离子交换树脂层析行为

A. 执业药师考试综合辅导：离子交换层析法(1)

离子交换层析(ionexchangechromatography)是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分析速度快等优点，是当前最常用的层析法之一。
(一)基本原理
离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂的玻璃管中进行的。离子交换剂为人工合成的多聚物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。含有欲被分离的离子的溶液烂漏茄通过离子交换柱时，各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞争性结合。任何离子通过柱时的移动速率决定于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。
离子交换剂是由基质、荷电基团和反离子构成，在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。同时它与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合，结合后不改变本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物所进行的离子交换反应是可逆的。假定以ra代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的阳离子a+与溶液中的阳离子b+可发生可逆的交换反应，反应式如下：
ra+b+ rb+a+
该反应能以极快的速率达到平衡，平衡的移动遵循质量作用定律。
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，结合力的大小取决于离子交换剂的选择性。离子交换剂的选择性可用其反应的平衡常数k表示：
k＝[rb][a+]/[ra][b+]。
如果反应溶液中[a+]等于[b+]，则k＝[rb]/[ra]。若k>i，即[rb]>[ra]，表示离子交换剂对b+的结合力大于a+；若k=1，即[rb]＝[ra]，表示离子交换剂对a+和b+的结合力相同；若k<1，即[rb]<[ra]，表示离子交换剂对b+的结合力小于a+。k值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性参数，故称k值为离子交换剂对a+和b+的选择系数。
溶液中的离子与交换剂上的离子进行交换，一般来说，电性越强，越易交换。对于阳离子树脂，在常温常压的稀溶液中，交换量随交换离子的电价增大而增大，如 na+ 两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力，主要决定于它们的理化性质和特定的条件下呈现的离子状态。当phpi时，能被阴离子交换剂吸附。若在相同pi条件下，且pi>ph时，pi越高，碱性越强，就越容易被阳离子交换剂吸附。
离子交换层析就是利用离子交换剂的荷电基团，吸附溶液中相反电荷的离子或离子化合物，被吸附的物质随后为带同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱。由于各种离子或离子化合物对交换剂的结合力不同，因而洗脱的速率有快有慢，形成了层析层。
(二)离子交换剂类型及选择
1．离子交换剂的类型
根据离子交换剂中基质的组成及性质，可将其分成两大类：疏水性离搜氏子交换剂和亲水性离子交换剂。
(1)疏水性离子交换剂
此类交换剂的基质是一种与水亲和力较小的人工合成树脂，最常见的是由苯乙烯与交联剂二乙烯苯反应生成的聚合物，在此结构中再以共价键引入不同的电荷基团。由于引入电荷基团的性质不同，又可分为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂及螯合离子交换树饥察脂。
①阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电，故此类交换剂可与溶液中的阳离子或带正电荷化合物进行交换反应。依据电荷基团的强弱，又可将它分为强酸型、中强酸型及弱酸型三种，各含有以下可解离基团：

这些交换剂在交换时，氢离子为外来的阳离子所取代，如下式所示：
r—cooh + na+ －－＞r—coona + h+
②阴离子交换剂 此类交换剂是在基质骨架上引入季胺[—n+(ch3)3]、叔胺[—n(ch3) 2]、仲胺[—nhch3]和伯胺[—nh2]基团后构成的，依据胺基碱性的强弱，又可分为强碱性(含季胺基)、弱碱性(含叔胺、仲胺基)及中强碱性(既含强碱性基团又含弱碱性基团)三种阴离子交换剂。它们与溶液中的离子进行交换时，反应式为：
r—n+(ch3)3oh–+c1–－－＞r—n+(ch3)3 c1–+ oh–
r—n+(ch3)2 + h2o－－＞r—n+(ch3)2h•oh–
r—n+(ch3)2h • oh +c1–－－＞r—n+(ch3)2h • c1– + oh–
③螯合离子交换剂 这类离子交换树脂具有吸附(或络合)一些金属离子而排斥另一些离子的能力，可通过改变溶液的酸度提高其选择性。由于它的高选择性，只需用很短的树脂柱就可以把欲测的金属离子浓缩并洗脱下来。
疏水性离子交换剂由于含有大量的活性基团，交换容量大、流速快、机械强度大，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸及氨基酸等小分子物质，也可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如sds)、去污剂(如tritonx—100)、尿素、两性电解质等。

B. 离子交换层析法分离纯化蛋白质有哪些局限性

1，离子交换树脂固定床的床层压力会随着分离过程的进程而不断加大，需要重回新填充答。同时，也造成固定床填充过程操作麻烦，而且密封性要求高。2，蛋白质分离纯度问题，如果在出峰之后再行切换接收馏分，而在峰行下降后提前切换，虽可以保证纯度，但蛋白分离收率则会下降。3，由于交换层析介质决定，不同蛋白质相互分离效果也不确定，这种分离，也易造成各蛋白峰重叠，造成分离纯度下降。4，自动化程度不高。主要也是受固定床以及树脂交换饱和当量无法保持长期稳定造成的。无法像液相色谱柱那样，可以在标样标定后，建立方法，自动分离目标蛋白。5，不过，规模化分离纯化蛋白质过程，使用这种层析法，还是具有一定优势的。
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详细资料请参考：
离子交换层析: http://proct.bio1000.com/100474/

C. 离子交换层析的发展

1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。上世纪40年代，出现了具回有稳定交换特性答的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。离子交换层析是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂 。

D. 离子交换层析的基本信息

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

E. 求问怎么用离子交换树脂层析分离混合氨基酸

【原理】离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的极性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(＝R＝S03H)、弱(＝COOH)、强碱 (＝N+＝R：)和弱碱(＝NH2＝NHR＝NR2)。
离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。但对生物大于物质如蛋白质是不适当的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。故如分离生物大子、可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。
本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液。在特定的pH条件下，它们解离程度不同，通过改变脱液的pH或离子强度可分别洗脱分离。
【材料】1．实验器材层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计、磺酸阳离子交换树脂(Dowex 50)
2．实验试剂
(1)2mol／L HCl
(2)2mol／L NaOH
(3)0.1mOl／L HCl
(4) 0.1mol／L NaOH
(5)pH4.2的柠檬酸缓冲液：0.lmol／L柠檬酸54m1加0.1mol／L柠檬酸钠46ml
(6)pH5的醋酸缓冲液：0.2mol／L NaAc 70ml加 0.2mol／L HAc 30ml
(7)0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮
(8)氨基酸混合液：丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸各10m1加0.1mol／L HCl 3m【方法】
1. 树脂的处理
100ml烧杯中置约10g树脂，加25ml 12mo1／L HCl搅拌2h，倾弃酸液，用蒸馏水充洗涤树脂至中性。加25ml 12mol／L NaOH至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性。将树脂悬浮于50ml pH4.2柠檬酸缓冲液中备用。
2. 装柱取直径0.8cm～1.2cm、长度 10cm～12cm的层析柱，底部垫玻璃棉或海绵圆垫，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，在加入一些树脂，至树脂沉积至8cm～10cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗涤，使流出液pH为4.2为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。
3. 加样、洗脱及洗脱液收集
打开山口使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口(不可使树脂表面干燥)。用长滴管将15滴氨基酸混合液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内。当液面刚平树脂表面时，加入0.1mol／L HCl 3ml，以10滴／min～12滴／min的流速洗脱，收集洗脱液，每管20滴，逐管收存。当HCl液面刚平树脂表面时，用1m1 pH4.2柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用2ml pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10滴／min～12滴／min并注意勿使树脂表面干燥。
在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法是：于各管洗脱液中加10滴pH5醋酸缓冲液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10min，如溶液呈紫蓝色，表示已有氨基酸洗脱下来。显色的深度可代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测。
在用pH4.2柠檬酸缓冲液把第二个氨基酸洗脱出来之后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部剩余的pH4.2柠檬酸缓冲液移去。
于树脂顶部加入2ml 0.1mo1／L NaOH，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面I续用0.1mo1／L NaOH洗脱并逐管收集 (注意仍然保持流速10滴／min～12滴／min)，每管20滴。做洗脱液中氨基酸检验，在第三个氨基酸用0.1mo1／L NaOH洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性部分。
最后以洗脱液管号为横坐标，洗脱液各管光密度（以水作空白，在570nm波长读取吸光度）或颜色深浅（以 -，±，+，++．．．表示）为纵坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。
【注意事项】
1. 一直保持流速10滴/min～12滴／min，并注意勿使树脂表面干燥。
2. 在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。

F. 离子交换层析的原理是什么 已解决

离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物内质的酸碱性容，极性，所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。

层析开始前，功能基团与反离子稳定结合，就与反离子发生可逆交换，与层析剂结合被固定下来。因为盐离子可以与底物竞争功能基团，盐浓度越高样品与层析剂结合越不紧密，易被洗脱下来。不同物质与层析剂结合程度不同，洗脱下来的时间不同，因此得以分开。

(6)离子交换树脂层析行为扩展阅读

离子交换剂的选择首重保持欲分离物质的生物活性，以及在不同pH值环境中，此物质所带的电荷和电性强弱，阴阳离子交换剂的选择若被分离物质带正电荷，这些碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂。

在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换剂，如果欲分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的pH范围带有何种电荷，作为交换剂的选择。离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生，若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤。

G. 离子交换柱层析中树脂为什么中性

离子交换柱层析中树脂为什么中性
1离子交换树脂性能降解原因
树脂在长期内使用中，性能会逐渐容下降，表现为出水（即产品）质量降低。影响树脂性能降解的因素很复杂，如树脂体积减少，交换能力下降，球粒裂纹增多，破碎流失等，造成上述现象的原因不外是：
（1）胀缩内应力不均。在使用中树脂内部由于溶胀及收缩变化的不均匀，局部结构中应力不平衡，造成断链裂解。
（2）氧化破坏。体系中的氧化剂，包括酸、碱、溶剂等对树脂骨架及功能基的破坏。
（3）杂质污染。水中杂质堵塞了树脂的内部孔道，阻挡交换吸附。
2离子交换树脂使用前为什么要进行预处理
新树脂常含有反应溶剂、未参加反应的物质和少量低分子量的聚合物、铁、铅、铜等杂质。当树脂与水、酸、碱或其它溶液相接触时，上述可溶性杂质就会转入溶液中，在使用初期污染出水水质。因此，新树脂在投运前要进行预处理，转换为指定的离子型式。

H. 离子交换层析可用于哪些种类蛋白质的分离

离子交换层析是利用蛋白质在不同PH带不同种电荷的方法，利用离子交换的方法分离专蛋白的。
离子交换属内的介质一般是树脂，阳离子交换型的，使用前树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3时，氨基酸主要以阳离子形式存在，与树脂上的钠离子发生交换而被“挂”在树脂上，再用洗脱剂洗脱。不同的氨基酸（带的电荷不同）与树脂的亲和力不同，要将其分离洗脱下来，需要降低它们之间的亲和力，方法是逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，反之亦然。

不同反荷离子与树脂亲和力是不同的，其强弱关系为阳性竞争离子：Ag+〉CS+〉K+〉NH4+〉Na+〉H+〉Li+ 阴性竞争离子：I->NO3->(PO4)3->CN-〉HSO3-〉Mg2+〉HCO3-〉HCOO-〉CH3COO-〉OH-〉F- 如果某种离子溶液洗脱效果不好，可用另一种亲和力强的离子代替之，等电点＞7选择阳离子交换树脂，等电点＜7选择阴离子交换树脂。