运用离子交换法分离纯化溶菌酶的优缺点

❶ 蛋白质的分离方法有哪些它们各依据蛋白质的什么性质或特点

（一）水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH
范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
二、蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex
ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT
FACE="宋体"
LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity
chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
细胞的破碎
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。
4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
浓缩、干燥及保存
一、样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩
空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法
生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法
通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法
超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo
超滤膜的分子量截留值：
膜名称分子量截留值孔的大的平均直径
XM－300300，000140
XM－200100，00055
XM－5050，00030
PM－30 30，00022
UM－2020，00018
PM－1010，00015
UM－21，00012
UM05500 10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。
二、干燥
生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。
三、贮存
生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。
1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。
2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。

❷ 离子交换树脂到底是什么技术干嘛用的 请详解

离子交换树脂是一种传统的水处理工艺，其中水中的各种阴离子和阳离子被阴回离子交换树脂和答阳离子交换树脂所取代。
阴离子和阳离子交换树脂可以分别或按不同比例形成离子交换正床系统、离子交换负床系统和离子交换混合床系统，并且通常使用混合床系统。
反渗透等水处理工艺是用来生产超纯水、高纯水的终端工艺，它是用来制备超纯水的一种不可替代的手段。其出水电导率可低于0.2μS/cm以下，出水电阻率达到5MΩ.cm以上，根据不同的水质及使用要求，出水电阻率可控制在5~18MΩ.cm之间。
被广泛应用在食品行业、医药行业、工业超纯水、医药超纯水、高纯水等领域上。

❸ 生化药物制备过程中需要注意哪几个方面

国内在生化药物的研究方面存在较多的问题，主要表现在以下几个方面：1、对原材料没有进行严格的控制;2、无病毒灭活的工艺步骤;3、质量研究内容不够全面等。致使审评人员难以把握其质量，且产生了更多的安全性担忧。
一、生化药物的制备方法生化制药就是将动物、植物或微生物机体内的生物活性物质在其结构和功能不遭破坏的前提下，采用多种生化分离的方法提取、纯化的工艺过程。生化制药的六个阶段：1、原料的选择和预处理;2、组织及细胞的破碎;3、从破碎的细胞中提取有效成分制成粗品;4、采用多种生化技术从粗品中将目的物精制出来;5、干燥及保存;6、制剂。以上各阶段在不同的生化药物制备中，根据所选材料的不同，可灵活取舍选择使用。
生化药物的分离纯化方法主要有五类：1、根据分子大小和形状不同进行分离，如凝胶过滤法、透析和超滤法、密度梯度离心法等;2、根据分子的带电性质进行分离，如离子交换层析法、电泳法、等电聚焦法;3、根据分子极性大小及溶解度不同进行分离，如等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、逆流分配法等;4、根据配体特异性进行分离，如亲和层析法;5、根据物质吸附性质不同进行分离，如选择性吸附和吸附层析法。
二、生化药物质量控制研究要点生化药物复杂多样，在此仅针对脏器提取的多组分生化药物进行讨论，其它生化药物可参考。
(一)、脏器生化药物脏器生化药是指从动物来源的生化药物，即从动物的组织、器官、腺体、体液、分泌物以及胎盘、毛、皮、角和蹄甲等提取的药物。脏器生化药物中多数有效成分不明确，多属高分子物质，现在多数还不能用合成的方法生产，有的物质还需要有同时存在的其它物质的协同作用才能发挥较好的生理功能。主要的脏器生化药物1、
组织和器官来源大脑：胆固醇、脑磷脂、卵磷脂、P-物质和多种脑啡肽等;丘脑：生长激素释放因子和生长激素抑制因子等;心脏和动脉管：细胞色素C、辅酶Q10和辅酶A等;肝脏：核糖核酸、肝注射液、肝提取物、肝水解物和辅酶A等;肺脏：抑肽酶等;脾脏：脾注射液、肝-脾提取物和脱氧核苷酸钠注射液等;胃：胃膜素和胃蛋白酶等;肠及肠粘膜：P-物质、肝素和其它肝素(低分子肝素)等;眼：眼生素和眼宁等全眼提取物;骨：硫酸软骨素、硫酸软骨素A、骨肽注射液和蛋白胨等;皮：明胶和阿胶等;2、
腺体来源脑垂体：促皮质素、促卵泡激素、促黄体生成激素、生长激素、促乳激素、催产素、加压素和垂体前叶激素等;胰腺：胰岛素、胰高血糖素、胰蛋白酶、糜蛋白酶、结晶糜胰蛋白酶、胰酶、蛋白酶抑制剂、激肽释放酶(血管舒缓素)、弹性酶(弹性蛋白酶)、胶原酶、胰类肝素等;唾液腺：唾液腺素等;颌下腺：激肽释放酶等;腮腺：腮腺素等;甲状腺：降钙素、甲状腺素和干燥甲状腺提取物等;胸腺：胸腺素(胸腺肽)、胸腺生成素Ⅰ、Ⅱ和胸腺体液因子等;肾上腺：肾上腺皮质激素等;甲状旁腺：甲状旁腺素等;卵巢：松弛肽和子宫松弛因子等;睾丸：透明质酸酶等;松果体：松果体激素等;3、
体液和分泌物来源血液：组氨酸、赖氨酸、精氨酸和水解蛋白等;胆汁：人工牛黄、去氢胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸钠、胆黄素等;尿：尿激酶和绒毛膜激素等;4、
其他来源胎盘：胎盘提取物、胎盘球蛋白和白蛋白等;毛：胱氨酸、半胱氨酸、赖氨酸和精氨酸等;角和蹄甲：羚羊角、犀角代用品和妇乐宁等;蛋：溶菌酶等。
(二)、脏器生化药物的研究和质量控制要点因动物的来源复杂(包括动物的种属、健康状况、饲养环境、年龄、采集时间、采集方法等)，提取纯化工艺简单，其有效成分的含量和比例会产生较大的差异，因此，单靠质量标准不能全面控制产品的质量，而需要控制源头和工艺过程，再结合质量标准才能较有效地控制产品的质量，确保临床应用的安全性和有效性。换句话说，生化药物的质量控制重点就是要保证生产产品与临床研究样品质量一致，这种质量的一致性单凭质量标准中的质量控制指标不能全面地反映出来(这一点不同于化学药物)，必须通过严格地控制源头和工艺过程来实现，这一点类似于生物制品。1、脏器生化药物研究的一般过程研究脏器生化药物首先要固定源头(原材料)，包括动物的种属、健康状况、饲养环境(封闭饲养)、年龄、采集时间和采集方法等，并制订原材料的质量标准。然后研究合适的提取纯化方法，包括动物源性病毒的灭活和验证，确定原液(或半成品)的生产工艺;研究原液(或半成品)中的主要成分、含量、主成分的比例，以及其它成分的控制方法等，制订原液(或半成品)的质量标准。进行制剂的处方工艺研究，最后制成临床应用的制剂(成品)，并进行相应的质量研究，制订成品的质量标准。2、动物源性病毒的灭活工艺及验证因组织来源动物的种类不同，其自然携带或者感染病毒的种类也会有所不同，再加上目前动物来源的原材料可控性较差，故必须要对动物源性病毒进行灭活或去除，并对灭活或去除工艺进行验证。灭活或去除动物源性病毒，首先要了解选定动物的病毒情况，重点关注已确认对人类具有感染和致病能力的病毒(例如牛和猪的口蹄疫病毒，猪的乙型脑炎病毒等)及已有试验提示与人类疾病具有关联性的病毒(例如牛腹泻病毒，猪的戊肝病毒等)，了解病毒的生物学和对理化因素敏感性等方面的特性。检验原材料中病毒的污染程度和负载量，为采取相应的处理工艺提供研究数据。如果已知原材料中污染了对人感染或者致病的病毒，或者检出了内源性逆转录病毒、具有种属特异性的其它污染病毒，则必须废弃该原材料并妥善处理。(1)病毒的检测方法病毒的检测方法主要有体外法(采用不同种属的多种敏感细胞系进行共培养检测，在适宜的培养时间点取样检测感染性病毒，至少应盲传3代)、体内法(在没有可靠的体外试验方法时，可采用适宜的动物进行接种盲传试验，采用敏感的方法检测感染性病毒)、动物抗体产生试验(对尚没有合适的体内和体外试验方法检测的病毒，可采用不同动物观察种特异病毒的抗体产生情况，抗体产生试验特别有助于检出啮齿类动物病毒)、其他方法(电镜、ELISA、PCR、RT方法等)。病毒的检测方法应结合品种的特点和具体生产情况，综合分析后进行设计和选择，通常应有合理的依据和支持性资料。(2)病毒灭活/去除工艺尽量设计与实际生产工艺相关的及合理的病毒灭活/去除研究试验方案，尤其是特定的生产工艺步骤，模拟的工艺在试验参数及控制条件方面应与实际工艺严格保持一致。也就是说模拟的生产工艺应当尽可能代表实际生产工艺的情况;如果产生了不可避免的偏差，应对试验结果可能产生的影响给予合理的解释。有关病毒灭活/去除的技术方法，可参见《血液制品病毒去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》。(3)病毒灭活/去除工艺验证研究病毒灭活/去除工艺验证研究的目的是要获取充足的试验研究数据，以证明生产工艺中包含有效的病毒灭活/去除工艺步骤。其基本原则是生产工艺必须包含有效的病毒灭活/去除工艺步骤，若生产工艺无有效的灭活/去除病毒的作用，应根据产品的不同，在生产工艺过程中增加特定的病毒灭活/去除步骤。对脏器生化药物应包含两种机制上能够互补的有效工艺步骤。经过多年的实践，已经获得普遍认可的作法是将已知量的指示用活病毒，加入到模拟的原液或者不同生产工艺阶段的中间产品中，然后定量测定经特定工艺步骤或技术方法处理后病毒滴度下降的幅度，据此评价工艺灭活/去除病毒的效果。一般验证采用普通指示病毒，试验结果用于说明工艺步骤对一般病毒的灭活/去除能力，在适宜的范围内能够代表对同类病毒相似的清除能力;特定验证采用特定病毒(已发现的污染病毒)或者与特定病毒相似的病毒作为替代，试验结果用于说明工艺步骤对特定病毒的灭活/去除能力，生产工艺必须具有足够的清除该病毒的能力。因为特定病毒与一般病毒在理化因素敏感性、病毒结构特点、病毒颗粒大小及其它方面有差异，因此，普通指示病毒与特定病毒或特定病毒相似的病毒不具备可比性和一致性，难以互相替代。(4)指示病毒的选择指示病毒选择的原则：指示病毒应具有代表性和合理性，可用于正确评价生产工艺的病毒安全性。选择指示病毒应考虑的几个方面：1)根据生产过程中污染病毒的来源、污染环节和程度、致病性质和特点，以及其它应考虑的各种实际因素，同时结合能够用于评价验证效果的指示病毒的可获得性与相关培养试验条件，尽可能地选择具有一般代表性和特定模拟意义的多种指示病毒。2)尽可能选择可培养到高滴度的病毒;并应有可靠、有效的检测方法。3)应当考虑指示病毒可能对操作人员形成的健康危害，并采取必要的防护措施;必须注意指示病毒本身的安全性，应遵守国家有关的管理规定，属于烈性传染病毒不能使用。4)在选择普通指示病毒或/和特定指示病毒时，至少都应当包括RNA和DNA病毒、脂包膜和非脂包膜病毒。5)以生物组织原材料或组织原材料匀浆中可能出现的病毒为核心，综合考虑生产工艺、污染病毒及灭活/去除技术方法本身等各方面的特点进行选择。(5)病毒灭活/去除有效工艺步骤的评价首先要有病毒灭活/去除验证的试验资料，并证实在生产工艺过程中某特定步骤能够有效地灭活/去除病毒。对于可能起作用的每个步骤都应进行必要的评价，明确是否具有确切的病毒灭活/去除作用，并确定有效的工艺步骤。在有效的病毒灭活/去除工艺步骤后，不得进行可能引入新污染(如添加动物来源的材料)的操作(除非证明该操作完全排除病毒污染的可能性)，严格防止再污染的发生。一般将病毒感染性滴度减少4log以上的处理步骤认可为有效的病毒灭活/去除工艺步骤。但如果检测方法的最低检测限为103TCID50，即使病毒起始滴度为106TCID50，经处理后未检出病毒，也不宜算作特定的有效工艺步骤，因为处理后病毒的实际滴度有可能大于102TCID50，因此只能根据检测方法的灵敏度表示为未检出。病毒感染量的降低可以从病毒颗粒清除的量或病毒被灭活的情况两方面来评价。可能的情况下，应明确病毒滴度的下降是物理清除还是直接灭活。(6)病毒安全性的追踪观察由于检测方法、监测时间及灵敏性等各种因素的影响，临床前研究中即使动物试验，甚至是灵长类动物试验结果为阴性，也难以完全排除人类感染潜在污染病毒的风险(如潜伏期长的病毒、致病过程缓慢的病毒、感染特异性检测指标未知的病毒等)。因为不同阶段，人们对病毒危害的认识深入程度和全面性等不同，可提供的试验研究支持性资料及侧重点也有所不同;所以对动物来源的生化药物，不论是在临床研究的过程中，还是上市后均应进行必要的病毒安全性追踪观察。具体方法：针对可能污染的病毒，注意观察并设立病毒感染的评价指标。包括已知对原材料来源动物有致病性的病毒，在体内、体外试验中能够感染人类组织细胞的病毒，特别是隐性感染的病毒等;通过血清学或培养分离等临床检测，发现和验证在生产过程中未能发现的新病毒及感染特征。采用的检测方法应能够鉴别出人与动物病毒的区别，并经过验证确保方法的敏感性和特异性。在临床研究方案中应有对可疑致病病毒的检测实施方案，包括：急性感染、慢性感染、常规筛查临床隐性感染和血清阳转情况，以及用药前后检测结果的对比。通过主动检测和被动检测及时发现无症状隐性感染患者，避免在人群中可能发生的大规模播散。由于许多未知的和不确定因素的存在，最终确定污染病毒的致病性仍需要进行大量的基础研究和临床验证工作，因此，使用动物来源产品的患者，应该知道：经过病毒安全性控制的产品，虽然已经将感染病毒的风险减小到极低的程度，但并不能完全排除这种风险。3、脏器生化药物的质量控制要点根据脏器生化药物研究的一般过程，其质量控制要点主要分以下三个方面：1)固定源头(原材料)，包括动物的种属、健康状况、饲养环境(封闭饲养)、年龄、采集时间和采集方法等，并制订原材料的质量标准。2)研究合适的提取纯化方法，包括动物源性病毒的灭活和验证，确定原液(或半成品)的生产工艺;研究原液(或半成品)中的主要成分、含量、主成分的比例，以及其它成分的控制方法等，制订原液(或半成品)的质量标准。3)进行制剂的处方工艺研究，制成临床应用的制剂(成品)，并进行相应的质量研究，制订成品的质量标准。总之，脏器生化药物质量控制的核心就是全程控制(从源头到终产品，工艺过程控制和质量标准控制)。
三、生化药物研究应注意的问题因生化药物的来源复杂，不同的原材料和生产工艺得到的产品的质量会有差异，包括主要成分的含量、比例，以及其它成分的种类和/或含量等，而这些差异往往质量标准反映不出来，从严格意义上说，生化药物没有仿制。所以，在进行生化药物研究时首先要基于“不可仿制”来考虑问题。1、注重原材料和工艺过程控制，结合质量标准，较全面地控制产品的质量。2、产品上市后不要轻易更换原材料、变更生产工艺、改换剂型(尤其是水针、粉针、大输液互换)、延长有效期等。如果需要进行以上变更，应针对变更情况对产品的质量、安全性和有效性的影响(这种影响是指产品的真实质量，并不只是质量标准中的质量控制指标)进行相应的研究工作，包括药学、药理毒理和临床研究。3、因为生化药物的质量是靠全程控制来保证，其原液(或半成品)应不可以自由销售，否则不仅增大了流通环节再次染菌的可能性，又不利于成品全程的质量控制。4、动物源性病毒的灭活工艺及验证是一个需要研发者、审评人员，以及有关方面的专家共同研究和探讨的课题。因为人们对动物源性病毒的认识，以及动物源性病毒与人类感染性疾病的关系的认识是在逐步地深入，对病毒的灭活和工艺验证也会随着人们认识的提高而不断地趋于更科学和合理。以上简要介绍了生化药物的一般制备方法、工艺过程和质量研究，以及在研究过程中应注意的问题，目的是使研发者进一步了解生化药物的特性和质量控制要点，在进行生化药物研究时重视源头控制和工艺过程控制，建立生化药物全程控制的理念，尤其是在产品上市后，如果补充申请进行某些变更时，需要针对变更对产品的质量、安全性和有效性的影响进行相应的药学、药理毒理和临床研究.

❹ 怎样分离纯化酶

这是一门很深的学问，除了需要高科技还需要科研专用设备，只是简介，希望对你有帮助，不要上当受骗：

酶的分离纯化方法简介
生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。

酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍：
一、预处理及固液分离技术
1.细胞破碎（cell disruption）
高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。要达到90%以上的细胞破碎率，起码要将菌悬液通过均质器两次。最好是提高操作压力，减少操作次数。但有人报道，当操作压力达到175Mpa时，破碎率可达100%。当压力超过70Mpa时，细胞破碎率上升较为缓慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。丝状菌会堵塞均质器的阀门，尤其高浓度菌体时更是如此。在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。
容菌酶处理法：蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。具体做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化钠溶液中，使细胞浓度为5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清处理20min，得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去，再将乙醇浓度提高到75%（体积分数），可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500g。
2.离心
离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型，所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔，壁上有过滤介质，一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离，如发酵液中的菌体，用盐析法或有机溶剂处理过的蛋白质等。分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差别的乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。
在生物领域采用的离心机系统，除了应具备离心机的一般要求外，还应满足生物生产的技术要求，这包括灭菌、冷却、密封，以保证产品不受污染并不污染环境。现代哦离心机装置包括以下三个步骤，并进行程序控制：离心、离心系统的灭菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司离心机产品的装置，具有双重轴向密封，密封由装在转筒主轴上下的碳化硅动环和固定环组成，密封由水连续冷却和润滑，可防止产品被污染，也可防止生产过程中排出的废物对环境的污染。该离心机又如一个密闭的压力容器，可在121℃温度下进行蒸汽灭菌，该离心设备设有环绕离心机转筒的冷却夹套，对悬浮液和浓缩的固体都能进行充分的冷却，并能有效地控制温度，这对于生物制品是非常重要的。如BTPX205型离心机可用于细胞收集、培养液的净化和细胞碎片的分离，可用于疫苗、酶制剂等的提取。该机的其他辅助系统及控制系统也较为完善，如设有压力指示器、力量计、温度传感器和液面传感器。
3.膜分离技术
在蛋白质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。在静压作用下降溶液通过孔径非常小的滤膜，使溶液中分子量较小的溶质透过薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在一起而组成的。功能膜决定了膜的孔径，而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。超滤浓缩的优点是：操作条件温和，无相变化，对生物活性物质没有破坏。
超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成，料液经泵打入超滤器，水及低分子量物质排出超滤器外，被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器中循环。当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一步处理的浓缩料液。
超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问题：第一，在超滤循环过程中，由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用，料液的温度会逐渐升高，会造成蛋白质分子的损失。因此，料液贮罐应加冷却系统，并安装自动测温及控制系统。第二，某些酶的辅助因子散失为问题：一些酶含有辅助因子，其分子量小，超滤时易从透过液中排除掉，因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因子。
还可将超滤与亲和层析相结合以提高分离纯度。其工作原理是：当溶液中欲被分离的蛋白质不受阻碍地通过超滤膜的孔隙时，如果在膜的一侧结合着亲和配基，该蛋白质就会与配基结合因而结聚在膜的这一侧。不与配基结合的其他物质就将穿过孔而被带走。再用适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下来，洗脱液用于进一步的分离纯化。
4.泡沫分离
原理：将气体通入含多种组分的溶液中，由于这些组分的表面活性由差异，因此在溶液的表面，某些组分将形成泡沫，泡沫的稳定性取决于操作条件及溶液的生物学特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的组分种类及其含量与溶液中的不相同。这样，溶液中的组分舅得以分离。
蛋白质较易吸附与气液界面，这有利于其结构的稳定。泡沫分离过程是：蛋白质从主体溶液中扩散到气液界面，该过程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子发生重排，一般认为在空气-水界面会形成两种类型的膜，一种是稀膜，另一种是浓膜，可能会发生由多个分子聚集在一起的现象。在气液界面形成的蛋白质膜可以是单层的也可以是多层的。膜的类型取决于主体溶液及气液界面上蛋白质的特性、结构和浓度。
泡沫分离的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白质的浓度/最初溶液中蛋白质浓度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白质的提取率/最初的蛋白质质量），或使多组分混合物中某一组分的分配系数最大。

二、抽提
沉淀
1. 盐析
常用的盐析剂是硫酸铵，其溶解度大、价格便宜。硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强，其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来。对酶没有破坏作用。
pH的控制：应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑，在酶等电点时其溶解度最小易沉淀，但有些酶再等电点时稳定性较差，因此要选择最佳pH值.一般要求在酶最稳定的pH值的前提下再考虑最适宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦确定最佳pH值后，在添加硫酸铵之前甲酸或碱调节好酶液的pH值，要尽量避免溶液pH值的波动以免破坏酶的稳定性。在添加硫酸铵时要注意搅拌，并注意硫酸铵的加入速度，一般是由少到多，缓慢加入，硫酸铵尽可能磨成细粉。
温度的控制：有些酶在较高温度下稳定性能较好，可在常温下进行盐析操作，而对于大多数酶，尽可能在低温下操作。
酶液的净置：加完硫酸铵后，酶液要静置一段时间，使酶蛋白完全沉淀下来，酶静置后，就不要再加以搅拌。
2．有机溶剂沉淀
有机溶剂选择：可用于酶蛋白沉淀的有机溶剂包括醇类物质等，如甲醇、乙醇、异丙醇。乙醇的亲水性能较好，可防止蛋白质的变性，酶蛋白在其中的溶解度也较低。
有机溶剂沉淀操作：有机溶剂一般都使蛋白质变性，当温度较高时变性蛋白质分子就会变成永久失活。因此用有机溶剂处理时最好在0℃以下进行。用有机溶剂沉淀得到的酶蛋白不要放置过久，要尽快加水溶解。
3.聚合物絮凝剂沉淀
聚合物絮凝剂，如葡聚糖和聚乙二醇，与酶分子争夺水分子，具有脱水作用使酶沉淀。聚乙二醇作为一种沉淀剂的优点是在水溶液中，其浓度可达到50%，浓度为6%-12%的蛋白质大都可以沉淀下来。这种试剂不需要低温操作，而且对蛋白质的稳定还有一定的保护作用。聚乙二醇不会被吸附，故在离子交换吸附前不必去除。
4．用金属离子和络合物沉淀
酶和其他蛋白质都会形成金属盐，其溶解度较低。用金属离子沉淀的缺点是酶与金属离子相互作用后，可逆变化较差，尤其是用巯基衍生物，它结合的]金属离子会催化酶变性而失活。
5．用特殊试剂沉淀法
用链霉素可选择性去除核酸，从而使胞内酶沉淀出来。链霉素盐（浓度为0.5-1.0mg/mg蛋白质）对于选择性沉淀核酸的效果比锰离子还要好，酶不易失活。
6．亲和沉淀
将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量、地选择性有机结合形成了亲和沉淀技术。将配基与可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物，该复合物与生物分子结合后在一定条件下可以沉淀出来。
配基-载体复合物可以选择性地与蛋白质结合，溶液中的pH值、离子强度及蛋白质浓度等条件对亲和结合的影响力并不大，只有竞争性的配基会降低产物与原配基的亲和结合力，甚至使亲和结合发生逆转。
引导产生沉淀的方法有：离子交联；加入带相反电荷的聚合物；加入带相反电荷的疏水基团；改变pH值，诱导产生疏水沉淀；温度诱导产生沉淀。
亲和结合：将亲和配基加入到含有目的物蛋白质的溶液中，调节好有关沉淀的条件，使之有利于亲和结合。
洗涤：为经过处理的粗制液中发生亲和沉淀可能会发生非特异性结合，尤其是使用带电的聚合物，离子交换的效应将使其他蛋白质共同沉淀，因此在分离目的物之前要洗涤沉淀物。其做法是：加入适当的清洗剂重新溶解沉淀，再沉淀；或在专一性洗脱之前，彻底清洗沉淀。在上述过程中要始终保持目的蛋白质与配基处于亲和结合状态。
配基-载体复合物与目的蛋白质的分离：分离结束之后，要确保回收目的蛋白质和配基-载体复合物，目的蛋白质要达到一定的纯度，回收率要高。

❺ 酶、细胞、原生质体固定化

酶的一些不足之处：
（1）酶的稳定性较差
（2）酶的一次性使用
（3）产物的分离纯化较困难
◆改善方法之一就是固定化技术的应用:
(1)固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有增加稳定性，可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著优点。
(2)固定化细胞是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。也称为固定化活细胞或固定化增值细胞。通常只能用于胞外酶等胞外产物的生产。
(3) 固定化原生质体技术，有利于胞内物质的分泌。
1. 酶固定化
◆采用各种方法，将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。
◆固定在载体上的菌体或菌体碎片称为固定化菌体，它是固定化酶的一种形式。
1.1酶的固定化方法
固定化的方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等。
(1)吸附法：
◆利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。
◆物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
◆靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。
(2)包埋法
◆将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
◆包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。
◆包埋法制备固定化酶或固定化菌体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。
◇凝胶包埋法：凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。
常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
◇半透膜包埋法：半透膜包埋法是将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。
常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。
(3)结合法
◆选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
◆根据酶与载体结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。
◇离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。
离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
◇共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。
共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。
酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。
◇要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。
◇使载体活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。
(4)交联法
◆借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
◆常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。
(5)热处理法
◆将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。◆热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。
1.2固定化酶的特性
(1)稳定性:固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。
(2)最适温度: 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。
(3)最适pH值: 酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。
◆影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。
(4)底物特异性: 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。对于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化。
◆固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。
1.3固定化酶的应用
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有如下显著的优点：
（1）酶的稳定性增加，减少温度、pH值、有机溶剂和其他外界因素对酶的活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活力。
（2）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。
（3）固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。
固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。

2.细胞固定化
◆通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。(固定化活细胞或固定化增殖细胞)
◆微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞。
2.1细胞固定化的方法
◆主要可分为吸附法和包埋法两大类方法。
(1)吸附法
◆利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法。
◆用于细胞固定化的吸附剂主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。
(2) 包埋法
◆将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。
◆包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。
◇以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内而使细胞固定化的方法称为凝胶包埋法。
○凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。
○凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。
2.2微生物细胞固定化
2.2.1固定化微生物细胞的特点：
①固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好。
②固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。
③发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间。
④固定化微生物细胞密度提高，可以提高产率。
⑤提高工程菌的质粒稳定性，
2.2.2固定化微生物细胞的应用
◆主要用在两个方面：
◇是利用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产物。
◇二是利用固定化微生物细胞与各种电极结合制成微生物电极。
(1)利用固定化微生物生产各种产物
(2)固定化微生物细胞制造微生物传感器
2.3植物细胞固定化
2.3.1固定化植物细胞的特点：
（1）植物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可减轻剪切力和其他外界因素对植物细胞的影响，提高植物细胞的存活率和稳定性。
（2）细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团。
（3）固定化植物细胞发酵可以简便地在不同地培养阶段更换不同的培养液，即首先在生长培养基中生长增殖，在达到一定的细胞密度后，改换成发酵培养基，以利于生产各种所需的次级代谢物。
（4）固定化植物细胞可反复使用或连续使用较长的一段时间，大大缩短生产周期，提高产率。
（5）固定化植物细胞易于与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产品质量。
2.3.2 植物细胞固定化的方法：
◆植物细胞固定化的方法主要有吸附法和包埋法两种。
◆吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内，或者将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。
◆包埋法是将植物细胞包埋在琼脂、角叉菜胶、海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明胶等多孔凝胶之中。包埋方法与微生物细胞包埋时基本相同。
2.3.3固定化植物细胞的应用：
◆固定化植物细胞的主要用途是制造人工种子，就有可能获得大量具有相同遗传特性的植株。对种质的保存具有重要意义。并可以节约种子的用量。
◆固定化植物细胞还可以用于生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢物。
2.4动物细胞固定化
2.4.2固定化动物细胞的特点：
（1）提高细胞存活率：动物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可以减轻或免受剪切力的影响，同时动物细胞可附着在载体表面生长，从而可显著提高动物细胞的存活率。
（2）提高产率：动物细胞固定化后，可先在生长培养基中生长繁殖，使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度。然后可简便地改换成发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长期转变到生产期，以利于提高产率。
（3）固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间。例如，中国仓鼠卵巢细胞（CHO）生产人干扰素可以稳定地生产30天。
（4）固定化细胞易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量。
2.4.2动物细胞固定化方法：
◆动物细胞固定化地方法有吸附法和包埋法两种。
(1)吸附法：
◆大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面。故此吸附法特别适合于动物细胞的固定化。
◆转瓶是由玻璃或塑料制成，表面经过一定方法处理而带上电荷。
◆微载体是指颗粒细小的固定化载体，直径一般为100～200μm，相对密度接近1.0。是由带有表面电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。微载体已用于多种动物细胞的固定化；
◆中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成。
(2)包埋法
◆包埋固定化法一般适用于悬浮细胞。
◆根据载体和方法的不同，有凝胶包埋法、半透膜包埋法两种。
①凝胶包埋法：利用各种多孔凝胶为载体将动物细胞固定化。细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖和新陈代谢，由于有载体的保护，动物细胞有较好的稳定性，可显著提高其存活率。
用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白等。
②半透膜包埋法：利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，形成微囊型固定化动物细胞。
2.4.3固定化动物细胞的应用：
动物细胞中大部分为贴壁细胞，需要贴附在载体的表面才能正常生长。所以固定化动物细胞广泛应用。特别是采用微载体对动物细胞进行吸附固定化。

3.原生质体固定化
◆固定化原生质体的制备主要包括原生质体的制备和原生质体固定化两个阶段。
3.1原生质体的制备
◆不同种类的细胞，由于各自细胞壁的组成、结构和性质不同，原生质体的制备方法也不一样。
◆原生质体的制备过程是首先将对数生长期的细胞收集起来，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中。然后加入适宜的细胞壁水解酶，在一定的条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细胞壁水解酶，而得到原生质体。
◆除去细胞壁所使用的酶应根据细胞壁的主要成分的不同而进行选择。
◇细菌的细胞壁主要成分是肽多糖，所以细菌原生质体制备时主要采用从蛋清中得到的溶菌酶；
◇酵母细胞壁主要由β-葡聚糖构成，故采用β-1，3-葡聚糖酶；
◇霉菌的细胞壁组分比较复杂，除含有几丁质外，还有其他多种组分，故要去除霉菌的细胞壁，则需有几丁质酶与其他有关酶共同作用。
◇植物细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶组成，故制备植物原生质体时主要应用纤维素酶和果胶酶。
◆为防止制备得到的原生质体破裂，应加入适当的渗透压稳定剂。如：无机盐、糖类、糖醇等化合物。
◆应选择对数生长期的细胞制备原生质体，以获得较高的原生质体形成率。
◆所加进的细胞壁溶解酶的种类和浓度、酶作用温度，pH值以及作用时间等对原生质体的制备都有明显影响，必须经过试验确定其最佳条件。
3.2原生质体固定化
◆采用包埋法制成固定化原生质体。
◆原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。常用的凝胶有：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶和光交联树脂等。
3.3固定化原生质体的特点：
(1)固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散屏障，可增加细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率。
(2)固定化原生质体由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用和连续使用较长的时间，利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力。
(3)固定化原生质体易于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。
(4)固定化原生质体发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂，以保持原生质体的稳定性。这些渗透压稳定剂在发酵结束后，可用层析或膜分离技术等方法与产物分离。
3.4固定化原生质体的应用
固定化原生质体一方面保持了细胞原有的新陈代谢特性，可以照常产生原来在细胞内产生的各种代谢产物，另一方面又去除了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内产物不断地分泌到胞外，这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺而在发酵液中获得所需的发酵产物，为胞内物质的工业化生产开辟了新途径。
固定化原生质体可用于各种氨基酸、酶和生物碱等物质的生产以及甾体转化等。

❻ 有谁知道鸡蛋提取溶菌酶的合作项目是真是假 多谢

一种用鸡蛋提取溶菌酶的新工艺技术
本发明公开了一种用鸡蛋提取溶菌酶的新工艺。该工艺是在现有工艺中的沉淀步骤中加入氧化锌参与溶菌酶的沉淀，这样就可解决多年来人们单纯使用硫酸铵沉淀溶菌时，沉淀速度慢及沉淀不完全的问题，同时可提高溶菌酶的活性，通过该工艺可使溶菌酶的沉淀速度提高6－12倍。
一种分离溶菌酶的方法
本发明分离溶菌酶的方法，以鸡蛋清为原料，加水适当稀释后，搅拌均匀，加酸调pH值至4．0－5．0，静置、过滤除去沉淀，将滤液升温至75－80℃，冷却至室温，静置不少于10小时，过滤得上清液，加碱调pH值为7．5－8．0，加乙醇至产生白色沉淀，过滤，冲洗，干燥即得产品；本方法工艺步骤简、生产周期短、溶菌酶得率高；所制得的溶菌酶可用作防腐用的食品添加剂。
一种生产基因工程重组人溶菌酶的方法
一种生产基因工程重组人溶菌酶的方法，是运用分子生物学技术和基因工程技术，将人溶菌酶基因克隆入酵母菌体内进行表达，然后通过提取、纯化制出人溶菌酶。本发明由于利用基因工程重组技术，发酵生产人溶菌酶，能够较大批量生产人溶菌酶，又避免了从组织中提取易受病源污染的问题，其产品具有稳定、纯净的特点。
溶菌酶亲和层析凝胶介质的制备方法
溶菌酶亲和层析介质的制备方法。将壳聚糖溶于醋酸或盐酸溶液中，再加入3－6倍体积的甲醇，过滤，于滤液中加入脂肪酸酐让其酰化成凝胶状，捣碎凝胶并用水将其洗至中性，用5－10％的NaOH或KOH溶液处理以脱去非N－位的脂肪酰化，再用水洗至中性，在酸性条件下用亚硝酸盐氧化除去凝胶内未酰化的游离氨基，而后用碱调至中性，用水洗去酸和盐类等残留物抽干即得所需的介质。
萝卜溶菌酶及其制备方法
本发明是以萝卜的根叶为原料，经匀浆浸提过滤，滤液经亲和吸附，装柱洗涤和亲和洗脱、收集酶液、透析、浓缩和冻干成酶制剂。酶活力高达4－7万U／mg。蛋白，酶的活性中心含有Trp、His、Glu和Asp残基，杀菌谱广，不仅对G↑〔＋〕菌有杀灭作用，对G↑〔－〕菌同样有杀灭作用。萝卜溶菌酶的成功提取，将为食品业、农作物的病虫害防治上和药医治疗上开拓了新途径。
从咸蛋清中提取溶菌酶方法
咸蛋黄被广泛应用于食品加工中，而咸蛋（鸭蛋或鸡蛋）取黄后留下的咸蛋清因含有极高浓度的食盐和异味限制了应用而常被废弃。本发明经普查表明咸蛋清中尚含有丰富的溶菌酶含量，可以作为生产溶菌酶的原料；进而采用脱氨酰化壳聚糖凝胶亲和吸附法，直接从咸蛋清中仅经一步便纯化得溶菌酶，所得纯化酶的比活力大于70000U／mg蛋白，回收率可达70％。
一种以溶菌酶为主要成分的外用凝胶剂及其制备方法
本发明是一种以溶菌酶为主要成分的外用凝胶剂及制备方法。该凝胶剂可以是水性凝胶，也可以是油性凝胶。根据需要配方中可以加入少量抗菌剂、抗病毒剂、抗滴虫剂、消毒防腐剂、润滑剂、清凉剂和芳香剂等辅助剂。适用于阴部感染的女性，更年期妇女及已婚妇女日常卫生保健，还可用于旅馆、居家的浴缸、浴盆等洁具的消毒，防止性病传播和预防交叉感染。本发明用于消炎杀菌、清洁阴道、消除瘙痒、清除异味，总有效率达81．58％。动物实验结果表明该产品无毒、无刺激性和致敏性，对使用者卫生、安全、无害。具有预防保健效果好、使用方便、作用维持时间长、副作用小，适用范围广等特点，是一种安全、卫生的新型阴部保健品。
溶菌酶在奶制品中的应用
本发明提供了溶菌酶的一种新的应用领域，即溶菌酶在奶制品中的应用技术，其作法是：在溶菌酶中加入保护剂，混合均匀后成溶菌酶集合物，按常规生产工艺制作奶制品，在生产进行到最后一步－分装工序之前，加入溶菌酶集合物，混匀后再分装出厂，成品奶制品中溶菌酶的活性在60℃－80℃时不失活，且含量可达到人乳的水平，采用本发明应用技术生产的奶制品，其营养成份丰富，具有很好的免疫功能，可取代现有的牛乳制品喂养婴幼儿，增强婴幼儿的免疫、抗病能力。
一种溶菌酶蛋白生产工艺及其应用
本发明涉及一种人溶菌酶蛋白生产工艺。目前市场上的溶菌酶蛋白都来源于其他种属动物机体，对人体而言是异种蛋白，有很强的抗原性，副作用大。本发明的生产的溶菌酶蛋白具有人源的天然氨基酸序列，解决了异源性溶菌酶用于人体内的抗原性问题。更重要的是，人体中的溶菌酶活性最高，本发明提供的蛋白生产工艺与传统工艺相比，分离纯化步骤简单易行，能得到较高的蛋白投入产出比，为人溶菌酶蛋白的工业化生产提供了一个高效的生产工艺。本发明还涉及上述方法及其产物的应用。
人核糖核酸酶U和人溶菌酶的两种进化酶
本发明涉及两种人源酶的分子进化酶。本发明的进化酶分别是以人核糖核酸酶U和人溶菌酶为原料，经过基因钓取，定向进化，表达筛选等步骤，最后制得。本品具有制备工艺简单、生产成本低、酶活力较高、稳定性好、应用价值大等优点，可独自或联合广泛地应用于抗菌药物、抗病毒药物、抗炎症药物、治疗龋齿药物、治疗爱滋病药物等医药工业各领域。
高表达、高纯度、高活性基因重组人溶菌酶的生产及用途
本发明涉及一种高表达、高纯度、高活性基因重组人溶菌酶的生产方法及其新用途。提供了利用提取纯化的基因工程技术表达的人溶菌酶的溶菌活性，用于临床上细菌和真菌的感染，特别是耐药性细菌感染的治疗方法，以及革兰阴性菌感染治疗后内毒素引发的后遗症的治疗方法。提供了用于各种治疗用途的抗生素和人溶菌酶的药用组合物。
从鸡蛋及鸟类蛋提取溶菌酶的方法
本发明的名称是：从鸡蛋及鸟类蛋提取溶菌酶的方法。属于提取生物活性物质技术领域。本发明的目的在于：提供一种溶菌酶的提取方法，简单、易操作。本发明采用下述步骤：获取蛋清，加入氯化钠溶液并搅拌；加入盐酸溶液，水域加温至40℃；自然冷却至常温，加入乙酸溶液，水域加温至80℃；离心后过滤，在滤清夜中加入氯化钠搅拌后再次加温至60℃；加入丙酮，滤取白色絮状物，自然干燥后，碾粉并包装。
制备溶菌酶的方法
本发明提供一种制备溶菌酶的有效方法，其特征为使用硅藻土、高岭土、沸石或其混合物选择性地吸附蛋白中的溶菌酶，及随后以离子溶液进行洗提。上述硅藻土、高岭土及沸石对溶菌酶具有优异的选择性吸附能力，可提高溶菌酶的纯化倍数。
一种人溶菌酶系列化妆品及其制备方法
本发明涉及一种化妆品及其制备方法，特别是涉及一种人溶菌酶Humanlysozyme系列化妆品及其制备方法。人溶菌酶系列化妆品的主要成分是人溶菌酶Humanlysozyme（HLZ），其工艺过程如下：首先将人溶菌酶制备后备用，先将原料进行搅拌，均质乳化后冷却到45度，将制备好的人溶菌酶到入，经真空脱气搅拌至一定温度即可。积极效果在于原料易得，工艺简单，效果显著，并且易于推广应用。

家用长效除臭剂

本剂是以沸石、氯化镁、氧化镁和安息香酸配制成的家用长效除臭剂。一、特点：（1）除臭力强是。由于沸石和氯化镁、氧化镁相混合，沸石微孔结构中吸附的大气中的水分，能被氧化镁和氯化镁吸附，因而使沸石微孔结构的孔隙得到再生，使沸石的除臭能力牧师以充分发挥；再加氯化镁和氧化镁也都有除臭功能，故作为整体，除臭力强是。（2）有效除臭期长。沸石与氯化镁、氧化镁相配合，使氧化镁包覆于氯化镁的外部表面，从而使氯化镁的吸湿能力得到适当抑制，使氯化镁不致因为吸湿过多而潮解。因此，三者得以长期发挥作用，使有效除臭期大幅度延长。（3）除臭性能稳定。本剂中加有安息香酸，可以防止除臭剂因吸附臭气和水分而受到损害。可保持性能稳定、长期使用效果好。（4）原料价廉易得。二、用途：可用于厕所、居室、病房、鞋箱等除臭。编号35189

L—抗坏血酸—硫酸亚铁多效除臭剂

除臭剂种类虽多。但各有不足。例如，覆盖型除臭剂，只能将臭覆盖掩蔽，不能除去，因而往往要残留异臭；吸附型除臭剂，因吸附容量所限，届时吸附能力必然降低或丧失；酸碱中和型除臭剂，除臭范围只限于能够同酸碱相结合的物质；含枸橼酸和顺丁烯二酸类的除臭剂，不能除去硫醇类臭气等。本剂是以L-抗坏血酸和硫酸亚铁为有效成分配制而成，不存在上述缺点，是能够除去各种恶臭的多效除臭剂。一、特点：（1）原料易得，价格低廉，制造容易，使用方便。（2）本剂中含有的L-抗坏血酸，可使硫酸亚铁经常维持活性状态，使之与氨、胺臭中的胺形成络合物，与含硫恶臭中的硫生成（铁-硫）键，故对于氨类恶臭和含硫恶臭均能有效除去，除臭范围广的。（3）性能稳定，即使长期暴露于空气中或潮湿条件下，除臭效果也无变化。（4）原料都是公认的可食性物质，即使同食品接触，也可以确保安全。（5）可以制成各种形态。使用于各个领域。二、用途：用于厕所、垃圾箱、冷库、冰箱等的除臭，均有良好效果。特别是用于除去氨类、硫醇类的恶臭，效果尤佳。用本剂的液体除臭剂浸渍纸、布等，制成除臭片或除臭纸，直接包裹鱼、肉等食品，贮放于冰箱、冷库、防止其臭味向其他食品转移和串味，或用于去除冰箱、冷库的异味，也有良好效果。编号35191

人体消臭剂

为消除来自人体的恶臭--腋臭、汗臭、脚臭、头发臭、生理臭等，使用的消臭剂，大多是由作为抑汗剂使用的具有收敛作用的羟基氯化铝、杀菌剂六氯酚，或各种季铵化合物及掩蔽剂丁子香酚等，单独或经任意组配制成。然而，这些消臭剂的使用效果并不能完全令人满意。例如，抑汗剂，从生理学看，并不能完全抑制发汗；杀菌剂，因安全性问题，并不能以有效的足够的浓度添加；掩蔽剂同汗臭掺合在一起，又会产生恶臭等等。因而不能得到满意结果。本剂是以合成树脂和金属氧化物制成的复合粉体为消臭活性物质，再根据需要加入各种添加剂配制而成，用于消除人体恶臭，取得了比较满意的结果。一、特点：（1）消除人体恶臭，效果好。（2）使用安全，对人体无害。（3）可以制成各种剂型，例如气溶胶、粉剂、膏剂、棒状等剂型，使用方便。二、用途：适用于消除来自人体的腋臭、汗臭、脚臭、头发臭、生理臭等各种恶臭。编号35198

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❽ 酶的分离和纯化方法是什么

酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。

酶分离纯化的最终目的是获得单一纯净的酶，因此，容许在不破坏“目的酶”的限度内，使用各种手段;酶与底物和抑制剂的结合常使其理化性质和稳定性发生改变，这种特性已被用于酶的分离纯化。

由于酶及其来源的多样性及与之共存的高分子物质的复杂性，目前还很难找到一种通用的方法以适用于一切酶的纯化。为了使一种酶达到高度纯化，往往需要多种方法协同作用，通过酶活性的跟踪检测确定最佳流程。

(8)运用离子交换法分离纯化溶菌酶的优缺点扩展阅读：

酶的本性是蛋白质，凡可用于蛋白质分离纯化的方法都同样适用于酶，但酶易失活，故分离纯化需在低温(4℃)、温和pH(4<pH>10)等条件下进行。

与蛋白质类似，酶易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，因此操作中应尽量减少泡沫形成，此外重金属易使酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏。

在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称是分离纯化。

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