采用阳离子交换树脂分离核苷酸

⑴ 吸附薄层层析与分配，离子交换薄层层分析的区别

离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂 。
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将
吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
⒈离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。
⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。
洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1＝A2时为线性梯度，当A1＞A2时为凹形梯度，A1＞A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。
⒊洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
⒋离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些产品建立用0.02％叠氮钠。
⒌离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。

概念
层析是“色层分析”的简称。利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。有吸附层析、分配层析两种。一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析。
层析（chromatography）利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力。
[编辑本段]语源学
chrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为“写”。色谱为层析的同义语，都是从英语chromatography译来的。
层析（色谱） chromatograpby
在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中，使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。根据移动相种类的不同，分为液体层析、气体层析二种。用作固定相的有矽胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体，也可使用其他物质。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatogra-phy），在玻璃板上涂上一层薄而均的物质作为固定相的称为薄层层析（thin-layer chromatography），后者可与用滤纸作为固定相的纸上层析进行同样的分析，即在固定相的一端，点上微量试料，在密闭容器中，使移动相（液体）从此端渗入，移动接近另一端。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。也可采用在第一种移动相展开后再用另一移动相进行展开（这时的展开方向应与原方向垂直），使各成分分离完全的双相层析（two-dimensional chromatography）。分离后，将斑点位置的固定相切取下来，把其中含有来自试料的物质提取进行定量分析。但为制备与定量，柱层析则更为适宜。在柱层析中，移动相从加入试料的一端展开到达另一端后，继续展开使各成分和移动相一起向柱外分别溶出，这就是广泛使用的所谓洗提层析（elution chromatography）。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型（离子交换层析）等三种类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。
[编辑本段]类别
◆按层析的机理划分：
吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。
分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。
离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。
◆按流动相与固定相的不同划分：
气相层析、液相层析。这两大类层析是以流动相不同来划分的。如同时区分流动相和固定相，划分为：气固层析、气液层析、液固层析和液液层析等。
◆按操作形式划分：
柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析，纸层析是一种分配层析，柱层析可做各种层析。
[编辑本段]基本原理
层析须在两相系统间进行。一相是固定相，需支持物，是固体或液体。另一相为流动相，是液体或气体。当流动相流经固定相时，被分离物质在两相间的分配，由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡，即不断经历吸附和解吸的过程。随着流动相不断向前流动，被分离物质间出现向前移动的速率差异，由开始的单一区带逐渐分离出许多区带，这个过程叫展层。
系数K是物质在两相中的浓度比。K值大，则在固定相中吸附牢，K值小吸附差。各物质间的K值差别大，则易被分离。不同类型层析的K值含义不同，可视为吸附平衡常数，分配常数或离子交换常数等。
研究层析现象而发展的塔板理论，与有机化学实验中的分馏法原理有些相似。被分馏的有机溶剂在分馏柱内的填充物上形成许多热交换层，从而把低沸点溶剂先分馏出来，达到纯化的目的。在层析时用理论塔板数n来衡量层析效能。
tR为物质在层析柱上的保留时间，W为洗脱下来的物质峰形的宽度。n值愈大表示层析柱的效能愈高。如用理论塔板高度H表示，则包含了层析柱长度的因子。
式中L为层析柱的柱长。H值越大，则柱效越低。
此外影响层析分离效果的还有涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等因素。因此选择层析固定相支持物的粒度、均匀度等物理性能，流动相的层析系统和温度等都是做好层析的关键。
[编辑本段]几种常用的层析
◆吸附层析
吸附剂的吸附力强弱，是由能否有效地接受或供给电子，或提供和接受活泼氢来决定。被吸附物的化学结构如与吸附剂有相似的电子特性，吸附就更牢固。常用吸附剂的吸附力的强弱顺序为：活性炭、氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙、石膏、纤维素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最强。吸附剂在使用前须先用加热脱水等方法活化。大多数吸附剂遇水即钝化，因此吸附层析大多用于能溶于有机溶剂的有机化合物的分离，较少用于无机化合物。洗脱溶剂的解析能力的强弱顺序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。为了能得到较好的分离效果，常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力的溶剂系统，以获得最佳分离效果。
◆分配层析
在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等，这些亲水物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配比率不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。
◆离子交换层析
支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。带阳离子基团的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等为阳离子交换剂。带阴离子基团的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四级胺乙基）等为阴离子交换剂。离子交换层析只适用于能在水中解离的化合物，包括有机物和无机物。对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数，K值愈高，被吸附愈牢。洗脱时，增加溶液的离子强度，如改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按K值不同，分成不同的区带。
◆凝胶过滤层析
支持物是人工合成的交联高聚物，在水中膨胀后成为凝胶。凝胶内为内水层，凝胶周围的水为外水层。控制交联度以形成不同孔径的网状结构。交联度小的孔径大，交联度大的孔径小。凝胶只允许被分离物质中小于孔径的分子进入，大于孔径的分子被排斥在外水层，最先被洗脱下来。而进入孔径的分子也按分子量大小大致分离成不同的区带。选择不同规格的凝胶，可把一个混合物按分子量的差异分成不同的组分。这种方法曾被称为分子筛。目前常用的凝胶商品有：葡聚糖凝胶（sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（bio-gel）、琼脂糖凝胶（sepharose）和聚苯乙烯凝胶（styragel）等。
◆亲和层析
在一对有专一的相互作用的物质中，把其中之一联结在支持物上，用于纯化相对的另一物质。常见的亲和对如：酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体等。支持物为琼脂糖或纤维素等。
◆气相层析
属于分配层析或吸附层析，仅适用于分析分离挥发性和低挥发性物质。固定相是在惰性支持物（如磨细的耐火砖）上覆盖一层高沸点液体，如硅油、高沸点石蜡和油脂、环氧类聚合物。外涂层约为支持物重量的20％。分析时操作温度范围，一般从室温到200℃。特殊的层析柱能达到500℃。流动相常用氦、氩或氮为展层气体。气相层析分离的区带十分清晰，是由于挥发性物质在两相间能很快达到平衡，所需分析时间大为缩短，一般为数分钟至10余分钟。检测记录系统绘出的各峰是测定流出气体电阻变化的结果，因而测定样品量可到微克和毫微克水平。具有快速、灵敏和微量的优点。气相层析也能用于分离制备样品，但需增加将流出气体通过冷冻将分离物回收的装置。
◆纸层析
以滤纸为支持物的分配层析。组成滤纸的纤维素是亲水物质，能形成水相和展层溶剂的两相系统，被分离物质在两相中的分配保持平衡关系。纸层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物，可做双向层析。1944年A．J．P．马丁第一次用纸层析分析氨基酸，得到很好的分离效果，开创了近代层析的发展和应用的新局面。70年代以后，纸层析已逐渐为其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如离子交换层析、薄层层析、高效液相层析等所代替。
◆薄层层析
在玻璃片、金属箔或塑料片上铺上一层约1～2毫米的支持物，如纤维素、硅胶、离子交换剂、氧化铝或聚酰胺等，根据需要做不同类型的层析。聚酰胺薄膜是一种特异的薄层，将尼龙溶解于浓甲酸中，涂在涤纶片基上，当甲酸挥发后，在涤纶片基上形成一层多孔的薄膜，其分辨力超过了用尼龙粉铺成的薄层。薄层层析较纸层析优越在于分辨高，展层时间短。例如用纸层析做氨基酸分析，往往需要两天时间，而且对层析条件要求严格，不易得到满意的分离效果。如用薄层层析做，一般约需半小时，分离效果更好。薄层层析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制备样品。
◆高效液相层析（又名高压液相色谱）
70年代新发展的层析法。其特点是：用高压输液泵，压强最高可达5000psi（相当于34个标准大气压）。用直径约3～10微米的超细支持物装填均匀的不锈钢柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一层1～2微米的二氧化硅，经硫酰氯反应生成Si—Cl，进一步连接疏水的烷基，如Si—C18H37，或阳离子交换基团—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或阴离子交换基团—Si（CH2）nNH2。这种支持物能承受很高的压力，化学性能稳定。用不同类型支持物的HPLC，可做吸附层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。其分析微量化可达10-10克水平。但用于制备，可以纯化上克的样品。展层时间短，一般需几分钟到10余分钟。其分析速度、精确度可与气相层析媲美。HPLC适于分析分离不挥发和极性物质。而气相层析只适用于挥发性物质，两者互为补充，都是目前最为理想的层析法。HPLC配有程序控制洗脱溶剂的梯度混合仪，数据处理的积分仪和记录仪等电子系统，成为一种先进的分析仪器，在生物化学、化学、医药学和环境科学的研究中发挥了重要作用。
◆反相层析
在吸附层析中，高极性物质在层析柱上吸附较牢，洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题。如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，如甲醇和水的混合物。则被分离样品中的极性强的物质不被吸附，最先洗下来，得到较好的分离效果。这种层析法与普通的吸附层析法相反，故称为反相层析。目前用HPLC做反相层析常用的ODS柱，即在支持物的表面上连接了C18H37Si—基团。
◆同系层析
在核酸分析中，将样品经核酸酶部分裂解成不同长度的核苷酸片段，用同位素标记后，在DEAE纤维素薄层上分离，用含有未标记的相同的核苷酸片段作展层溶剂，这样，未标记的核苷酸把标记过的核苷酸推进，使按分子量大小不同把标记核苷酸片段，按由小到大的次序排列，达到分离的目的。于是把这种层析法称为同系层析。同系层析和电泳相结合曾用于寡核苷酸的顺序分析。
纸层析是层析法的一种,要了解纸层法还得从层析法开始.层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。
层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。
层析根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。其中纸层析是指以滤纸作为基质的层析。

⑵ 汪猷的人物成就

汪猷字君谋，1910年6月7日出生于杭州书香门第之家。父亲汪知非是清末秀才，年轻时深受西方科学技术和孙中山的革命思想影响，遂弃功名仕途，在浙江从事测量和盐务等工作。父母先后于1928年和1930年病故。1941年汪猷与协和医学院儿科助教李季明女士结婚，夫妻感情甚笃。
汪猷聪颖好学，从小深受父亲影响，喜爱自然科学。1921年考入浙江省立甲种工业学校（浙江大学前身之一），就读于应用化学系，从此汪猷与化学结下了不解之缘。1927年考入金陵大学工业化学系。1931年毕业，获理学士学位。由于他历年学习成绩优秀，获得斐托飞（φτφ）学会金钥匙奖的荣誉。毕业后由学校推荐到北平协和医学院作研究生后转作研究员。师从我国著名生物化学家吴宪，研究性激素的生物化学。他首先使用了问世不久的瓦堡微量呼吸器测定男性激素对正常鼠和阉鼠的各部器官的影响。在名师指点下，汪猷的研究才华脱颖而出，发表了4篇论文，深得吴宪的器重。1935年8月，汪猷作为中国生理学会代表团成员与吴宪等参加了在莫斯科举行的第十五届国际生理学大会。这是汪猷第一次去国外参加大型国际学术会议。他见到了不少仰慕已久的国际生理、生化界大师，如巴甫洛夫和胰岛素发现者班丁（F．G．Banting）等。这使他下决心奋发图强，日后希跻身于国际著名学者之列。大会结束后，汪猷赴德国慕尼黑大学化学研究所，在著名化学家、诺贝尔奖获得者维兰德（H．Wieland）指导下当研究生。
在维兰德及其助手唐纳（E．Dane）指导下，汪猷从事不饱和胆酸和甾醇的合成研究。找到了甾环内引进共轭双烯的改进方法，合成了胆甾双烯酮和胆甾双烯醇。1937年冬，汪猷获慕尼黑大学最优科学博士学位。1938年秋，他又去海德堡威廉皇家科学院医学研究院化学研究所任客籍研究员。在著名化学家、诺贝尔奖金获得者库恩（R．Kuhn）指导下进行藏红素化学的研究。合成了十四乙酰藏红素。这是当时分子量最大的有机化合物。在国内外名师和著名学术机构的优良学风的薰陶和严格训练下，汪猷养成了严肃、严谨的学风和勇于创新的精神，这对他以后的事业产生了深远的影响。
1939年春，汪猷离开德国转赴英国。在伦敦密特瑟克斯医学院考陶尔生化研究所陶慈（E．C．Dodds）的研究室任客籍研究员，从事雌性激素类似物的化学合成研究。当时欧洲战云密布，我国正遭受日本法西斯铁蹄的蹂躏。怀着振兴祖国科学事业的强烈愿望，汪猷毅然放弃国外优越的研究条件和物质生活，于1939年8月回国。在协和医学院先后任讲师、助教授等职。除讲课外，他的大部分时间继续在吴宪指导下从事甾族性激素的化学研究，包括孕妇尿中甾三醇葡萄糖苷排泄量的测定和中药当归有效成分及药理作用研究等。他在与妇产科医生合作的一项研究中发现了怀双胞胎的孕妇尿中甾二醇葡萄糖排泄量特别高。珍珠港事变之后，日本侵略军于1942年1月占领协和医学院，研究设备、资料和研究记录、样品全被日本侵略军搜掠一空。教授、医生、学生都被迫离开实验室，离开医学院。
中国抗生素事业的开拓者
1942年4月，汪猷进入上海丙康药厂，担任厂长和研究室主任。这是一家小药厂，主要生产针剂、止咳润喉糖之类。当时上海沦陷、视听闭塞。1944年他偶然获悉国外发现了一种从霉菌里培养出来的抗生素，激起了他对新学科的研究渴望。他刻苦学习微生物学、发酵等方面的知识，决心在中国开拓抗生素研究的道路。汪猷对霉烂的桔子表面的烂毛发生了兴趣。经过几年研究试验，克服种种困难，终于分离得到了一种抗菌物质桔霉素。1947年汪猷的论文“桔霉素”发表于美国《科学》杂志。国内“大公报”等报纸报道了他研究成功桔霉素的消息。美国一家通讯社也做了报道。但是汪猷的才华和研究成果并未得到药厂厂主的赏识，汪猷于1947年8月愤然离开丙康药厂。
1947年9月汪猷借用中央研究院医学研究所筹备处的两间原病理和尸体解剖实验室，同两位自愿从丙康药厂退职跟随他的助手继续进行桔霉素的研究。当时他本人没有工资和报酬，汪猷一家的生活十分拮据，但他对清贫甘之如饴，刻苦努力，埋头研究。在助手的合作下，桔霉素的化学及其抗菌作用的研究未曾中断。后得到林可胜、冯德培的支持被聘为医学研究所筹备处的研究员。这一时期汪猷发表了“抗生素桔霉素”、“双氢桔霉素”、“桔霉素及其衍生物的结构和抗菌活力”等6篇论文。中华人民共和国建立后，成立了中国科学院，汪猷被聘为中国科学院生理生化研究所研究员。1952年底调入有机化学研究所任研究员并担任副所长。由于党和政府十分重视科学研究事业的发展，使他得以对桔霉素的结构、合成、生物作用、毒性和药理等方面进行系统的研究，终于取得了丰硕的成果。发表了“桔霉素”、“桔霉素骈醇”等10余篇论文。虽然由于桔霉素的毒性，未能用于临床，但是40年代汪猷在如此简陋、困难的条件下，对桔霉素开始了系统的研究，成为中国抗生素研究的开拓者。他的这一研究成果获得中国科学院1956年度科学奖金三等奖。 50年代是抗生素研究的鼎盛时期。随着医疗保健事业的发展，迫切需要大力开展抗生素的研究。汪猷是积极的倡导者和组织者。1952年汪猷在中国科学院领导下曾参加组织召开我国首次抗生素工作会议。以后又参加组织了上海抗生素研究工作委员会和全国抗生素研究工作委员会。1955年在北京主持了国际性的抗生素学术会议。这些活动都为推动我国抗生素的研究和生产起到了一定的作用。与此同时，他与合作者于1953年开始研究链霉素及金霉素的分离、提纯以及结构和合成化学。曾发表“有关链霉素菌株的选育、发酵及提取的研究”、“自L－双氢链糖酸内脂合成L－双氢链糖”、“金霉素的抗生作用机制”等近10篇论文。他和助手们在50年代即合成了几种性能优良的阳离子交换树脂，用于提取发酵液中链霉素与碱性抗生素。他们大胆地提出用离子交换树脂法代替当时使用的活性炭的分离工艺，并多次深入生产现场，指导和帮助解决生产工艺问题，汪猷不仅重视生产中的实际应用课题，也不忽视学科中的基础理论研究。他和同事们在研究链霉素的立体化学中纠正了美国著名碳水化合物专家、链霉素结构的测定者沃尔弗浪姆（M．L．Walfrom）等提出的链双糖胺β苷键的结论，确证为α苷键。这项成果被选入上海1960年科研成果论文集。
中国生物有机化学的先驱者之一
中华人民共和国成立后，由于国家对科学事业的重视，大为激发了汪猷对振兴祖国科学事业的热情，他的研究生涯进入了黄金时期。60年代开始，汪猷先后开展了生命基础物质——蛋白质、核酸、多糖的研究以及有机催化、生物催化、石油发酵和单细胞蛋白生产，模拟酶化学，生物合成等研究。他的研究活动几乎包括了这一时期我国生物有机化学的全部内容。这些研究都以出色的成果载入了我国有机化学发展史册。
1965年9月，我国在世界上首次人工合成了结晶牛胰岛素，它是第一个全合成的、与天然产物性质完全相同的、有生物活性的蛋白质。胰岛素的分子组成和结构是1955年英国科学家桑格尔（F．Sanger）阐明的。虽然此后各国科学家都开展了胰岛素人工合成的探索，但由于胰岛素结构复杂、合成工作量繁复浩大，直到1958年英国《自然》杂志还断言“人工合成胰岛素在相当长时间里未必会实现。”可是，在这场世界性的科学竞赛中，中国科学家领先了，我国得到了人工合成的结晶的牛胰岛素。这一举世瞩目的成果博得了国际科学界的高度评价。结晶牛胰岛素的全合成是由中国科学院生物化学研究所、上海有机化学研究所和北京大学部分科学家合作进行的。王应睐、汪猷、邢其毅等负责领导组织这项研究工作。汪猷还直接参加了牛胰岛素A链和C14标记的牛胰岛素的全合成等研究项目。对合成方案、产物的鉴定分析标准都提出了明确具体的要求。汪猷与合作者发表了“肽的研究”、“结晶牛胰岛素的全合成”、“牛胰岛素A链的合成及其与天然B链组合成结晶牛胰岛素”、“C14标记牛胰岛素A链和C14标记牛胰岛素的合成”等论文。胰岛素合成成功，推动了我国多肽激素医药工业的建立和生化试剂工业的发展。
自1968年开始至1981年完成的酵母丙氨酸转移核糖核酸的全合成是继胰岛素全合成以后我国自然科学基础研究中又一成就，是我国生物化学及有机化学研究史上又一项崭新的科研成果，也是汪猷科研生涯中耀眼的篇章。1967年4月在北京由当时国家科委主任聂荣臻元帅主持召开有关基础理论研究的座谈会上，汪猷首先提出把核酸化学提到日程上来，作为下一步的攻坚目标。这一建议得到了与会科学家的赞同和聂荣臻元帅的支持。经过酝酿与调查，1968年中国科学院正式下达任务，把“人工合成酵母丙氨酸转移核糖核酸”列为重大科研项目，组织了中国科学院上海生物化学研究所、上海细胞研究所、上海有机化学研究所、生物物理研究所、北京大学、上海化学试剂二厂等单位，前后100余位科技人员从事这项研究。酵母丙氨酸转移核糖核酸分子量在2．6万道尔顿以上，是由76个核苷酸（其中有4种常见的核苷酸、7种修饰的核苷酸）通过磷酸二酯键连接而成的生物大分子。汪猷是协作组副组长，他和协作组组长王应睐及协作组领导成员王德宝等对这项高难度研究进行精心规划。经过13年的艰苦奋战，终于在1981年11月完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的全合成。这是世界上第一个人工合成的含有全部修饰核糖核苷酸的并具有接受丙氨酸、参与蛋白质生物合成等生物活性的丙氨酸转移核糖核酸。这项研究使我国在生命基础物质的研究上步入了新的阶段，且为国家培养了一支从事核酸化学和核酸生物化学的研究队伍。为我国的基因工程、核酸的工业生产、核苷类抗癌药物的研究与生产奠定了基础。汪猷与合作者发表了“酵母丙氨酸转移核糖核酸的全合成”、“核酸化学研究”、“酵母丙氨酸转移核糖核酸3′－半分子（36—76）的合成”、“生物学上有趣的天然大分子的合成研究”、“多核苷酸合成的研究”等多篇论文。汪猷还在国际核酸化学会议、中德核酸蛋白质学术讨论会及中美天然产物化学讨论会上做了学术报告。尽管他工作繁忙，但对此项工作的指导十分具体、细致。他提出并成功地将羧酰咪唑应用于核糖核酸的酰化反应，使核酸化学合成中单体的保护方法的研究获得了进展。随后他又应用31P核磁共振和计算机技术进行羧酰咪唑酰化机制和反应动力学的研究并取得了成果，发表了“在寡聚核糖核苷酸合成中偏磷酸酯在TPS或DCC激活核苷酸的反应中的作用”、“N苯甲酰咪唑与核糖核苷酸的反应机制”、“用31PNMR法研究核糖核酸酶A水解核酸的机制”等论文。
在进行酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工合成研究的同时，汪猷还承担了另一项重大科研项目——天花粉蛋白的化学研究。天花粉是我国特有的引产中药，宋代已有记载。1966年底有机化学研究所的科研人员开始从事这方面研究。1972年汪猷在国家科委的一次科研规划会议上，建议将天花粉的研究列为中国科学院重点课题。他认为这项基础理论研究，既有重大的学术意义，又有明确的应用前景。自1978年开始，汪猷参加和直接指导了对天花粉有效成分天花粉蛋白的一级结构的测定，并与协作单位共同完成了二级结构与空间结构的初步测定。这是完全由我国化学家和物理化学家完成分离、提纯并测定一级及空间结构的第一个蛋白质。当汪猷将这一研究成果在1985年国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）药用天然产物有机化学讨论会上演讲时，受到与会科学家的热烈欢迎和高度评价。他曾与合作者发表了“天花粉的科学评价—历史，化学与应用”等多篇论文，并主编了《天花粉蛋白》一书。 汪猷在多糖化学研究方面也有建树，最突出的成就是与屠传忠等共同研制成功高效、安全的新型代血浆（即血管扩张剂）——羧甲基糖淀粉。这是我国独创的代血浆，和国际上广泛应用的代血浆——右旋糖苷比较效果相同，但具有原料易得、工艺简便等优点，已在临床上广泛应用。1979年英国《自然》杂志有一篇评论高分子代血浆的文章中曾提及中国有不少成果是“重复西方专利资料”，但这项成果则是“原始的”（首创性的）。外国学者到上海有机化学所参观时，至今仍对这个项目很感兴趣。值得一提的是，当初代血浆问世后，需进行健康人安全试验，汪猷是志愿受试的首批报名者之一。
60年代初，汪猷提出开展有机催化和生物催化的基础研究。汪猷和王大琛从事的生物催化研究，迅速取得了成果并显露了应用前景——石油微生物转化。汪猷敏锐地意识到这项研究对国民经济尤其是对农牧业的重要意义，遂不失时机地把这项研究转向应用基础研究，把实验室研究成果扩大到中试和设计试生产，组织协调各项应用试验。汪猷是我国石油发酵生产单细胞蛋白研究的开创者。曾发表“石蜡油微生物氧化产物支链九烷酸和十二烷酸研究的初步报告”、“石蜡油微生物氧化产物羟基羟酸研究的初步报告”、“分枝杆菌石蜡油发酵液中的支链脂肪酸”等论文。汪猷还在1973年维也纳联合国工业发展组织会议和1981年巴黎单细胞蛋白国际会议上分别宣读了“关于石油蛋白作为新饲料的若干问题”和“中国正构烷烃酵母作为食物的进一步研究”等论文。石油发酵生产的单细胞蛋白作为饲料的研究已通过国家鉴定。 汪猷在50年代后期负责并如期完成了国家急需的二个活性染料的剖析任务。在60年代负责完成了对高感光度高空侦察片中片基和增感染料剖析的军工任务。1985年以来，汪猷领导开展了抗疟药青嵩有效成分青嵩素的生物合成研究。发表了论文“青嵩素的二维核磁共振研究”、“青嵩素的生物合成研究”、“青嵩素和青嵩素B生物合成中的关键中间体——青蒿酸”。1986年，在蛋白质化学和核酸化学研究的基础上，汪猷组织人力开展了模拟酸化学的研究，已发表“具有合成核酸活性的多肽I．C－端去四肽和去六肽核糖核酸酶A及其水解和合成活性”等5篇论文。 汪猷的学术成就在国内外学术界享有很高的声誉，受到了国家的嘉奖。其中有二项获国家自然科学一等奖：人工全合成牛胰岛素（1982年7月）及酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成（1988年8月）；一项获国家自然科学二等奖：天花粉蛋白的化学（1988年8月）；一项获中国科学院自然科学三等奖（1956年1月）；以及多项全国科学大会奖（1978年）。
在半个多世纪的研究生涯中，汪猷始终站在有机化学发展的前沿，在生命基础物质的研究以及其他天然产物化学的研究方面取得多项成就，为我国有机化学的发展做出贡献。
为中国有机化学事业的发展再做贡献
汪猷是我国有机化学家的杰出代表。这不仅由于他在有机化学研究工作中取得重大成就，还由于几十年来他为国家培养、组织了一支训练有素、学有所成，能承担重大科研课题的队伍，建设了有机化学研究基地。自1952年汪猷被调入中科院上海有机化学研究所后，相继任副所长、代理所长、所长、名誉所长。他把全部精力倾注于有机化学研究所的成长和发展。毕生追求就是振兴中国的有机化学事业，进而推向世界先进水平之列。
汪猷根据我国有机化学研究的实际状况和有机化学发展的规律提出有机化学研究所体制、专业设置的“二经二纬二辅助”的方针，二经是有机合成化学和物理有机化学；二纬是天然有机化学和元素及金属有机化学；二辅助是配合全所研究工作，建立分析化学实验室和生物化学实验室。随着电子计算机技术的迅速发展，1973年汪猷又及时提出建立计算机化学实验室。有机化学所有着雄厚的有机合成研究力量，但70年代前没有一个专门的研究室从事物理有机化学的研究。1973年汪猷提出建立物理有机化学研究室，请擅长物理有机化学的蒋锡?出任室主任，组织从事有机化学中理论问题的研究。从研究所的体制上保证了基础研究的比例。汪猷在执长有机化学所的数十年间，带领全所人员积极承担国家下达的应用研究课题的同时，鼓励科研人员勇于进取，努力开展基础性研究，勇于开拓新学科、新领域。汪猷先后主持领导了近10项基础性研究课题，他也亲自参加和组织了多项重大应用性课题，甚至是任务性研究。近40年来，有机化学研究所在基础研究和应用研究方面都取得了丰硕成果，共发表研究论文2600多篇，获得研究成果达300项。这些成就正是研究所稳定、健康发展的证明。
汪猷十分重视人才的培养。作为主管业务的所长，他深知建设一支具有真才实学、勇于探索的精兵强将对于科学事业的重要性，50年代开始，汪猷亲自主持制订全所科研人员的业务学习计划，使他们较快地掌握了最新的有机化学基础理论、分离技术、立体化学、谱学等知识。他还多次亲自为本所专业外语及文献阅读辅导班、有机化学微量操作短训班、有机化学实验班、德文训练班授课。1955年起招收研究生，至1965年汪猷共培养研究生7名，还培养了一批在职科技人员。汪猷注重培养学生的独立工作能力、扎实的基础知识和认真、严谨的研究风尚。1978年后，汪猷是国务院和中国科学院学位委员会委员，并亲自负责指导研究所的研究生培养工作。80年代末，他不顾自己古稀高龄，两次去新疆、一次去云南考察，指导边远地区的科学事业，为当地有关研究所的研究方向、人才培养、仪器保养等作详细指导，帮助他们解决一些研究上的难题。如新疆化学所在天然有机化学方面力量比较薄弱，在汪猷的支持下，有机化学研究所派出周维善、林国强赴疆进行短期工作培训。汪猷还亲自代培了一名维吾尔族女进修生，还为新疆化学所代培研究生。蛋白质的结构分析在我国曾较薄弱，汪猷结合天花粉蛋白一级结构的测定研究课题，于1980年邀请西德B·维特曼·利博特（B．Wittmann－Liebold）和亨辛·埃特曼（A．Henschen－Edman）这二位蛋白质结构化学家到有机化学研究所举办蛋白微量顺序测定讲习班。后由该所再办学习班，把这一新技术推广到全国许多单位，为提高我国在这一领域的测试水平做出了贡献，受到了好评。
改革开放以来，汪猷积极为研究所的业务骨干的出国进修、留学创造条件。他根据研究所的专业设置方向、学科发展趋向，有计划有重点地派遣科研人员，让他们到国外学习先进的科学技术，回国报效祖国。
汪猷受中国化学会委托担任《化学学报》主编达24年。由于他的不懈努力，学报由复刊时的季刊发展为双月刊，进而为月刊，篇幅也不断增加。并且于1983年创办了《化学学报》的英文版，使国际化学界能及时了解中国同行的研究进展。
汪猷积极为中国与国际学术界的交流和友谊做了许多有益的工作。他是1955年北京抗生素国际会议、1979年中国一前联邦德国蛋白质和核酸学术讨论会、1980年中美天然产物化学会议的主持人之一。他组织并主持有来自五大洲33个国家和地区的400余名科学家参加的1985年国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）上海药用天然产物有机化学讨论会，其学术水平和组织工作均受到与会科学家的高度评价。50年代以来，他曾到比利时、荷兰、英国、奥地利、捷克、民主德国、联邦德国、古巴、澳大利亚、罗马尼亚、法国、瑞士、瑞典、美国、苏联、日本、香港等国家和地区进行参观访问、考察、讲学和参加国际学术会议。与许多国际著名科学家建立并保持着友好的往来和密切的联系。汪猷的学术成就受到国外同行的赞誉。他被聘为国际著名的有机化学杂志《四面体》、《四面体通讯》的顾问编委（1982—至今），《四面体计算机化学》和《四面体不对称合成》的顾问编委（1989—至今）以及《核酸研究》编委（1982—至今）。1984年他被列入美国马尔基（Marquis）第七版名人录，1984年3月当选为法兰西科学院外籍院士，1986年当选为美国生物化学与分子生物学学会名誉会员。1987年11月慕尼黑大学按德国传统为获得博士学位50年并取得了突出成就的汪猷举行了重发博士学位文凭的隆重仪式。这是一种极高的荣誉。1988年他又当选为德国巴伐利亚科学院通讯院士。1990年在他80岁时，《四面体》以其第46卷第9期作为献给汪猷80寿诞的专刊，辑录了海内外著名有机化学家专门为他撰写的学术论文。其中包括美、法、英、德、日、瑞士、香港等地著名有机化学家，这是国际化学界对汪猷的学术成就所给予的殊荣。
求索不息严以律己
汪猷有着为祖国科学事业彻底献身的精神，多少年来，他总是早起晚睡，每天都工作到深夜．科学研究就是他的全部生活．他已发表论文100余篇，获奖成果近10项。半个世纪以来，他始终站在学科发展的前列，勇敢地迎接挑战性的难题。30年代他研究甾体，40年代研究抗生素，以后是合成胰岛素和核糖核酸。他对“无涯之知”的求索从未停息。多少次他与同行或学生探讨甚至争论一些科学命题。他反对停滞的观点，勇于进取。因此当胰岛素合成后，他思索在深化蛋白质化学所取得成果的同时，开展另一重要的生命基础物质——核酸化学的研究。经过国内有关科学家的集思广益，形成了“人工合成酵母丙氨酸转移核糖核酸”的课题。历经13年，前后上百人的艰苦研究，核酸合成的任务完成了。在欢庆这一成就时，汪猷发表了“无涯之知，世代之功”（《红旗》1982年第4期）的文章。告诫他的同事、助手和学生“学无止境”，不要满足于已得之功，揭开自然科学的奥秘需要世世代代不懈地努力。汪猷身体力行，尽管当时他已过古稀之年，仍壮心不已，继续去攻克新的科学堡垒，1985年和1986年他组织人力开展了两项国内尚属空白和尚无系统研究的重要学科；生物合成和模拟酶化学，至今已陆续发表多篇论文，取得了可喜结果。
汪猷对研究工作刻意求新、求精的精神是他治学态度的又一特点。他大胆、积极地采用新方法、新技术。在他主管有机化学研究所期间，非常重视大型仪器设备的配置和更新。我国第一台用于有机化学研究的红外光谱仪和核磁共振仪都率先建立于该所。他总是在自己的研究工作中积极应用新技术。从事抗生素研究时，他率先采用当时还属先进的技术，如离子交换、层析和电泳等。在胰岛素、核酸和模拟酶的研究中，他将同位素技术、核磁共振、计算机等先进技术及时用于检测、动态跟踪、机理研究等。他首次应用计算机拟合方法于天花粉的结构测定，取得了可喜的结果。凡是汪猷直接负责的研究课题，从路线设计、合成方法、分析手段、数据处理直到撰写论文，他都亲自指导，严格把关，一丝不苟。胰岛素的全合成曾开过二次鉴定会。在1965年底的第一次成果鉴定会上，参加会议的大多数专家对研究结果都表示满意，但汪猷作为这项成果的主要负责者之一，带头发难，指出胰岛素的合成虽然基本完成，但数据不够充足，应再补充一些必要的数据再进行鉴定。他的这种严谨求实的学风受到与会者的赞赏，使几个月后召开的第二次鉴定会取得圆满成功。
汪猷爱护青年，提携后学。1984年他主动退出了所、室领导岗位，放手让中青年化学家去挑担子。他说：“中青年思想敏捷、精力充沛，以中青年更新老年，必然有利于科学技术的开创和发展。当然老的科技工作者有更成熟的经验，更丰富广博的学识、见闻、思虑，但体力日衰、反映渐钝的自然规律是不可抗拒的。老科学工作者应该主动地、有意识地、实事求是地培养青年接班人。”他的行动给该所的老同志起了表率作用，推动了该所体制改革的步伐。
汪猷博闻强记。他能熟练使用英、德两种语言，能阅读法、俄、日文献，谙熟中外科学史中的典故、轶事，他常借这些故事教诲他的助手和学生，指点成才之路。 汪猷酷爱写诗，藉以叙情记事、抒怀言志。
汪猷为人正直，品德高尚，言行一致，身体力行，宽以待人，严以律己，绝不谋一己私利。“文化大革命”中汪猷被诬陷，身处逆境，仍坚持原则，拒不承认强加于他的罪名，也丝毫不说假话。他默默地忍受着“文化大革命”遗留下的巨大创伤，并不鸣冤叫屈。在他复任上海有机化学研究所所长后，他一如既往，宽厚待人，从不计较私怨。粉碎“四人帮”之后，组织上着手解决一部分高研人员的住房问题，有一套较理想的房子，组织上打算让汪猷搬进去，汪猷婉言相谢说：“我的住房已经可以了，我年纪已大，也住不了多长时间，还是给别的同志。”他把较好的住房让给了另一位高研。
汪猷克己奉公、公私分明。他每年的外事活动、学术交流、外出开会频繁。凡是私人用车、复印资料坚持自己付款，外事活动中凡以个人名义请客送礼或邮寄年历等费用，从不向公家报销。相反，出国访问或参加国际会议，他尽可能地节约伙食、交通费用，把省下来的钱包括在国外作学术讲演所得酬金为研究所添置打字机、幻灯机，购买急需的试剂等等。实行奖金制度以来，无论是论文稿费、研究成果的奖金、月度奖、年终奖等等，他都分文不受。甚至连《化学学报》的主编费、审稿费也统统交给编辑部。他认为他所有的成果都是依靠大家的努力，功劳是大家的。 近几年来，汪猷曾推荐多人出国，为研究所的业务骨干创造了许多留学、进修的条件。但他却从未为自己学化学的女儿写过一封推荐信，没有为她提供出国机会。当有人问他为什么不安排自己的女儿出国时，他回答：“出国学习要靠自己的努力去争取，如果我先给她联系，那在研究所里我还怎么执行好国家的政策！”汪猷就是这样一位严以律己、不谋私利的优秀学者。
汪猷于1961年加入中国共产党。他热爱党，维护党的威信，拥护社会主义。他党性强，时时以共产党员的高标准严格要求自己。自1959年至1987年，他曾被选为第二、三、五、六届全国人民代表大会的代表。1986年汪猷被评为上海市优秀党员。他的一言一行，严格地履行着他入党时立下的誓言“我决心争取做一个光荣的中国共产党党员，忠实的马列主义信徒和实践者，党的革命事业的先锋。”

⑶ 离子交换层析中流出物质顺序是什么

若用离子交换层析分离物质，以蛋白质为例，离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。

由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

(3)采用阳离子交换树脂分离核苷酸扩展阅读：

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。

溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。

梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

⑷ 高效液相色谱常用什么色谱法

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。
2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法 采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法 反相色谱法
固定相极性 高～中 中～低
流动相极性 低～中 中～高
组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出

从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。
3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。
缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。
离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。
分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。
分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。
离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。
5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

色谱法的基本原理
利用样品混合物中各组分理、化性质的差异，各组分程度不同的分配到互不相溶的两相中。当两相相对运动时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果使混合物得到分离。
两相中，固定不动的一相称固定相；移动的一相称流动相。
分类：
根据流动相分—以气体作流动相—气相色谱——固定相为液体 气-液色谱
固定相为固体 气-固色谱
—以液体作流动相—液相色谱——固定相为液体 液-液色谱
固定相为固体 液-固色谱
—当流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体时——超临界色谱

根据固定相的附着方式
—固定相装在圆柱管中—柱色谱
—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄膜色谱（平板色谱）
—液体固定相涂在纸上—纸色谱（平板色谱）

根据分离机理
—分配色谱—样品组分的分配系数不同
—吸附色谱— 样品组分对固定相表面吸附力不同
—体积排阻色谱—利用固定相孔径不同，把样品组分按分子大小分开
—离子交换色谱—不同离子与固定相商相反电荷间的作用力大小不同

根据极性
—流动相极性＞固定相极性-反相色谱
—流动相极性＜固定相极性-正相色谱

气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。所以，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱。

一、吸附色谱（adsorption chromatography）
又叫液固色谱法：流动相是液体，固定相是固体。

分离原理：固定相是固体吸附剂，吸附剂是多孔性微粒物质表面有吸附中心。样品组分与流动相竞争吸附中 心。各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留时间不同和实现分离。

固定相： 固定相通常是强极性的硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂。活性硅胶最常用。

流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
应用： 对于极性，结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的 分离。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。

二、分配色谱
原理： 固定液机械的吸附在惰性载体上，样品分子依据他们在流动相和固定相间的溶解度不同，分别进入两相分配而实现分离。
固定相：将一种极性或非极性固定液吸附在惰性固相载体上。如全多孔微粒硅胶吸附剂。
根据极性不同分类：正相分配色谱—固定相载体上涂布的是极性固定液；
流动相是非极性溶剂；
可分立极性较强的水溶性样品；
弱极性组分先洗脱出来。

反相分配色谱—固定相载体上涂布的是非极性或弱极性固定液；
流动相是极性溶剂；
强极性组分先洗脱出来。
液-液分配色谱固定相中的固定液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，且不能进行梯度洗脱，已经不大为人们所采用。

三、键合相色谱

考虑分配色谱法中固定液的缺点，因此将各种不同的有机关能团通过化学反应共价结合到固定相惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。
键合固定相优点：○ 对极性有机溶剂有良好的化学稳定性
○使色谱柱的柱效高、寿命长
○实验重现性好
○几乎适于各种类相的有机化合物的分离，尤其是k’宽范围的样品
○可以梯度洗脱
根据极性不同分类：正相键合相色谱—固定相极性＞流动相极性
固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。
适于分离脂荣、水溶性的极性、强极性化合物

反相键合相色谱—固定相极性＜流动相极性
固定相：烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS柱或C18柱就 是最典型的代表，其极性很小。
适于分离非机性、弱极性离子型样品，
是当今液相色谱的最主要分离模式。
正相HPLC（normal phase HPLC）：
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。

反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流动相是甲醇和乙腈。

四、体积排阻色谱（SEC，size exclusion chromatograghy）
（又称凝胶色谱和分子筛色谱）
原理： 以多孔凝胶（如葡萄糖，琼脂糖，硅胶，聚丙烯酰胺等）作固定相，依据样品分子量大小达到分离目 的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞， 在柱中被强滞留，后被洗脱。

根据样品性质分类：凝胶过滤（GFC）—用于分析水溶性样品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖。
凝胶渗透（GPC）—用于分析脂溶性样品，如测定高聚物的分子量。

SEC主要依据分子量大小进行分离，因此与样品、流动相间的相互作用无关。因此不采用改变流动相的组成来改善分离度。

五、离子交换色谱
（ion exchange chromatography, IEC）
分离原理：使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离；带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离