1. 高分:求有关大气中 三甲胺 的资料
http://www.mep.gov.cn/image20010518/5327.pdf
http://ke..com/view/462676.htm
2000年5月某市食品厂因污水调节池发生堵塞,造成污水外溢。1名工人下池疏通,下到一半即从梯子上跌落池底,随后又有2名工人因下池救人相继跌落池底。其他人员见状,立即报警求救。1小时后,消防人员戴防毒面具下池将3人救上地面时呈昏迷状态,嘴角流出粉红色泡沫状分泌物、鼻孔渗血,不久3人当场死亡。
现场流行病学调查,此食品厂是生猪屠宰企业,生产过程中产生的污水中含有猪的内脏和血水等杂物,经长时间滞留,发酵分解产生三甲胺、甲烷、硫化氢等有害气体。工人在进入污水调节池时,接触大量有害物质。此次检测结果表明:污水调节池内空气中三甲胺平均浓度为50104.7mg/m3。是卫生标准的4175.4倍。三甲胺毒理学实验表明,三甲胺浓度为11.56mg/m3时,可见实验动物鼠鼠毛松散,呈深度麻醉状态,4小时后死亡,尸检发现呼吸道淤血、渗血。根据毒理学实验、现场空气检测结果和中毒死亡者嘴角流出粉红色泡沫状分泌物、鼻孔渗血等情况综合分析,此次中毒事故为三甲胺气体中毒。
人若一次吸入极高浓度三甲胺(TMA),数分钟内即可出现呼吸困难、紫绀和昏迷,不及时抢救可危及生命。急性中毒的临床特点有:皮肤灼伤;眼和上呼吸道黏膜刺激或灼伤;以呼吸系统损害为主的全身中毒表现,以呛咳、咯痰为首发症状,起始为白色黏痰,重者发生肺水肿,可咯出或从口、鼻腔涌出粉红色泡沫痰。迄今国内外尚未见三甲胺慢性中毒病例报道。
三甲胺主要在工业上用于制造表面活性剂、离子交换树脂、胆碱盐、促动植物生长激素,还用作石油、脱漆剂、涂料和添加剂。在日常生活中,蛋白质、氨基酸、动物内脏和血等,经微生物或发酵的作用可以分解为三甲胺。
三甲胺亚急性与慢性毒性
三甲胺低于24.2mg/m3时仅有微臭,长期接触对人无刺激作用;浓度增加2~10倍时,气味加重,有浓烈的鱼腥臭,对眼睛、鼻、咽喉有较强的刺激症状。
现场急救与治疗原则
急性三甲胺中毒无特殊解毒剂,病程初期抢救重点是喉水肿和肺水肿。病程中、后期则是防治肺部继发感染及气道黏膜脱落等并发症。治疗原则:保持呼吸道通畅;合理氧疗,根据血气分析结果指导用氧,急性三甲胺中毒并发呼吸窘迫综合征时,使用加压呼吸应慎重;控制补液量,曾有急性甲胺类中毒病人因短时间内(6小时内)输入大量液体(2500ml)致肺水肿加剧的教训,故在中毒后48小时内应严格限制补液量,一般不应超过1500ml/d(伴皮肤大面积灼伤者除外),并应控制输液速度,以免加重心肺负荷。
三甲胺生产企业发生的职业中毒事故容易诊断鉴别,而因蛋白质、氨基酸、动物内脏和血,经微生物或发酵的作用分解出的三甲胺造成的中毒较难诊断,需要对事故现场做现场职业卫生流行病学调查,及现场空气检测和病人体征综合分析做出判断。
上述中毒案例提醒职业卫生监督机构,要加强对乡镇企业的卫生监督力度及职业卫生知识的宣传和培训,使工人具备自我保护的意识和自救、互救能力。
工艺废气三甲胺和甲醇主要来自于催化剂四甲基氢氧化铵的受热分解,采用活性炭吸附方法进行处理,三甲胺的吸附率能达到90%,对甲醇的吸附率在30%左右,剩余废气经15m排气筒高空外排。经处理后甲醇排放浓度符合《大气污染物综合排放标准(GB16297-1996)二级标准;三甲胺排放浓度符合《恶臭污染物排放标准》(GB14554-93)表2中标准的要求。
烟草在生长发育过程中,尤其是开花期,会形成大量的烟碱和三甲胺,不断排出体外,随风逸散。
2. 树脂732和717的区别
树脂732和717的用途和结构不同。
717是聚苯乙烯三甲胺的聚合物,用于交换阴离子,而724是阳离子树脂,是一种含苯环的羧酸钠聚合的,俩种东西,用途和结构都不一样。
树脂732简介
732树脂强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂本产品是在苯乙烯;—二乙烯苯共聚交联结构的高分子基础上带有磺酸基(-SO3H)的离子交换树脂,其酸性相当于硫酸、盐酸等无机酸。它在碱性、中性、甚至酸性介质中都显示离子交换功能。本产品具有交换容量大、交换速度快、机械强度好等特点。
717强碱性阴离子交换树脂是在苯乙烯二乙烯苯交联共聚物基体上引入季铵基[-N(CH3)3OH],使其成为凝胶型717阴离子交换树脂。
717阴树脂,717阴离子树脂,201x7阴树脂,201x7阴离子树脂,201x7阴离子交换树脂,717树脂,201x7树脂,阴树脂,阴离子树脂,阴离子交换树脂,阴阳树脂,软化水树脂,水处理树脂,锅炉水处理树脂,软水处理树脂。
3. 阳阴离子交换树脂的化学式是什么 阳阴离子交换树脂的反应顺序
离子交换树脂属于高分子化合物,结构比较复杂.离子交换剂的结构可以被区分为两个部分:一部分具有高分子的结构形式,称为离子交换剂的骨架(反应式中用R表示);另一部分是带有可交换离子的基团(称为活性集团),它们化合在高分子骨架上。所谓“骨架”,是因为它具有庞大的空间结构,支持着整个化合物,正象动物的骨架支持着肌体一样,从化学的观点来说,它是一种不溶于水的高分子化合物。
离子交换反应如下
离子交换反应是可逆的,例如当以含有硬度的水通过H型离子交换树脂时,其反就如下式:
2RH + Ca2+ → R2Ca + 2H+
当反应进行到失效后,为了恢复离子交换树脂的交换能力,就可以利用离子交换反应的可逆性,用硫酸或盐酸溶液通过此失效的离子交换树脂,以恢复其交换能力,其反应如下:
R2Ca + 2H+ → 2RH + Ca2+
这两种反应,实质上就是可逆反应式(1-1)化学平衡的移动。当水中Ca2+和H型离子交换树脂多时,反应正向进行,反之,则逆向进行。
2RH + Ca2+ ←→ R2Ca + 2H+
离子交换反应的可逆性,是离子交换树脂可以反复使用的重要性质。
影响离子交换树脂选择性的因素很多,例如交换离子的种类、树脂的本质、溶液的浓度等。离子交换的选择性实际上是离子交换平衡的一种表现。
对于阳离子交换来说,此种顺序的规律比较明显,在稀溶液中,强酸性阳树脂对常见阳离子的选择性顺序如下:
Fe3+>Al3+>Ca2+>Mg2+>K+≈NH4>Na+>H+
这可以归纳为两个规律:离子所带电荷量愈大,愈易被吸取;当离子所带电荷量相同时,离子水合半径较小的易被吸取。
对于弱酸性阳树脂,H+的位置向前移动,例如羧酸型树脂对H+选择性居于Fe3+之前。在浓溶液中,选择性顺序有一些不同,某些低价离子会居于高价离子之前。
弱碱树脂 (胺, 通常为三甲胺)它们只能去除强酸型杂质离子,例如 HCl, H2SO4. 它们只能在酸性溶液中使用。
基本规律 (在稀溶液中)
三价离子 > 二价离子 > 单价离子
磺酸型强酸阳树脂(SAC)
Ba > Pb > Sr > Ca > Ni > Cu > Mg
Ag >> Cs > K > NH4 > Na > H > Li
季胺型强碱阴树脂 (SBA)
SO4 > CrO4 > NO3 > CH3COO > I > Br > Cl > F > OH
弱碱性阴离子树脂对阴离子的吸附的一般顺序如下:
OH-> 柠檬酸根3- > SO42- > 酒石酸根2- >草酸根2- > PO43- >NO2- > Cl- >醋酸根- > HCO3-
希望对你有用
4. 为什么强碱性树脂氢氧型使用温度要低于60度
一般来讲,强碱阴树脂使用温度建议为:氯型≤ 80℃,氢氧型 ≤ 60℃,我公司在热电专联产凝结水回收项目中,属与华电集团成功合作开发了运行温度大概在80℃的耐高温凝结水精处理混床树脂,目前该项目运行2年后,已进入验收程序。
另外,大孔型强碱阴树脂相比于凝胶型强碱阴树脂,耐热稳定性相对更好,因为大孔结构更稳定。
5. 有机物液体都有哪些
有机物液体包括多类物质,如链烷烃、烯烃、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烃、氢化烃、萜烯烃、卤代烃、杂环化物、含氮化合物及含硫化合物等等,多数对人体有一定毒性。
1、甲苯
无色澄清液体。有苯样气味。有强折光性。能与乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、二硫化碳和冰乙酸混溶,极微溶于水。相对密度0.866。凝固点-95℃。沸点110.6℃。折光率1.4967。闪点(闭杯) 4.4℃。
易燃。蒸气能与空气形成爆炸性混合物,爆炸极限1.2%~7.0%(体积)。低毒,半数致死量(大鼠,经口)5000mg/kg。高浓度气体有麻醉性。有刺激性。
2、环己烷
别名六氢化苯,为无色有刺激性气味的液体。不溶于水,溶于多数有机溶剂。极易燃烧。一般用作一般溶剂、色谱分析标准物质及用于有机合成,可在树脂、涂料、脂肪、石蜡油类中应用,还可制备环己醇和环己酮等有机物。
3、乙酸甲酯
醋酸甲酯一般指乙酸甲酯,醋酸甲酯(methyl acetate)在国际上逐渐成为一种成熟的产品,用于代替丙酮、丁酮、醋酸乙酯、环戊烷等。
美国的伊士曼公司在2005年时,就用醋酸甲酯代替丙酮溶剂,因为醋酸甲酯不属于限制使用的有机污染排放物,可以达到涂料、油墨、树脂、胶粘剂厂新的环保标准。
4、苯酚
苯酚(Phenol,C6H5OH)[1]是一种具有特殊气味的无色针状晶体,有毒,是生产某些树脂、杀菌剂、防腐剂以及药物(如阿司匹林)的重要原料。也可用于消毒外科器械和排泄物的处理, 皮肤杀菌、止痒及中耳炎。
熔点43℃,常温下微溶于水,易溶于有机溶剂;当温度高于65℃时,能跟水以任意比例互溶。苯酚有腐蚀性,接触后会使局部蛋白质变性,其溶液沾到皮肤上可用酒精洗涤。小部分苯酚暴露在空气中被氧气氧化为醌而呈粉红色。遇三价铁离子变紫,通常用此方法来检验苯酚。
5、苯乙烯
苯乙烯(Styrene,C8H8)是用苯取代乙烯的一个氢原子形成的有机化合物,乙烯基的电子与苯环共轭,不溶于水,溶于乙醇、乙醚中,暴露于空气中逐渐发生聚合及氧化。工业上是合成树脂、离子交换树脂及合成橡胶等的重要单体。
6. 什么叫离子交换树脂
什么是离子交换树脂?
1.离子交换树脂是一种具有网状立体结构、且不溶于酸、碱和有机溶剂的固体高分子化合物.离子交换树脂的单元结构由两部分组成。一部分是不可移动且具有立体结构的网络骨架,另一部分是可移动的活性离子。
2.离子交换树脂是一类具有离子交换功能的高分子材料,在溶液中它能将本身的离子与溶液中的同号离子进行交换。如果树脂释放的是活性阳离子,它就能和溶液中的阳离子发生交换,称阳离子交换树脂如果释放的是活性阴离子,它就能交换溶液中的阴离子,称阴离子交换树脂。
离子交换树脂的原理是什么?
在离子交换过程中,水中的阳离子(如Na+、Cat、Kt、Mg2+、Fe3+等)与阳离子交换树脂上的H+进行交换,水中阳离子被转移到树脂上,而树脂上的H+交换到水中。水中的阴离子(如C1-、HCO,等)与阴离子交换树脂上的O进行交换,水中阴离子被转移到树脂上,而树脂上的OH-交换到水中。而H+与0H-相结合生成水,从而达到过滤的目的。
7. 离子交换树脂的工艺特性
阴阳离子交换树脂工作原理:
离子交换是带电粒子或离子的可逆交换与相同电荷的交换。当存在于不溶性阴阳离子交换树脂树脂基质上的离子有效地与周围溶液中存在的类似电荷的离子交换位置时,会发生这种情况。
阴阳离子交换树脂树脂以这种方式起作用,因为它的官能团基本上是固定的离子,它们永久地结合在树脂的聚合物基质中。这些带电离子将容易与相反电荷的离子结合,这些离子通过施加抗衡离子溶液而被输送。这些反离子将继续与官能团结合,直至达到平衡。
在阴阳离子交换树脂循环期间,将待处理的溶液加入阴阳离子交换树脂树脂床中并使其流过珠粒。当溶液移动通过阴阳离子交换树脂树脂时,树脂的官能团吸引溶液中存在的任何抗衡离子。如果官能团对新抗衡离子的亲和力大于已经存在的那些,那么溶液中的离子将移除现有的离子并取代它们,通过共享的静电吸引力与官能团结合。通常,离子的尺寸和/或价数越大,其与相反电荷的离子的亲和力就越大。
让我们将这些概念应用于典型的阴阳离子交换树脂水软化系统。在该实施例中,软化机理由阳离子交换树脂组成,其中磺酸根阴离子(SO 3 -)官能团固定在阴阳离子交换树脂树脂基质上。然后将含有钠阳离子(Na +)的抗衡离子溶液施加到树脂上。通过静电吸引将Na +保持在固定的SO 3 -阴离子上,在树脂中产生净中性电荷。在活性阴阳离子交换树脂循环期间,将含有硬离子(Ca 2+或Mg 2+)的流加入到阳离子交换树脂中。自SO 3 -官能团对硬度阳离子的亲和力大于对Na +离子的亲和力,硬离子取代Na +离子,然后Na +离子作为处理流的一部分流出阴阳离子交换树脂单元。另一方面,硬度离子(Ca 2+或Mg 2+)由阴阳离子交换树脂树脂保留。
阴阳离子交换树脂成分有哪些?
阴阳离子交换树脂树脂基质通过在称为聚合的过程中使烃链彼此交联而形成。交联使树脂聚合物具有更强,更有弹性的结构和更大的容量(按体积计)。虽然大多数阴阳离子交换树脂树脂的化学组成是聚苯乙烯,但某些类型是由丙烯酸(丙烯腈或丙烯酸甲酯)制造的。然后树脂聚合物经历一种或多种化学处理以将官能团结合到位于整个基质中的离子交换位点。这些官能团赋予阴阳离子交换树脂树脂其分离能力,并且从一种树脂到下一种树脂会有很大差异。最常见的成分包括:
强酸阳离子(SAC)交换树脂
SAC树脂由聚苯乙烯基质和磺酸盐(SO 3 -)官能团组成,其中带有钠离子(Na 2+)用于软化应用,或氢离子(H +)用于脱矿质弱酸阳离子(WAC)交换树脂。WAC树脂由丙烯酸聚合物组成,该聚合物已用硫酸或苛性钠水解以产生羧酸官能团。由于它们对氢离子(H +)的高亲和力,WAC树脂通常用于选择性地除去与碱度相关的阳离子。
强碱阴离子(SBA)交换树脂
SBA树脂通常由经过氯甲基化和胺化的聚苯乙烯基质组成,以将阴离子固定到交换位点。1型SBA树脂是通过应用三甲胺生产的,其产生氯离子(Cl -),而2型SBA树脂通过应用二甲基乙醇胺生产,其产生氢氧根离子(OH -)。
弱碱阴离子(WBA)交换树脂
WBA树脂通常由经过氯甲基化的聚苯乙烯基质组成,然后用二甲胺胺化。WBA树脂的独特之处在于它们不具有可交换的离子,因此用作酸吸收剂以除去与强无机酸相关的阴离子。
螯合树脂
螯合树脂是最常见的特种树脂类型,用于选择性去除某些金属和其他物质。在大多数情况下,树脂基质由聚苯乙烯组成,尽管多种物质用于官能团,包括硫醇,三乙基铵和氨基膦等。
8. 在本实验中使用了有机溶剂纯化多糖,有其他替代的试剂或方法吗
多糖(polysacharides,PS),又称多聚糖,是由个以上的单糖通过苷键连接而成的,具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物(细菌和真菌)与动物体内。20世纪60年代以来,人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能[1]:(1)多糖可作为广谱免疫促进剂,具有免疫调节功能,能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病,甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[10],黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能[3-5]。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射,增强免疫功能等生物学作用[6],麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用[7-8],动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制细胞分裂和分化,调节细胞的生长与衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10],银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能[11]。
另外,多糖作为药物,其毒性极小,因而多糖的研究已引起人们极大的兴趣。
由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关,而多糖的结构又是相当复杂的,所以在这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。
1. 多糖的提取[12]
1.1 热水浸提法:
1.1.1多糖提取条件的优选
根据文献报道[13]:影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选,才能选出最佳提取方案。
1.1.2其步骤为:原料→粉碎→脱脂→粗提(2-3次)→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥
首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1:1的乙醇乙醚混合液,水浴加热搅拌或回流1-3小时,脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂(也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1%醋酸和1%苯酚或0.1-1M氢氧化钠作为提取溶剂)提取多糖。温度控制在90-100℃,搅拌4-6小时,反复提取2-3次。得到的多糖提取液大多较粘稠,可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去,将滤液或上清液混合(得到的多糖若为碱性则需要中和)。然后浓缩,再加入2-5倍低级醇(甲醇或乙醇)沉淀多糖;也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等,与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥(若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时,可直接冷冻干燥)。干燥后可得粉末状的粗多糖。
1.2 微波辅助提取法:
其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度,使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热,从而使萃取物质从基体或体系中分离出来,进入到介电常数小,微波吸收能力较差的萃取剂中[14]。
由于微波能极大加速细胞壁的破裂,因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度,增加提取产率。而且由于其选择性好,提取后基体能保持良好的性状,提取液也较一般的提取方法澄清[15]。
聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较,发现微波辅助提取法所需时间最短(10min),多糖的提取率最高(28.46%)。
1.3 超声辅助法:
其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取,另外超声波的次级效应,如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合,利于提取[16]。
超声波辅助法与常规提取法相比,具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]。
1.4 索氏提取法:
将植物粉末置于索氏提取器中,加入石油醚,60℃-90℃条件下提取至无色(一般为6小时)。过滤,滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇,再提取6小时,过滤,滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次,趁热过滤,滤液减压浓缩,再除蛋白,醇沉,除色素。60℃干燥,称重。
1.5 醇提法:
先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中,振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇,至于4℃冰箱中过夜。减压抽滤,再除去色素,得多糖粗品,在60℃通风干燥箱中干燥,再置干燥皿中恒重保存。
醇提法方法简单,易于操作,但提取率较低,乙醇使用量大,不宜大规模提取使用。
1.6 其它方法:
多糖的提取方法还有稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由于稀酸、稀碱条件下,易使多糖发生糖苷键的断裂,部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少,因而很多试验中避免采用稀碱液浸提法和稀酸液浸提法。
2. 多糖的纯化
2.1 多糖中杂质除去方法 粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质,必须分别除去。
2.1.1 除蛋白质
采用醇沉或其它溶剂沉淀所获得的多糖,常混有较多的蛋白质,脱去蛋白质的方法有多种:如选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣质等试剂来处理,但用酸性试剂宜短,温度宜低,以免多糖降解。常用的方法有[19]:
2.1.1.1 沙维积法(Sevag法)[20]:根据蛋白质在氯仿等有机溶剂变性而不溶与水的特点,将多糖水溶液、氯仿、戊醇(或正丁醇)之比调为25:5:1或25:4:1,混合物剧烈振摇20到30分钟,蛋白质与氯仿-戊醇(或正丁醇)生成凝胶物而分离,然后离心,分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法较温和,在避免降解上有较好效果,但效率不高,如五味子多糖的提取实验中要重复处理达三十几次。并且每次除去蛋白质变性胶状物时,不可避免的溶有少量多糖,另外少量多糖与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白,在处理时会沉淀下来,造成多糖的损失。如能配合加入一些蛋白质水解酶,再用Sevage法效果更佳。
2.1.1.2 三氟三氯乙烷法[21]:多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合,低温下搅拌10min左右,离心得上面水层,水层继续用上述方法处理几次,即得无蛋白质的多糖溶液,此法效率高,但溶剂沸点较低,易挥发,不宜大量应用。
2.1.1.3 三氯醋酸法:在多糖水溶液中滴加5%-30%三氯醋酸,直至溶液不再继续混浊为止,在5-10℃放置过夜,离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多糖的降解。
Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三种方法均不适合糖肽,因糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来。对于对碱稳定的糖蛋白,在硼氢化钾存在下,用稀碱温和处理,可以把这种结合蛋白质分开[1]。
2.1.1.4 酶解法[22]:在样品溶液中加入蛋白质水解酶,如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等,使样品中的蛋白质降解。通常将其与Sevag法综合使用除蛋白质效果较好。
2.1.1.5 盐酸法[23]:取样品浓缩液,用2mol/L盐酸调节其PH至3,放置过夜,在3000r/min条件下离心,弃去沉淀,即脱去蛋白质。
另有李知敏[23]和叶将瑜[25]等人分别在植物多糖实验中证明:盐酸法、三氯乙酸法及Sevag法脱蛋白率分别为72.5%、46.1%和42.3%,多糖的损失率分别为15.1%、6.1%和14.3%。盐酸法脱蛋白率高,但多糖的损失率也较高;三氯乙酸法较温和,但除蛋白效率不高;Sevag法的脱蛋白效果不及前两种。
2.1.1.6 其它方法:可以加入5%ZnSO4溶液和饱和Ba(OH)2溶液,振荡后离心去蛋白。此法除蛋白不够彻底,可结合Sevag法使用。还可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉淀完全,在4000r/min的条件下离心10min,收集上清液,即为除蛋白液。还有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白,将混合液清摇,再静置,取上清液。此过程需重复多次方可除尽蛋白。
除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验,观察在280mm处是否有吸收,如果无吸收则表明蛋白质已经除尽[24]。
2.1.2 除色素
2.1.2.1活性炭(activated carbon)除色素[12]:活性炭属于非极性吸附剂,有着较强的吸附能力,特别适合于水溶性物质的分离。它的来源充足,价格便宜,上柱量大,适用于大量制备性分离。目前用于色谱分离的活性炭主要分为粉末状活性炭、颗粒状活性炭、锦纶活性炭三种。一般情况下,尽量避免用活性炭处理,因为活性炭会吸附多糖,造成多糖的损失。
2.1.2.2对于植物来源的多糖,可能含有酚型化合物而颜色较深,这类色素大多呈负性离子,不能用活性炭吸收剂脱色,可用弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA-7来吸附色素。
2.1.2.3若糖和色素时结合的,易被DEAE纤维素吸附,不能被水洗脱,这类色素可进行氧化脱色:以浓氨水或NaOH液调至PH8.0左右,50℃以下滴加H2O2至浅黄色,保温2小时。
2.1.2.4 依次用丙酮、无水乙醚和无水乙醇洗涤多糖,即可得到较为纯净的多糖。此法较为简单,便于操作,多糖损失也较小。
2.1.2.5 用4:1的氯仿-正丁醇除色素。操作简单,多糖有一定损失。
2.1.2.6发酵来源的多糖颜色一般较浅,色素含量较少,一般可不除色素。
2.1.2.7对于动物,微生物等提取得到的多糖也可根据不同情况按上述方法处理。
2.1.3 除低聚糖等小分子杂质
2.1.3.1采用逆向流水透析法。即准备好一桶蒸馏水,用一根导管将水通入透析袋的烧杯底部,另用一根导管将水引出,根据水量控制流速,使水缓慢流动48小时。这样得到的就是多糖的半精品。
2.1.3.2利用溶液浓度扩散效应,将分子量小的物质如无机盐、低聚糖等从透析袋渗透到袋外的蒸馏水中,不断换水即可保持浓度差,从而除尽小分子杂质。具体的做法是根据多糖溶液的体积截取相应长度的透析袋,用透析夹夹住一端,灌入多糖液,离液面2-3cm处夹紧透析袋,置于一大烧杯中,注入蒸馏水至完全浸没透析袋后,用磁力搅拌器慢速搅拌,每12小时换一次水,重复3-4次。
2.2 多糖的纯化方法 纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程,纯化的方法主要有以下几种:
2.2.1 分部沉淀法 根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质,逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮,收集不同浓度下析出的沉淀,经反复溶解与沉淀后,直到测得的物理常数恒定(最常用的是比旋光度测定或电泳检查)。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为了多糖的稳定,常在pH7进行,唯酸性多糖在pH7时-COOH是以-COO` 离子形式存在的,需在pH2-4进行分离,为了防止苷键水解,操作宜迅速。此外也可将多糖制成各种衍生物如甲醚化物、乙酰化物等,然后将多糖衍生物溶于醇中,最后加入乙醚等极性更小的溶剂进行分级沉淀分离。
2.2.2 盐析法 在天然产物的水提液中,加入无机盐,使其达到一定浓度或饱和,促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出,与其它水溶性较大的杂质分离。常做盐析的无机盐的有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。
2.2.3 季铵盐沉淀法 季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂,可与酸性糖形成不溶性沉淀,常用于酸性多糖的分离。通常季胺盐及其氢氧化物并不与中性多糖产生沉淀,但当溶液的PH增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高时,也会与中性多糖形成沉淀。常用的季铵盐有十六烷基三甲胺的溴化物(CTAB)及其氢氧化物(cetyl trimethyl ammonium hydroxide,CTA-OH)和十六烷基吡啶(cetylpyridinm hydroride,CP-OH)。CTAB或CP-OH的浓度一般为1%-10%(W/V)的多糖溶液中,酸性多糖可从中性多糖中沉淀出来,所以控制季铵盐的浓度也能分离各种不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9,而且不能有硼砂存在,否则中性多糖将会被沉淀出来。
2.2.4 柱层析:包括纤维素柱层析、纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和层析、高压液相层析和其它柱层析。如用活性炭及硅胶做载体的柱层来分离多糖;或用硼砂型的离子交换树脂分离中性多糖。
纤维素柱层析 纤维素柱层析对多糖的分离既有吸附色谱的性质,又具有分配色谱的性质,所用的洗脱剂是水和不同浓度乙醇的水溶液,流出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出柱,水溶性差的最后出柱,与分级沉淀法正好相反。
纤维素阴离子交换柱层析 最常见的交换剂为DEAE-纤维素(硼酸型或碱型),洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。此方法目前最为常用。它一方面可纯化多糖,另一方面还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝胶柱层析 凝胶柱层析可将多糖按分子大小和形状不同分离开来,常用的凝胶有葡聚糖凝胶(sephadex G)、琼脂糖凝胶(sepharose bio-gel A)、聚丙烯酰胺凝胶(bio-gel P)等,常用的洗脱剂是各种浓度的盐溶液及缓冲液,但它们的离子强度最好不低于0.02。出柱的顺序是大分子的先出柱,小分子的后出柱。由于糖分子与凝胶间的相互作用,洗脱液的体积与蛋白质的分离有很大的差别。在多糖分离时,通常是用孔隙小的凝胶如sephadex G-25、G-50等先脱去多糖中的无机盐及小分子化合物,然后再用孔隙大的凝胶sephadex G-200等进行分离。凝胶柱层析法不适合于粘多糖的分离。
亲和层析 用凝聚素(一般是蛋白质和糖蛋白)做亲和色谱来分离多糖。
高压液相层析
2.2.5 制备性区域电泳 分子大小、形状及所负电荷不同的多糖其在电场的作用下迁移速率是不同的,故可用电泳的方法将不同的多糖分开,电泳常用的载体是玻璃粉。具体操作是用水将玻璃粉拌成胶状、柱状,用电泳缓冲液(如0.05mol/L硼砂水溶液,PH9.3)平衡3天,将多糖加于柱上端,接通电源,上端为正极(多糖的电泳方向是向负极的),下端为负极,其单位厘米的电压为1.2-2V,电流30-35MA,电泳时间为5-12小时。电泳完毕后将玻璃粉载体推出柱外,分割后分别洗脱、检测。该方法分离效果较好,但只适合于实验室小规模使用,且电泳柱中必须有冷却夹层。
2.2.6 金属络合物法 常用的络合剂有费林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。
2.2.7 其它方法:纯化除采用上述方法外,还有超过滤法(多糖溶液通过各种已知的超过滤膜就能达到分离)、活性炭柱色谱。另据报道,国外多采用的LKB柱色谱系统,用比旋度、示差折射及紫外检测多糖,各组分的峰位自动记录,分离效果好且方便。
2.3 多糖纯度的鉴定
2.3.1超离心法 由于微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度、大小和形状有关,故当将多糖溶液进行密度梯度超离心时,如果是组分均一的多糖,则应呈现单峰。具体的做法是将多糖样品用0.1molNaCl或0.1molTris盐缓冲溶液配制成1%-5%的溶液,然后进行密度超离心,待转速达到恒定后(通常是60000r/min),采用间隔照明的方法检测其是否为单峰。
2.3.2高压电泳法 由于中性多糖导电性差、分子量大、在电场中的移动速度慢,故常将其制成硼酸络合物进行高压电泳。多糖的组成不同、分子量不同,其与硼酸形成的络合物就不同,在电场作用下的相对迁移率也会不同,故可用高压电泳的方法测定多糖的纯度。通常高压电泳所用的支持体是玻璃纤维纸、纯丝绸布、聚丙酰铵凝胶、纤维素醋酸酯薄膜等。缓冲液是PH9.3-12的0.03-0.1mol的硼砂溶液,电压强度约为30-50V/cm,时间是30-120min。由于电泳时会产生大量的热,所以要有冷却系统,将温度维持在0℃左右,否则会烧掉支持体。一般单糖、低聚糖因醛基而发生的颜色反应在多糖上不明显,电泳后常用的显色剂是p-茴香胺硫酸溶液(p-anisidine)和过碘酸希夫试剂等。
2.3.3凝胶柱层析 常用的凝胶是Sephadex、Sepharose、Sephacryl,展开剂为0.02-0.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶与0.02醋酸1:1的缓冲溶液,柱高和柱直径之比大于40。
2.3.4旋光测定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度为10%左右,离心得沉淀。上清液再加入乙醇使其浓度为20%-25%,离心所得二次沉淀,比较二次沉淀的比旋度。如果比旋度相同则为纯品,否则为混合物。
2.3.5其它方法:官能团摩尔比恒定法,即如为纯品两次分离所得产物的官能团如-COOH、-NH2、-SO3H、-CHO等摩尔比应该恒定。类似的方法还有示查折射法、HPLC法等。此外德国常用高压液相法来检测多糖纯度,结果可靠。
必须注意的是:纯度检查一般要求有上述两种方法以上的结果才能肯定。