阴离子交换柱防止核酸

⑴ 蛋白质、核酸等生物大分子为何能用离子交换色谱分离

因为他们来都带电荷啊，因为源你柱子上有相反的离子啊，他们可以通过离子键相互作用啊！
同时的柱子有孔径啊，可以将小的直接溜走，没有机会结合啊
可以让大的下来的更慢啊！

你满意不！

⑵ 在本实验中使用了有机溶剂纯化多糖，有其他替代的试剂或方法吗

多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是由个以上的单糖通过苷键连接而成的，具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[10]，黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能[3-5]。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射，增强免疫功能等生物学作用[6]，麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用[7-8]，动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能[11]。
另外，多糖作为药物，其毒性极小，因而多糖的研究已引起人们极大的兴趣。
由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又是相当复杂的，所以在这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。
1. 多糖的提取[12]
1.1 热水浸提法：
1.1.1多糖提取条件的优选
根据文献报道[13]：影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选，才能选出最佳提取方案。
1.1.2其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥
首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）。干燥后可得粉末状的粗多糖。
1.2 微波辅助提取法：
其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中[14]。
由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清[15]。
聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。
1.3 超声辅助法：
其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。
超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]。
1.4 索氏提取法：
将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃干燥，称重。
1.5 醇提法：
先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4℃冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。
醇提法方法简单，易于操作，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用。
1.6 其它方法：
多糖的提取方法还有稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由于稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，因而很多试验中避免采用稀碱液浸提法和稀酸液浸提法。
2. 多糖的纯化
2.1 多糖中杂质除去方法 粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质，必须分别除去。
2.1.1 除蛋白质
采用醇沉或其它溶剂沉淀所获得的多糖，常混有较多的蛋白质，脱去蛋白质的方法有多种：如选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣质等试剂来处理，但用酸性试剂宜短，温度宜低，以免多糖降解。常用的方法有[19]：
2.1.1.1 沙维积法（Sevag法）[20]：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂变性而不溶与水的特点，将多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比调为25:5:1或25:4:1，混合物剧烈振摇20到30分钟，蛋白质与氯仿－戊醇（或正丁醇）生成凝胶物而分离，然后离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法较温和，在避免降解上有较好效果，但效率不高，如五味子多糖的提取实验中要重复处理达三十几次。并且每次除去蛋白质变性胶状物时，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白，在处理时会沉淀下来，造成多糖的损失。如能配合加入一些蛋白质水解酶，再用Sevage法效果更佳。
2.1.1.2 三氟三氯乙烷法[21]：多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌10min左右，离心得上面水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液，此法效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。
2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5％－30％三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊为止，在5－10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多糖的降解。
Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三种方法均不适合糖肽，因糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来。对于对碱稳定的糖蛋白，在硼氢化钾存在下，用稀碱温和处理，可以把这种结合蛋白质分开[1]。
2.1.1.4 酶解法[22]：在样品溶液中加入蛋白质水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等，使样品中的蛋白质降解。通常将其与Sevag法综合使用除蛋白质效果较好。
2.1.1.5 盐酸法[23]：取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其PH至3，放置过夜，在3000r/min条件下离心，弃去沉淀，即脱去蛋白质。
另有李知敏[23]和叶将瑜[25]等人分别在植物多糖实验中证明：盐酸法、三氯乙酸法及Sevag法脱蛋白率分别为72.5％、46.1％和42.3％，多糖的损失率分别为15.1%、6.1％和14.3％。盐酸法脱蛋白率高，但多糖的损失率也较高;三氯乙酸法较温和，但除蛋白效率不高；Sevag法的脱蛋白效果不及前两种。
2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和饱和Ba（OH）2溶液，振荡后离心去蛋白。此法除蛋白不够彻底，可结合Sevag法使用。还可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉淀完全，在4000r/min的条件下离心10min，收集上清液，即为除蛋白液。还有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白，将混合液清摇，再静置，取上清液。此过程需重复多次方可除尽蛋白。
除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验，观察在280mm处是否有吸收，如果无吸收则表明蛋白质已经除尽[24]。
2.1.2 除色素
2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素[12]：活性炭属于非极性吸附剂，有着较强的吸附能力，特别适合于水溶性物质的分离。它的来源充足，价格便宜，上柱量大，适用于大量制备性分离。目前用于色谱分离的活性炭主要分为粉末状活性炭、颗粒状活性炭、锦纶活性炭三种。一般情况下，尽量避免用活性炭处理，因为活性炭会吸附多糖，造成多糖的损失。
2.1.2.2对于植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这类色素大多呈负性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA－7来吸附色素。
2.1.2.3若糖和色素时结合的，易被DEAE纤维素吸附，不能被水洗脱，这类色素可进行氧化脱色：以浓氨水或NaOH液调至PH8.0左右，50℃以下滴加H2O2至浅黄色，保温2小时。
2.1.2.4 依次用丙酮、无水乙醚和无水乙醇洗涤多糖，即可得到较为纯净的多糖。此法较为简单，便于操作，多糖损失也较小。
2.1.2.5 用4:1的氯仿-正丁醇除色素。操作简单，多糖有一定损失。
2.1.2.6发酵来源的多糖颜色一般较浅，色素含量较少，一般可不除色素。
2.1.2.7对于动物，微生物等提取得到的多糖也可根据不同情况按上述方法处理。
2.1.3 除低聚糖等小分子杂质
2.1.3.1采用逆向流水透析法。即准备好一桶蒸馏水，用一根导管将水通入透析袋的烧杯底部，另用一根导管将水引出，根据水量控制流速，使水缓慢流动48小时。这样得到的就是多糖的半精品。
2.1.3.2利用溶液浓度扩散效应，将分子量小的物质如无机盐、低聚糖等从透析袋渗透到袋外的蒸馏水中，不断换水即可保持浓度差，从而除尽小分子杂质。具体的做法是根据多糖溶液的体积截取相应长度的透析袋，用透析夹夹住一端，灌入多糖液，离液面2－3cm处夹紧透析袋，置于一大烧杯中，注入蒸馏水至完全浸没透析袋后，用磁力搅拌器慢速搅拌，每12小时换一次水，重复3－4次。
2.2 多糖的纯化方法 纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种：
2.2.1 分部沉淀法 根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为了多糖的稳定，常在pH7进行，唯酸性多糖在pH7时－COOH是以－COO` 离子形式存在的，需在pH2－4进行分离，为了防止苷键水解，操作宜迅速。此外也可将多糖制成各种衍生物如甲醚化物、乙酰化物等，然后将多糖衍生物溶于醇中，最后加入乙醚等极性更小的溶剂进行分级沉淀分离。
2.2.2 盐析法 在天然产物的水提液中，加入无机盐，使其达到一定浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出，与其它水溶性较大的杂质分离。常做盐析的无机盐的有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。
2.2.3 季铵盐沉淀法 季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离。通常季胺盐及其氢氧化物并不与中性多糖产生沉淀，但当溶液的PH增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高时，也会与中性多糖形成沉淀。常用的季铵盐有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氢氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的浓度一般为1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可从中性多糖中沉淀出来，所以控制季铵盐的浓度也能分离各种不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9，而且不能有硼砂存在，否则中性多糖将会被沉淀出来。
2.2.4 柱层析：包括纤维素柱层析、纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和层析、高压液相层析和其它柱层析。如用活性炭及硅胶做载体的柱层来分离多糖；或用硼砂型的离子交换树脂分离中性多糖。
纤维素柱层析 纤维素柱层析对多糖的分离既有吸附色谱的性质，又具有分配色谱的性质，所用的洗脱剂是水和不同浓度乙醇的水溶液，流出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最后出柱，与分级沉淀法正好相反。
纤维素阴离子交换柱层析 最常见的交换剂为DEAE－纤维素（硼酸型或碱型），洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。此方法目前最为常用。它一方面可纯化多糖，另一方面还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝胶柱层析 凝胶柱层析可将多糖按分子大小和形状不同分离开来，常用的凝胶有葡聚糖凝胶（sephadex G）、琼脂糖凝胶（sepharose bio－gel A）、聚丙烯酰胺凝胶（bio－gel P）等，常用的洗脱剂是各种浓度的盐溶液及缓冲液，但它们的离子强度最好不低于0.02。出柱的顺序是大分子的先出柱，小分子的后出柱。由于糖分子与凝胶间的相互作用，洗脱液的体积与蛋白质的分离有很大的差别。在多糖分离时，通常是用孔隙小的凝胶如sephadex G－25、G－50等先脱去多糖中的无机盐及小分子化合物，然后再用孔隙大的凝胶sephadex G－200等进行分离。凝胶柱层析法不适合于粘多糖的分离。
亲和层析 用凝聚素（一般是蛋白质和糖蛋白）做亲和色谱来分离多糖。
高压液相层析
2.2.5 制备性区域电泳 分子大小、形状及所负电荷不同的多糖其在电场的作用下迁移速率是不同的，故可用电泳的方法将不同的多糖分开，电泳常用的载体是玻璃粉。具体操作是用水将玻璃粉拌成胶状、柱状，用电泳缓冲液（如0.05mol/L硼砂水溶液，PH9.3）平衡3天，将多糖加于柱上端，接通电源，上端为正极（多糖的电泳方向是向负极的），下端为负极，其单位厘米的电压为1.2－2V，电流30－35MA，电泳时间为5－12小时。电泳完毕后将玻璃粉载体推出柱外，分割后分别洗脱、检测。该方法分离效果较好，但只适合于实验室小规模使用，且电泳柱中必须有冷却夹层。
2.2.6 金属络合物法 常用的络合剂有费林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。
2.2.7 其它方法：纯化除采用上述方法外，还有超过滤法（多糖溶液通过各种已知的超过滤膜就能达到分离）、活性炭柱色谱。另据报道，国外多采用的LKB柱色谱系统，用比旋度、示差折射及紫外检测多糖，各组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。
2.3 多糖纯度的鉴定
2.3.1超离心法 由于微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度、大小和形状有关，故当将多糖溶液进行密度梯度超离心时，如果是组分均一的多糖，则应呈现单峰。具体的做法是将多糖样品用0.1molNaCl或0.1molTris盐缓冲溶液配制成1％－5％的溶液，然后进行密度超离心，待转速达到恒定后（通常是60000r/min），采用间隔照明的方法检测其是否为单峰。
2.3.2高压电泳法 由于中性多糖导电性差、分子量大、在电场中的移动速度慢，故常将其制成硼酸络合物进行高压电泳。多糖的组成不同、分子量不同，其与硼酸形成的络合物就不同，在电场作用下的相对迁移率也会不同，故可用高压电泳的方法测定多糖的纯度。通常高压电泳所用的支持体是玻璃纤维纸、纯丝绸布、聚丙酰铵凝胶、纤维素醋酸酯薄膜等。缓冲液是PH9.3－12的0.03－0.1mol的硼砂溶液，电压强度约为30－50V/cm，时间是30－120min。由于电泳时会产生大量的热，所以要有冷却系统，将温度维持在0℃左右，否则会烧掉支持体。一般单糖、低聚糖因醛基而发生的颜色反应在多糖上不明显，电泳后常用的显色剂是p－茴香胺硫酸溶液（p－anisidine）和过碘酸希夫试剂等。
2.3.3凝胶柱层析 常用的凝胶是Sephadex、Sepharose、Sephacryl，展开剂为0.02－0.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶与0.02醋酸1：1的缓冲溶液，柱高和柱直径之比大于40。
2.3.4旋光测定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度为10％左右，离心得沉淀。上清液再加入乙醇使其浓度为20％－25％，离心所得二次沉淀，比较二次沉淀的比旋度。如果比旋度相同则为纯品，否则为混合物。
2.3.5其它方法：官能团摩尔比恒定法，即如为纯品两次分离所得产物的官能团如－COOH、－NH2、－SO3H、－CHO等摩尔比应该恒定。类似的方法还有示查折射法、HPLC法等。此外德国常用高压液相法来检测多糖纯度，结果可靠。
必须注意的是：纯度检查一般要求有上述两种方法以上的结果才能肯定。

⑶ 简述核酸分离的基本 原理

通过机械磨碎细胞或加入表面活性剂裂解细胞使内容物提取出来，再加入蛋白变性剂变性沉淀蛋白质。最后靠核酸在醇溶液中溶解度下降的特点提取纯的核酸。

⑷ 用于测定蛋白大分子的离子色谱柱是阴离子还是阳离子色谱柱

高效色谱柱可以通过阴阳离子交换色谱方式进行分析和分离生物分子的。在任何一种离子交换模式下，产品既有甲基丙烯酸基体，又有硅胶基体的色谱柱。蛋白质、多肽、DNA和寡核苷酸衍生出来的RNA以及其它的核酸片断是TSK-GE阴离子交换分析和分离的典型样品。
我公司提供分析柱（4.6和7.5mm内径）和半制备柱（21.5和55mm内径）。颗粒范围从快速质量控制和工艺检测的2μm到工艺规模分离的20μm大型颗粒。由于阴离子交换柱是基于聚苯烯基体材料，他们最适合用于分析小分子量的糖类氨基酸类、核酸碱基，以及小的备选药物。

TSK-GEL 离子交换色谱柱特性及优点

TSK-GEL 阳离子交换色谱柱特点：

TSKgel BioAssist S 色谱柱具有独特的孔结构和结合特性，对中到大分子量的蛋白质具有较高的结合容量。
BioAssist 色谱柱有内径为4.6mm或者10mm的PEEK 材质，也有分析，半制备和制备应用的玻璃柱和不锈钢柱。
TSKgel CM-3SW 色谱柱具有小孔径和较大的表面积，对小到中等分子量的蛋白质的结合量近似为TSKgel CM-5PW色谱柱的两倍。
TSKgel SP-5PW有内径为2mm的色谱柱，可应用于LC-MS分析。

⑸ 生物分离高手进

这写起来复杂了....... 很多地方都有这样的实验步骤啊，我看了一下 下面这个，还可以
酶的分离简单，就是麻烦，时间挺长的

酶的分离纯化方法简介
生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。

酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍：
一、预处理及固液分离技术
1.细胞破碎（cell disruption）
高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。要达到90%以上的细胞破碎率，起码要将菌悬液通过均质器两次。最好是提高操作压力，减少操作次数。但有人报道，当操作压力达到175Mpa时，破碎率可达100%。当压力超过70Mpa时，细胞破碎率上升较为缓慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。丝状菌会堵塞均质器的阀门，尤其高浓度菌体时更是如此。在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。
容菌酶处理法：蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。具体做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化钠溶液中，使细胞浓度为5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清处理20min，得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去，再将乙醇浓度提高到75%（体积分数），可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500g。
2.离心
离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型，所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔，壁上有过滤介质，一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离，如发酵液中的菌体，用盐析法或有机溶剂处理过的蛋白质等。分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差别的乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。
在生物领域采用的离心机系统，除了应具备离心机的一般要求外，还应满足生物生产的技术要求，这包括灭菌、冷却、密封，以保证产品不受污染并不污染环境。现代哦离心机装置包括以下三个步骤，并进行程序控制：离心、离心系统的灭菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司离心机产品的装置，具有双重轴向密封，密封由装在转筒主轴上下的碳化硅动环和固定环组成，密封由水连续冷却和润滑，可防止产品被污染，也可防止生产过程中排出的废物对环境的污染。该离心机又如一个密闭的压力容器，可在121℃温度下进行蒸汽灭菌，该离心设备设有环绕离心机转筒的冷却夹套，对悬浮液和浓缩的固体都能进行充分的冷却，并能有效地控制温度，这对于生物制品是非常重要的。如BTPX205型离心机可用于细胞收集、培养液的净化和细胞碎片的分离，可用于疫苗、酶制剂等的提取。该机的其他辅助系统及控制系统也较为完善，如设有压力指示器、力量计、温度传感器和液面传感器。
3.膜分离技术
在蛋白质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。在静压作用下降溶液通过孔径非常小的滤膜，使溶液中分子量较小的溶质透过薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在一起而组成的。功能膜决定了膜的孔径，而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。超滤浓缩的优点是：操作条件温和，无相变化，对生物活性物质没有破坏。
超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成，料液经泵打入超滤器，水及低分子量物质排出超滤器外，被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器中循环。当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一步处理的浓缩料液。
超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问题：第一，在超滤循环过程中，由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用，料液的温度会逐渐升高，会造成蛋白质分子的损失。因此，料液贮罐应加冷却系统，并安装自动测温及控制系统。第二，某些酶的辅助因子散失为问题：一些酶含有辅助因子，其分子量小，超滤时易从透过液中排除掉，因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因子。
还可将超滤与亲和层析相结合以提高分离纯度。其工作原理是：当溶液中欲被分离的蛋白质不受阻碍地通过超滤膜的孔隙时，如果在膜的一侧结合着亲和配基，该蛋白质就会与配基结合因而结聚在膜的这一侧。不与配基结合的其他物质就将穿过孔而被带走。再用适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下来，洗脱液用于进一步的分离纯化。
4.泡沫分离
原理：将气体通入含多种组分的溶液中，由于这些组分的表面活性由差异，因此在溶液的表面，某些组分将形成泡沫，泡沫的稳定性取决于操作条件及溶液的生物学特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的组分种类及其含量与溶液中的不相同。这样，溶液中的组分舅得以分离。
蛋白质较易吸附与气液界面，这有利于其结构的稳定。泡沫分离过程是：蛋白质从主体溶液中扩散到气液界面，该过程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子发生重排，一般认为在空气-水界面会形成两种类型的膜，一种是稀膜，另一种是浓膜，可能会发生由多个分子聚集在一起的现象。在气液界面形成的蛋白质膜可以是单层的也可以是多层的。膜的类型取决于主体溶液及气液界面上蛋白质的特性、结构和浓度。
泡沫分离的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白质的浓度/最初溶液中蛋白质浓度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白质的提取率/最初的蛋白质质量），或使多组分混合物中某一组分的分配系数最大。

二、抽提
沉淀
1. 盐析
常用的盐析剂是硫酸铵，其溶解度大、价格便宜。硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强，其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来。对酶没有破坏作用。
pH的控制：应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑，在酶等电点时其溶解度最小易沉淀，但有些酶再等电点时稳定性较差，因此要选择最佳pH值.一般要求在酶最稳定的pH值的前提下再考虑最适宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦确定最佳pH值后，在添加硫酸铵之前甲酸或碱调节好酶液的pH值，要尽量避免溶液pH值的波动以免破坏酶的稳定性。在添加硫酸铵时要注意搅拌，并注意硫酸铵的加入速度，一般是由少到多，缓慢加入，硫酸铵尽可能磨成细粉。
温度的控制：有些酶在较高温度下稳定性能较好，可在常温下进行盐析操作，而对于大多数酶，尽可能在低温下操作。
酶液的净置：加完硫酸铵后，酶液要静置一段时间，使酶蛋白完全沉淀下来，酶静置后，就不要再加以搅拌。
2．有机溶剂沉淀
有机溶剂选择：可用于酶蛋白沉淀的有机溶剂包括醇类物质等，如甲醇、乙醇、异丙醇。乙醇的亲水性能较好，可防止蛋白质的变性，酶蛋白在其中的溶解度也较低。
有机溶剂沉淀操作：有机溶剂一般都使蛋白质变性，当温度较高时变性蛋白质分子就会变成永久失活。因此用有机溶剂处理时最好在0℃以下进行。用有机溶剂沉淀得到的酶蛋白不要放置过久，要尽快加水溶解。
3.聚合物絮凝剂沉淀
聚合物絮凝剂，如葡聚糖和聚乙二醇，与酶分子争夺水分子，具有脱水作用使酶沉淀。聚乙二醇作为一种沉淀剂的优点是在水溶液中，其浓度可达到50%，浓度为6%-12%的蛋白质大都可以沉淀下来。这种试剂不需要低温操作，而且对蛋白质的稳定还有一定的保护作用。聚乙二醇不会被吸附，故在离子交换吸附前不必去除。
4．用金属离子和络合物沉淀
酶和其他蛋白质都会形成金属盐，其溶解度较低。用金属离子沉淀的缺点是酶与金属离子相互作用后，可逆变化较差，尤其是用巯基衍生物，它结合的]金属离子会催化酶变性而失活。
5．用特殊试剂沉淀法
用链霉素可选择性去除核酸，从而使胞内酶沉淀出来。链霉素盐（浓度为0.5-1.0mg/mg蛋白质）对于选择性沉淀核酸的效果比锰离子还要好，酶不易失活。
6．亲和沉淀
将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量、地选择性有机结合形成了亲和沉淀技术。将配基与可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物，该复合物与生物分子结合后在一定条件下可以沉淀出来。
配基-载体复合物可以选择性地与蛋白质结合，溶液中的pH值、离子强度及蛋白质浓度等条件对亲和结合的影响力并不大，只有竞争性的配基会降低产物与原配基的亲和结合力，甚至使亲和结合发生逆转。
引导产生沉淀的方法有：离子交联；加入带相反电荷的聚合物；加入带相反电荷的疏水基团；改变pH值，诱导产生疏水沉淀；温度诱导产生沉淀。
亲和结合：将亲和配基加入到含有目的物蛋白质的溶液中，调节好有关沉淀的条件，使之有利于亲和结合。
洗涤：为经过处理的粗制液中发生亲和沉淀可能会发生非特异性结合，尤其是使用带电的聚合物，离子交换的效应将使其他蛋白质共同沉淀，因此在分离目的物之前要洗涤沉淀物。其做法是：加入适当的清洗剂重新溶解沉淀，再沉淀；或在专一性洗脱之前，彻底清洗沉淀。在上述过程中要始终保持目的蛋白质与配基处于亲和结合状态。
配基-载体复合物与目的蛋白质的分离：分离结束之后，要确保回收目的蛋白质和配基-载体复合物，目的蛋白质要达到一定的纯度，回收率要高。

⑹ DEAE纤维素柱的原理

DEAE纤维素柱原理，基于离子交换层析：离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。

阴离子交换基质结合，带有负电荷的蛋白质，然后这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质从而洗脱下来。

(6)阴离子交换柱防止核酸扩展阅读：

基本信息：

性状：干燥纤维状。

用途：用于柱色谱分析，用以分离提纯多糖、肽、核苷酸、酶、血清组分和病毒等，阴离子交换填料。

保存：常温干燥封袋保存。

DEAE—纤维素的使用方法：

称取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。

抽干，改用0.5mol/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。再改用0.5mol/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。

⑺ 蛋白纯化怎么去除核酸

1、根据所选蛋白的性质，选择合适的介质和条件，想办法把蛋白结合在内柱子上，（有tag的话用这容个方法最好了），然后用高盐（0.5-3M NaCl）洗，一般会洗下来一个峰，就是被洗下来的核酸了。
2、试试在高盐条件下加Mn2+，因为高盐可以让核酸和蛋白分离，而Mn2+对核酸沉淀有一定的效果。
但是要十分小心的是，这类蛋白本身的天然性质就是要结合核酸的，有的时候核酸去除干净了，蛋白也沉淀了，所以没那么容易，很多小条件要结合所选的蛋白自己去摸索。

⑻ 硫酸钙溶度积的测定

难溶强电解质溶度抄积常数Ksp的测定一、 实验目的1、 了解极稀溶液浓度的测量方法;2、 了解测定难溶盐Ksp的方法;3、 巩固活度、活度系数、浓度的概念及相关关系。二、 实验原理 在一定温度下，一种难溶盐电解质的饱和溶液在溶液中形成一种多项离子平衡，一般表示式为:这个平衡常数Ksp称为溶度积常数，或简称溶度积，严格地讲Ksp应为相应个离子活度的乘积，因为溶液中个离子有牵制的作用，但考虑的难容电解质饱和溶液中离子强度很小，可警世的用浓度来代替活度。就AgCl而言 从上式可知，若测出难溶电解质饱和溶液中个离子的浓度，就可以计算出溶度积Ksp。因此测量最终还是测量离子浓度的问题。若设计出一种测量浓度的方法，就找到了测量Ksp的方法。具体测量浓度的方法，包括滴定法(如AgCl溶度积的测定)，离子交换法(如CuSO4溶度积的测定)，电导法(如AgCl溶度积的测定)，离子电极法(如氯化铅溶度积的测定)，电极电势法(Ksp与电极电势的关系)，即分光光度法(如碘酸铜溶度积的测定)等