离子交换柱蛋白质提纯

① 设计一个ph稳定范围已知的蛋白分离纯化实验，利用那个类型的离子交换柱

如果不限定纯化方法，可以考虑亲和层析或离子交换，但根据你问题的意思，是选定内离子交换。容
此时就要考虑你蛋白的等电点了，如果等电点在你稳定pH之上，就用阳离子交换柱：
设计阳离子交换层析：将你的样品置换到你所指的稳定pH的running buffer。同时装柱，平衡，然后上样，平衡，洗脱（因为你的pH不稳定，建议盐洗脱），收峰。得你的蛋白；
如果你的等电点在稳定pH之下，就用阴离子交换柱，其步骤如上，只是改变柱子类型。

② 蛋白质分离提纯方法

1、盐析法：

盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。

2、有机溶剂沉淀法：

有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。

3、蛋白质沉淀剂：

蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。

4、聚乙二醇沉淀作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。

(2)离子交换柱蛋白质提纯扩展阅读：

吸附层析

1、吸附柱层析

吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。

2、薄层层析

薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。

3、聚酰胺薄膜层析

聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。

层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。

③ 蛋白质提取分离纯化鉴定的实验方案

一.血清ǐ-球蛋白的初步提取
1. 血细胞与血清分离：
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm离心20min .弃沉淀,留上清备用(沉淀为血细胞，上部为血清).
2. 乳糜粒分离：4000rpm 10°C离心10分钟,采用密度梯度离心
梯度液配置：离心管下部3/4容积加血浆，上部1/4容积加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮，将乳糜粒吸出,留其余液体备用。
3. 血清蛋白分离：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白质。
5000rpm 10°C离心1h,密度梯度离心
梯度.液配置：管容量1/3为血清，2/3为1。31g/ml,NaCl+NaBr,搅拌后终密度为1。21g/ml .管上部1/6容积为血清脂蛋白，下部5/6为其它蛋白。
4.取2ml下部5/6血清于小试管中,加0.9％氯化钠溶液2.0ml，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml，加入PBS洗脱液2ml,混匀后于室温中放置10min，此步骤可重复1～2次
3000rpm 离心5min.沉淀物即是ǐ-球蛋白.
二.凝胶层析提纯血清ǐ-球蛋白(1)装柱：海绵垫装入玻璃柱底端,作为柱底支持物,装入定量的蒸馏水(约为柱体积的1/5),以避免胶粒直接冲击柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.将密实洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。边搅拌凝胶,边向柱内缓慢,连续,均匀地加入凝胶,(打开柱底端的螺旋夹)不要中断,使胶粒均匀沉降,以免胶面一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部倾斜和发生断层;检查装好的凝胶柱用眼观察有无凝胶分层.沟流和气泡现象.最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。用缓冲液平衡凝胶柱,流速控制在3-5s/滴.(2)上样与洗脱：小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析法制备的球蛋白混合样品，将装有上样液的滴管头插入床面以上1-2cm处,小心缓慢地贴壁加到凝胶床表面。柱上样量控制在柱体积的2%-5%.打开下端出口，将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。(3)洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底)，按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加双缩脲2滴，出现蓝色混浊即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂l滴，以观察NH4+出现的情况。 合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。三．纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度，并用0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20％磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。四．浓缩经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ－球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定，常需浓缩。收集较浓的纯化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干胶，摇动2～3min， 3000r／min 离心5min。上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。五. 乙酸纤维素薄膜电泳鉴定ǐ-球蛋白(一)仪器与薄膜的准备1.醋酸纤维素薄膜的润洗与选择用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿中，若漂浮于液面的薄膜在15—30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以免影响电泳结果。将选好的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后，方可用于电泳。
2.电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。
3.电极槽的平衡用平衡装置(或自制平衡管)连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15——20min。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。
(二)点样
1.制备点样模板取一张干净滤纸(10×10cm)，在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。
2.点样用竹夹子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上，使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm处。点样时，先用玻璃棒或血色素吸管取2—3�0�8L血清，均匀涂在加样器上，再将点样器轻轻印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。
(三).电泳用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)，另一端平贴在阳极端支架上，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA(8片薄膜则为4.8mA)。通电10—15min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA(8片共8 mA)，电泳时间约50—80min。电泳后调节旋扭使电流为零，关闭电泳仪切断电源。
(四).染色与漂洗
1.血清蛋白染色与漂洗脱色用解剖镊子取出电泳后的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min，取出后再用漂洗液浸洗脱色，每隔10min 换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜吹干。
(五)透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不能有气泡，约2—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次，垂直放置待其自然干燥，或用吹风机冷风吹干且无酸味。再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取下，用滤纸吸干所有的水分，最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min，再用滤纸吸干液体石蜡，压平。此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。
(六)结果判断与定量血清蛋白电泳经蛋白染色后，可显示出区带，未经透明处理的电泳图谱可直接用于定量测定。可采用洗脱法或光吸收扫描法，测定各蛋白组分相对百分含

④ 离子交换柱的工作原理

离子交换柱的工作原理：
采用离子交换方法，可以把水中呈离子态的阳、阴离子去除。
以氯化钠（NaCl）代表水中无机盐类，水质除盐的基本反应可以用下列方程式表达：
1、阳离子交换树脂：R—H+Na+→R-Na+H+
2、阴离子交换树脂：R—OH+CL-→R-CL+OH+
阳、阴离子交换树脂总的反应式即可写成：
RH+ROH+NaCL—RNa+RCL+H2O
由此可看出，水中的Nacl已分别被树脂上的H+和OH-所取代，而反应生成物只有H2O，故达到了去除水中盐的作用。
离子交换柱（ion exchange column）是用来进行离子交换反应的柱状压力容器。充填有离子交换树脂的细长管柱。可由玻璃、不锈钢、有机玻璃等不被所用的流动相腐蚀的材料制成。离子交换柱（混床）的分类：混床按再生方式分可分为体内再生混床、体外再生混床、阴树脂外移再生混床三种。
离子交换柱的分类：
混床按再生方式分可分为体内再生混床、体外再生混床、阴树脂外移再生混床三种。
1、体外再生混床适合小流量、对环保有严格要求的企业。但由于体外再生式混床配套设备多，操作复杂，现在已很少使用。
2、体内再生混床和阴树脂外移再生混床适合大流量，有专门的水处理操作人员及废水处理的场合。体内再生混床在运行及整个再生过程均在混床内进行，再生时树脂不移出设备以外，且阳、阴树脂同时再生，因此所需附属设备少，操作简便。
3、阴树脂外移再生混床：阴树脂外移再生式混合床及其配套的阴树脂再生柱基本构造与小型逆流再生固定床大致相同，阴树脂再生柱厚度较混合床小，所需的膨胀高度为树脂层高度的50%～60%，故再生柱可较低，但一般为统一起见做成与混合床相同。

⑤ 蛋白质纯化所用的柱子有几种，分别有什么作用

一、沉淀法

1、 盐析

实验原理：中和蛋白质表面电荷并破坏水化膜。

蛋白质易溶于水，因为其分子的-COOH -NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1~100 nm大小的亲水胶体，从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。当大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的 SO42- 和NH4+）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之"失水"，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。

2、等电点沉淀法：

实验原理：利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。

在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。

注意点：不同的蛋白质，具有不同的等电点。同一种蛋白质在不同条件下，等电点不同。

3、有机溶剂沉淀法

实验原理：加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低，因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。

有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀。

影响因素：(一)有机溶剂的选择 (二)温度的控制 (三)pH值 (四)离子强度

用此法析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀应立即用水或者缓冲液溶解，以达到降低有机溶剂的浓度的目的。此法在血液制品的制备过程中较多使用。

二、层析

1、离子交换柱层析

实验原理：以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。是发展最早的层析技术之一，目前已成为蛋白质分离纯化最常用的手段，是基于蛋白质电荷不同的分离技术。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

2、疏水相互作用层析

实验原理：根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。

蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。

3、亲和层析

实验原理：利用蛋白质能和某些专一分子可逆结合的特性，

当蛋白质溶液通过层析柱时，其中可与亲和载体配基相互作用的受体被吸附剂结合，不被吸附的无关成分则可随流出液通过柱体，从而将吸附蛋白与其他蛋白质分开。此法特异性强，收率高。

4、凝胶层析

实验原理：根据分子大小分离蛋白混合物的最有效的方法之一。混合物随流动相流经装有凝胶固定相的层析柱时，其中各物质因分子大小的的不同而被分离的技术。

三、离心

1、速率区带离心法

实验原理根据分离的粒子在离心力作用下，因其在梯度液中沉降速度的不同，离心后具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内，形成几条分开的样品区带，达到彼此分离的目的。

由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。容量小，只能用于少量的制备。

2、差速离心法

实验原理：利用样品中各组分沉降系数的差异，对不同的微粒施以不同的离心力，经过多次离心，离心速度逐步加大，将不同的微粒依次沉降，从而实现离心分离。

四、膜分离

1、超滤法

是利用加压膜分离技术，在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜，大分子溶质滞留，从而使大分子物质得到部分的纯化。常和离子交换，凝胶过滤联合使用。

2、透析

是利用小分子经过半透膜扩散到水( 或缓冲液) 的原理，将无机盐等小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术，常和盐析，盐溶等方法联合使用。

⑥ 离子交换柱的工作原理是什么

离子复交换柱的原理制

采用离子交换方法，可以把水中呈离子态的阳、阴离子去除，以氯化钠（NaCl）代表水中无机盐类，水质除盐的基本反应可以用下列方程式表达：

1、阳离子交换树脂：R—H+Na+→R-Na+H+

2、阴离子交换树脂：R—OH+CL-→R-CL+OH+

阳、阴离子交换树脂总的反应式即可写成：

RH+ROH+NaCL—RNa+RCL+H2O

由此可看出，水中的Nacl已分别被树脂上的H+和OH-所取代，而反应生成物只有H2O，故达到了去除水中盐的作用。

3、混合离子交换柱（混床）：混床是装阳、阴树脂按一定比例（一般为1:2,以便阳、阴树脂同时达到交换终点而同时再生）装入混合柱而成，实际上它组合成了水中的H+和OH-立即生成电离度很小的水分子（H2O）,几乎不存在阳床或阴床交换时产生的逆交换现象，故可以使交换反应进行得十分彻底，因而混合床的出水水质优于阳、阴床串联组成的复床所能达到的水质，能制取纯度相当高的成品水。

⑦ 设计一个利用阴离子交换柱纯化一个等电点为7.5的蛋白质的实验

既然是抄阴离子交换，就要让目标蛋白带负电，那么缓冲液PH就要大于等电点。缓冲体系的选择也很重要，一般用TRIS-HCl，特别是弱阴离子柱不可选用带负电强的磷酸盐缓冲液，否则上样液中被交换的将是磷酸根而不是目标蛋白。一般用NaCl平衡后上样进行离子交换，然后再用较强的阴离子洗脱。

⑧ 怎样利用离子交换柱层析法分离不同的蛋白质

离子交换柱层析法的核心在于不同的蛋白质的等电点不同
所以说，利用离子交换柱层析法分离不同的蛋白质其实就是利用不同蛋白质不同的等电点来分离。比如目的蛋白等电点是5，那么在环境pH为8.0的情况下，目的蛋白可以结合阴离子交换层析，而杂蛋白可能不能结合或者结合能力比目的蛋白弱。通过不同的盐浓度的洗脱让结合能力不同的蛋白在不同的组分被洗脱出来，最终完成对目的蛋白和杂蛋白的分离。