的长柱子反相色谱分离。样品为人的胚胎干细胞,上样量仍然为100μg,在线分离8天检测了9818个蛋白,如果分离时间延长到24天,则可以检测13075个蛋白。
一篇2014年发表在Nat Method上的文献报道,采用IEF(等电聚焦电泳,isoelectric focusing)与RPLC结合,样品是人的上皮癌细胞,上样量为800μg,分成了360个馏分,耗时超过15天,一共分析到13078个蛋白。
就像前面说到的,对蛋白及多肽分离的级数越多,能鉴定到的蛋白也就越多,但常常因为机时的限制,再加上这种变化趋势到一定程度总会饱和,所以我们通常有个权衡。比如常规的分10个馏分,基本上可以鉴定到5000-8000个蛋白。如果是血清样品,可以馏分更多一些,尤其是RPLC一维,如果分到40或60个馏分,再合并为10或20个馏分,比直接分成10个或20个馏分能鉴定到的蛋白要多30%左右!
Tips :
对于分馏分,通常是利用C18的色谱柱来分级分馏分,这个没有试剂盒。
Ⅵ 超滤设备和抽滤机有什么不同
理论上来是可以,但是超滤膜的孔源径很小,所以很快就会堵塞,而且会“非常”慢。如果你想抽滤的目不是节约时间,用透析袋做透析就好了,省时省力。
如果追求分离效果,推荐你用脱盐柱做层析。如果体积大,可以先浓缩。
Ⅶ 超滤膜一般有哪些材质,各有什么特点
超滤膜主要有以下几种材质:
根据的性能,超滤膜的材料可分为高分子材料和无机材料两大类。高分子材料主要有纤维素类、聚枫类、聚酰胺类、聚烯烃、含氟类等;无机材料主要有陶瓷、金属、玻璃、分子筛等。
1.纤维素类 :纤维素类膜材料是最早应用的超滤膜材料。主要包括:再生纤维素、二肼、聚酰亚胺、聚醚酰胺等。还有碳分子筛膜、不锈钢醋酸纤维素、三醋酸纤维素、混合纤维素等。
2.聚烯烃类:聚烯烃类超滤膜材料主要包括聚氯乙烯、聚丙烯腈。
3.聚砜类: 聚砜类超滤膜材料主要包括聚枫、聚醚砜、磺化聚枫、聚苯砜和聚芳砜。
4.聚酰胺类: 聚酰胺类超滤膜材料主要包括聚砜酰胺、芳香族聚酰胺、芳香聚酰胺酰。
5.含氟聚合物:含氟超滤膜材料主要包括聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯。
6.无机材料:无机超滤膜材料主要包括陶瓷材料,如氧化铝、氧化锆、氧化硅、氧化钛膜、多孔玻璃膜制备所需的碳分子筛、不锈钢粉、多孔玻璃等材料(分相法)、溶胶-凝胶法、化学气相沉积法等。无机膜具有优良的热稳定性、化学稳定性和机械性能。
超滤膜分离是一种物理的分子筛分过程,所以它具有分离物无相际间变化,无质变等优点,特别适合保持风味和热敏性物质处理。选择超滤膜性能的优劣,主要取决于膜材料和成膜工艺条件,其中,膜材料是决定膜性能的主要参数。