lgg离子交换柱层析

⑴ 单克隆抗体的纯化技术操作步骤

从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体，不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。如果用于免疫标记测定，须分离和纯化。可用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀，进行初步浓缩和纯化；可用亲和层析法进一步纯化。

一、腹水型单抗的纯化

在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。

1、二氧化硅吸附法

新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。

2、过滤离心法

用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。

3、混合法

即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。

二、单抗的粗提

1、硫酸铵沉淀法

（1）饱和硫酸铵溶液的配制

500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8。

（2）盐析

吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。

（3）脱盐

常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。将盐析样品装入透析袋中，对50-100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析（4℃）12-24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂（碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20% NaOH 50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。

（4）蛋白质含量的测定

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数；或（Pr）=OD280×稀释倍数/1.3

（5）分装冻存备用

2、辛酸-硫酸铵沉淀法

该法简单易行，适合于提纯IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。其主要步骤如下：取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调PH至4.8；按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤（125um），加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调PH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。

3、优球蛋白沉淀法

该法适用于IgG3和IgM型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变，对IgG3单抗的回收率高于90%，对IgM单抗的回收率为40-90%不等。其操作步骤如下：取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的浓度分别达0.2mol/L和25mmol/L，随之可见纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，滤液对100倍体积的去离子水透析，4℃ 8-15小时（若是IgG3单抗，也可室温2小时），其间换水1-2次；取出后22000g离心30分钟，弃上清；将沉淀溶于PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重复上述的透析与离心；将沉淀的优球蛋白浓度调至5-10mg/ml，分装冻存备用。

三、单抗纯化的方法

单抗纯化的方法有很多种，应根据具体单抗的特性和实验条件选择适宜的方法，常用的技术有DEAE离子交换层析柱、凝胶过滤法和亲和层析法三种。

1、离子交换层析：

分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素(CM纤维素) 和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来

2、凝胶过滤法：

一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时，大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小，小分子则在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。

缺点：从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度(即洗脱体积的大小)并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径，利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时，标准蛋白质(已知分子量和斯笃克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)，否则不能得到比较准确的分子量。分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。而且柱子成本比较高，整个实验过程耗时很长。

3、免疫亲和层析法：

是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低。

用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析法则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。

⑵ 层析为几大类各自的特点和用途是什么

亲和层析介质
Ni-琼脂糖凝胶 FF 主要用于分离组氨酸标记（His-Tag）的基因工程蛋白质的分离纯化。

谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 FF 主要用于谷胱甘肽转移酶标记蛋白（GST融合蛋白）、谷胱甘肽转移酶和谷胱甘肽依赖蛋白的分离纯化。
辛巴蓝-琼脂糖凝胶 FF 主要用于各种以NADH或NADPH做辅酶的酶类（如脱氢酶）、血清白蛋白、干扰素、凝血酶、凝血因子等蛋白质和多肽的分离纯化。
肝素-琼脂糖凝胶 FF 主要用于抗凝血酶Ⅲ、凝血因子、脂蛋白、脂酶和多糖的分离纯化。
蛋白A-琼脂糖凝胶 FF 主要用于各种抗体、单克隆抗体的亲和分离纯化。
刀豆蛋白A-琼脂糖凝胶 FF 主要用于各种糖、糖蛋白、糖脂和带甘露糖、葡萄糖残基的IgM等的分离纯化。
小麦凝集素-琼脂糖凝胶 FF 主要用于各种糖、糖蛋白、糖脂、带N-乙酰葡糖胺残基的各种蛋白等的分离纯化。
巯基乙醇-琼脂糖凝胶 FF 主要用于抗体等具有亲硫作用的蛋白质的分离纯化。
IgG-琼脂糖凝胶 FF 适用于纯化蛋白A、蛋白G等和抗体结合的蛋白、蛋白A和蛋白G融合蛋白。
赖氨酸-琼脂糖凝胶 FF 适用于纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白酶原激活剂及核糖蛋白体核酸的分离纯化。
组氨酸-琼脂糖凝胶 FF 适用于抗体等富含共轭氨基酸残基的蛋白质、多肽的分离纯化。
DNA-琼脂糖凝胶 FF 适用于与DNA相结合的DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA酶、核酸外切酶等的分离纯化。
去内毒素琼脂糖凝胶 FF 适用于药物剂型中细菌内毒素的去除。
Ni-陶瓷/琼脂糖凝胶 主要用于分离组氨酸标记（His-Tag）的基因工程蛋白质的分离纯化。
谷胱甘肽-陶瓷/琼脂糖凝胶 主要用于谷胱甘肽转移酶标记蛋白（GST融合蛋白）、谷胱甘肽转移酶和谷胱甘肽依赖蛋白的分离纯化。
辛巴蓝-陶瓷/琼脂糖凝胶 主要用于各种以NADH或NADPH做辅酶的酶类（如脱氢酶）、血清白蛋白、干扰素、凝血酶、凝血因子等蛋白质和多肽的分离纯化。
肝素-陶瓷/琼脂糖凝胶 主要用于抗凝血酶Ⅲ、凝血因子、脂蛋白、脂酶和多糖的分离纯化。
蛋白A-陶瓷/琼脂糖凝胶 主要用于各种抗体、单克隆抗体的亲和分离纯化。
刀豆蛋白A-陶瓷/琼脂糖凝胶 主要用于各种糖、糖蛋白、糖脂和带甘露糖、葡萄糖残基的IgM等的分离纯化。
小麦凝集素-陶瓷/琼脂糖凝胶 主要用于各种糖、糖蛋白、糖脂、带N-乙酰葡糖胺残基的各种蛋白等的分离纯化。
巯基乙醇-陶瓷/琼脂糖凝胶 主要适用于抗体等具有亲硫作用的蛋白质的分离纯化。
IgG-陶瓷琼脂糖凝胶 适用于纯化蛋白A、蛋白G等和抗体结合的蛋白、蛋白A和蛋白G融合蛋白。
赖氨酸-陶瓷/琼脂糖凝胶 适用于纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白酶原激活剂及核糖蛋白体核酸的分离纯化。
组氨酸-陶瓷/琼脂糖凝胶 适用于抗体等富含共轭氨基酸残基的蛋白质、多肽的分离纯化。
DNA-陶瓷/琼脂糖凝胶 适用于与DNA相结合的DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA酶、核酸外切酶等的分离纯化。
去内毒素陶瓷/琼脂糖凝胶 适用于药物剂型中细菌内毒素的去除。