① 请教常用的细胞筛选的方法~~
应该是流式细胞仪了 这个东西很管用
以下是部分内容 其实去网络一搜就好了
流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。
流式细胞计可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。
在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。
在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。
荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。
减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。
样品分选原理
流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。
稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约距约数百μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度，d为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选+150V，或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十ms。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。可根据具体要求予以适当调整。
（50）数据处理原理：FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。
①数据显示：FCM的数据显示方式包括单参数直方图、二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。
直方图是一维数据用昨最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，横座标可以是线性标度或对数标度，用“道数”来表示,实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵座标一般表示的是细胞的相对数。图10-2给出的是直方图形式。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。
二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横座标和纵座标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应座标植的细胞存在（图10-3）。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于二个一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维座标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。
图10-2 直方图 图10-3 二维点图
二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。图10-4给出了二维等高图的样式。
假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐座标—细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节 ，这无疑是有助于对数据进行分析的。图10-5为假三维图的示意图。
图10-4 二维等高图 图10-5 假三维图
列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。可用ListMode中的特殊技术，开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。例如，“一调二”就是在一维图上调出二维图来；“二调一”就是从二维图中调出一维图来。图10-6给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示意图。
图10-6 从二维图设窗调出直方图示意
上面简要地介绍了几种数据显示形式，在实际应用中，可根据需要选择匹配，以便了解和获得尽可能多的有用信息。
②数据分析：数据分析的方法总的可分为参数方法和非参数方法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型技术时则多使用参数方法。数学模型可以是一个方程或方程组，方程的参数产生所需要的信息来自所测的数据。例如在测定老鼠精子的DNA含量时，可以获取细胞频数的尖锐波形分布。如果采用正态分布函数来描述这些数据，则参数即为面积、平均值和标准偏差。方程的数据拟合则通常使用最小二乘法。而非参数分析法对测量得到的分布形状不需要做任何假设，即采用无设定参数分析法。分析程序可以很简单，只需要直观观测频数分布；也可能很复杂，要对两个或多个直方图逐道地进行比较。
逐点描图（或用手工，或用描图仪、计算机系统）是大家常用的数据分析的重要手段。我们常可以用来了解数据的特性、寻找那些不曾预料的特异征兆、选择统计分析的模型、显示最终结果等。事实上，不经过先对数据进行直观观察分析就决不应该对这批数据进行数值分析。从这一点来看，非参数分析是参数分析的基础。
逐道比较工作量较大，但用直观法很容易发现明显的差异，特别是对照组和测试组。考虑到FCM的可靠性，要注意到对每组测量，都要有对照组，对照组可以是空白对照组、阴性对照组、或零时刻对照组等，具体设置应根据整体实验要求而定。对照组和测试组的逐道比较往往可以减少许多不必要的误差和错误解释。顺便指出，进行比较时对曲线的总细胞数进行归一化处理，甚至对两条曲线逐道相减而得到“差结果曲线”往往是适宜的。
因为数据分析往往和结果解释关系十分密切，也就是说和生物学背景相关，因此具体的分析法和原理将在后面结合实例再介绍。
② 求免疫荧光DHE染色具体步骤和细胞流式的具体步骤
细胞免疫荧光的详细操作步骤1，取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心。2，4%多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。3，0.2%TritonX100通透10分钟，PBS洗三遍。4，与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。5.，一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。6，二抗室温2小时，或者37度1半小时，PBS洗三遍。7，最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。8，蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周。
③ 干细胞磁珠分选和流式分选的区别
应管理员要求，我来比较一下流式分选和磁珠分选的优缺点，本来想列一个表，但表格可能表述不清楚，还是用通俗的语言写啊，个人体会欢迎拍砖。
简单说一下原理：
现在流式分选一般都是电荷式分选，即对感兴趣的目标细胞所在的液滴充上电荷，液滴经过电极板，通过电场作用发生偏转，从而实现分选。
磁珠分选首先使用磁珠偶联的抗体去标记细胞，然后把标记好的细胞过柱子（柱子周围连磁铁），带磁珠的细胞就留在柱子上，不带磁珠的细胞就流走了，从而实现分选。
现在可以比较不同了：
1、对细胞的刺激。 我觉得磁珠分选最大的优势就是对细胞的刺激要小一点。因为流式分选细胞首先要经过几十微米的喷嘴，然后要被充电，还要经过几千伏的电场，最后以几十米每秒的速度落到收集管里面，有些原代细胞就受不了，分选免疫细胞也要考虑细胞活化的影响；而磁珠分选相对来说就对细胞没什么刺激。
2、设备要求。 磁珠分选小的实验室就能做，买一些专用的磁铁和柱子就可以了，而流式分选就需要分选型的流式细胞仪，都是几百万以上的。对操作员的要求来说，流式分选也要高一点，需要专门培训，需要注意的细节也要多很多。
当然如果你周围有什么流式平台的话，磁珠分选和流式分选的成本应该是差不多的，流式分选一次大约1-2千（各地方不同），磁珠分选的柱子磁珠差不多也要烧这么多钱。
3、试剂不同。 这个最好理解，流式分选用的是荧光素偶联的抗体，磁珠分选用的是磁珠结合的抗体。
下面就要说下流式分选的优势了：
4、分选纯度。这个肯定是流式分选的纯度高，磁珠分选如果操作好的话也能达到80-90%的纯度，但流式分选一般都能达到90％以上（样本制备和仪器条件正常的条件下）。
5、多参数分选。流式细胞术很大的优势就是多参数，比如我可以分选CD4+CD25+CD127low的Treg，三色的一次就能分选。磁珠分选就必须先分CD4，再分CD25，更多参数的就没法进行。
6、低表达群细胞分选。比如有些干细胞它的表达比例只有百分之零点几，比例太少磁珠分选无法操作，流式就可以把这些细胞富集起来。
7、胞内荧光分选。流式分选在分子生物学中很大一部分应用就是分选GFP、YFP等阳性细胞，还有可以用Hoechst染精子的单倍体进行分选，这些针对胞内成分的分选也是磁珠分选无法实现的。
另外要说明的是，现在都很流行磁珠分选和流式分选相结合的方法，像上面举的例子分选CD4+CD25+CD127low的Treg，如果仅用流式分选可能时间太长，纯度也有影响。那么可以选择先用磁珠纯化出CD4阳性的细胞，再过流式分选CD4+CD25+CD127low的群体，这样既节省了时间保证了活性，也可以提高分选的纯度。