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2. 实验室常用的灭菌方法有干热灭菌.高压蒸汽灭菌.紫外线灭菌.过滤除菌四种各有那些优缺点
1.高压蒸汽灭菌
为湿热灭菌方法的一种。是微生物培养中最重要的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水在煮沸时所形成的蒸汽不能扩散到外面去,而聚集在密封的容器中,在密闭的情况下,随着水的煮沸,蒸汽压力升高,温度也相应增高。压力和温度之间的关系见表9-1。
高压蒸汽是最有效的灭菌法,能迅速地达到完全彻底灭菌。一般在15磅/英寸2压力下(121.6℃),15~30分钟,所有微生物包括芽孢在内都可杀死。它适用于对一般培养基和玻璃器皿的灭菌。
进行高压蒸汽灭菌的容器是高压蒸汽灭菌锅。高压蒸汽灭菌锅是一个能耐压又可以密闭的金属锅,有立式与卧式两种。
可以用电热、煤气、蒸汽等。锅上装有压力表,有的还装有温度计,能及时了解锅内压力及温度。锅上还设有排气口,其作用是在密闭之前,利用蒸汽将锅内的冷空气排净,另外还装有安全活门,如果压力超过一定限度,活门即可自动打开,放出过多的蒸汽。
2.干热灭菌
微生物培养中常用的干热灭菌是指热空气灭菌。一般在电烘箱中进行。干热灭菌所需温度较湿热灭菌高,时间也较湿热灭菌长。这是因为蛋白质在干燥无水的情况下不容易凝固。一般须在160℃左右保持恒温3~4小时,方能达到灭菌的目的。
干热灭菌适用于空玻璃器皿的灭菌,凡带有橡胶的物品和培养基,都不能进行干热灭菌。
3.间歇灭菌
各种微生物的营养体在100℃温度下半小时即可被杀死。而其芽孢和孢子在这种条件下却不会失去生活力。间歇灭菌就是根据这一原理进行的。
间歇灭菌的方法是用100℃、30分钟杀死培养基内杂菌的营养体,然后将这种含有芽孢和孢子的培养基在温箱内或室温下放置24小时,使芽孢和孢子萌发成为营养体。这时再以100℃处理半小时,再放置24小时。如此连续灭菌3次,即可达到完全灭菌的目的。
间歇灭菌通常在流动蒸汽的灭菌锅中进行,也可用普通铝锅代替。这种灭菌方法多用于明胶、牛乳等物质的灭菌,这类物质在100℃以上的温度下处理较长时间,会被破坏,而用间歇灭菌法就既起到了杀菌作用,又使被处理的物质免遭破坏。
4.紫外线灭菌
紫外线杀菌力最强的是波长2650~2660Å的部分。无菌室缓冲间和接种箱常用紫外线灯作空气灭菌。无菌室和缓冲间的照射时间为20~50分钟(视房间大小而定),接种箱照射10~15分钟即可。
为了加强紫外线灭菌的效果,在照射前,可在无菌室、缓冲间或接种箱内喷洒5%石炭酸,以使空气中附着有微生物的尘埃降落,同时也可以杀死一部分微生物。无菌室的工作台的台面和椅子,可用2~3%的来苏儿擦洗。然后再照射紫外线。由于紫外线对人体有伤害作用,所以人不要直视正在照射的紫外线灯,也不要在照射情况下进行工作。
灭菌后,为了检验紫外线的灭菌效果,可以在无菌室、缓冲间或接种箱内放一套盛有培养基的培养皿,将皿盖打开5~10分钟,盖好后,放入温箱中培养。如果只有一、二个菌落,可认为灭菌效果良好。如杂菌丛生。则需延长照射时间或同时加强其它灭菌措施。
3. 试述高压蒸汽灭菌和常压灭菌及其关键环节
高压灭菌的原理是:在密闭的蒸锅内,其中的蒸汽不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下,锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
注意:完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法,但目的都是要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底。常用方法是:关闭放气阀,通电后,待压力上升到0.05MPa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀。关阀再通电后,压力表上升达到0.1MPa时,开始计时,维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。
到达保压时间后,即可切断电源,在压力降到0.5MPa,可缓慢放出蒸气,应注意不要使压力降低太快,以致引起激烈的减压沸腾,使容器中的液体四溢。当压力降到零后,才能开盖,取出培养基,摆在平台上,以待冷凝。不可久不放气,引起培养基成分变化,以至培养基无法摆斜面 。一旦放置过久,由于锅炉内有负压,盖子打不开,只要将放气阀打开,大气压入,内外压力平衡,盖子便易打开了。
对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培介质、接种用具,可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效力降低,不能随意延长时间。
常压湿热灭菌法
通过热蒸汽或沸水使蛋白质变性而杀灭微生物的方法。湿热穿透力强,灭菌效果较干热好。
①煮沸或流通蒸汽灭菌:常压下沸水和蒸汽的温度是100℃,一般处理30~60min可杀死细菌繁殖体,但不能完全杀灭芽孢。此法适用于不能高压蒸汽灭菌的物品。
②低温间隙灭菌(巴斯德灭菌法):将物品先用60~80℃加热(或煮沸)1h,然后置20~25
℃保存24h(或常温过夜),使其中残存的芽孢萌发成繁殖体,再用以上条件灭菌,如此反复三次。本法适用于不耐高温或高温下易变质的物品,但很费时。
常压灭菌还可以是射线灭菌,化学灭菌,巴氏消毒等方法。
化学灭菌法 利用化学试剂形成的气体来杀灭微生物的方法。常用的灭菌剂为环氧乙烷(又称氧化乙烯)。环氧乙烷是广谱杀菌剂,能杀灭细菌、芽孢和多种病毒,还能杀死昆虫及虫卵。但由于环氧乙烷易燃易爆且有毒(有致变异性),用于药品方面极有限,多用于医疗器械、塑料制品等灭菌。(不能用于橡胶和乳胶手套,能将其溶解。)
4)滤过除菌法 利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理,除去对热不稳定的药品溶液或液体物质中的细菌的方法。过滤法一般只能除菌,不能除去支原体和病毒。
过滤除菌的效果与滤膜的性能、孔径的大小、密度、滤膜的厚度等因素有关。
滤过除菌法要求最终过滤的滤膜孔径为0.22μm。由于各厂家生产的相同规格的滤膜质量并不一致,为了保证除菌效果,在使用前后应检查滤器的完好性(如压力维持试验或起泡点试验)。
一个过滤器的使用时间应根据品种验证后确定,一般不应超过8小时。
5)辐射灭菌法 辐射有两种类型:一种是电磁波辐射,如紫外线、红外线、微波;一种是电离辐射,如可引起被照射物电离的X射线、γ射线。
①紫外线:紫外光波长在136~390nm之间,其中260nm左右能破坏核酸,杀菌作用最强。另外,空气中的氧受紫外线照射后,可微量转变为臭氧共同起杀菌作用。紫外线消毒的效果与光源的功率、光源与被照射物的距离、照射时间、温度和湿度等因素有关。我国规定紫外灯照射强度在距离1m处不低于70μW/cm2(以紫外线测强仪测定)。在操作面上要求强度达40μW/cm2以上。一般每10m2装30W灯管1支,工作前开30~60min。
紫外灯的输出功率随使用时间增加而降低。国产紫外灯的平均寿命(点到70%额定功率的时间)一般为2000h,超过平均寿命时,就达不到预期效果,必须更换。
紫外线的穿透力很弱,不能穿透一般包装材料,如玻璃、塑料薄膜、纸等。玻璃能强烈吸收小于350nm的紫外线,石英玻璃能吸收小于200nm的紫外线。因此,它主要用于空气和物体表面消毒,特制的紫外灯装置也可用于水的消毒。
紫外线对眼、皮肤有损坏,照射过程中产生的臭氧对眼、鼻腔有刺激,臭氧过多时使人头晕、胸闷、血压下降。
②红外线:通过加热碳化硅板产生的辐射热能,由空气传导加热灭菌。如红外线烤箱,温度可达180℃左右。热效应特点是由表及里。
③微波:微波灭菌主要是因其热效应。微波加热升温快,温度高且均匀,杀菌作用强。热效应特点是由里及表。不同性质的物品吸收微波的能力不同,其热效应和消毒效果也不同。
微波有一定穿透力,但不强。微波对人体有害,要注意防护。
④60Co灭菌:放射性同位素60Co(或137Cs)衰变时可放射出γ射线,γ射线的能量高、穿透力强,可使细胞内各种活性物质发生化学变化,从而使细菌损伤或死亡。
经60Co辐射灭菌的物品温度升高很少,一般仅约5℃,故又称“冷灭菌”。
60Co辐射存在两个方面的安全问题:一是辐射的直接作用。γ射线对人体细胞同样有害;二是经过辐射的食品、药品的安全性。1984年美国农业部食品安全实验室用辐射处理的鸡肉喂饲小鼠,发现患睾丸肿瘤增加,包括加重癌病损害。因此60Co辐射用于食品和药品都应经过安全试验,进行科学的、全面的评价,高剂量的辐射药品更应慎重。