1. 如何进行蛋白超滤设备选型
如何进行蛋白超滤设备选型？在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、 吸附层析
1、 吸附柱层析
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、 薄层层析
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、 聚酰胺薄膜层析
聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、 离子交换层析
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。`
三、 凝胶过滤
凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、 亲和层析
亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S')一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把围相载体装人小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰(见图6－2)。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质(如金属、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。
五、 聚焦层析
聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为 多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。
聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。
1、PH梯度溶液的形成
在离子交换层析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如，当使用阴离子 剂进行层析时，制备PH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室(这层析柱者)中装高PH溶液，而在另一室装低PH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度溶液可以自动形成。例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94(作固定相)时，先用起始缓冲液(配方见表了一2)平衡到PHg，再用含PH6的多缓冲剂物质(作流动相)的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，住内每点的PH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，但是随着淋洗的进行，PH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的PH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的PH梯度也就消失了。
2．蛋白质的行为
蛋白质所带电荷取决于它的等电点(PI)和层析柱中的PH值。当柱中的PH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的PH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。
供静脉注射的25%人胎盘血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸铵盐析法、透析脱盐、真空浓缩等工艺制备的，该工艺流程硫酸铵耗量大，能源消耗多，操作时间长，透析过程易产生污染。改用超滤工艺后，平均回收率可达97.18%；吸附损失为1.69%；透过损失为1.23%；截留率为98.77%。大幅度提高了白蛋白的产量和质量，每年可节省硫酸铵6.2吨，自来水16000吨。目前国外生产超滤膜和超滤装置最有名的厂家是美国的Milipore公司和德国的Sartorius公司。
随着现代生物技术的发展, 通过基因工程生产蛋白质药物在治疗人类面临的重大疾病如癌症等方面展示出巨大的潜力. 为满足生物技术产品工业化生产的需要, 开发高通量、低成本、高效的分离纯化方法已引起人们的高度关注. 超滤技术由于具有通量高, 操作条件温和, 易于放大等特点, 特别适合生物活性大分子的分离. 在生物技术领域, 超滤技术目前已广泛应用于细胞收集分离、除菌消毒、缓冲液置换、分级( fract ionatio n) 、脱盐及浓缩[ 1] . 近年来越来越多的研究表明, 通过选择适当的膜或膜表面改性,以及对分离过程进行优化, 充分利用和调控膜—蛋白质以及蛋白质—蛋白质之间的静电相互作用, 可以实现分子量相近的两种蛋白质的高选择性超滤分离[2- 7] .
为克服常规蛋白质超滤分离过程优化中存在的实验蛋白质消耗多、工作量大、费时以及费用高等缺点, 我们相继开发了脉冲进样技术( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和参数连续变化超滤技术( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 并以此为基础, 结合载体相超滤技术( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]进一步提出了一种蛋白质超滤分离快速优化新方法[11], 实现了人血浆白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化单克隆抗体( A lemtuzumab) 单体— 二聚体[13]的超滤分离过程快速优化和高选择性分离,并在膜的筛选及其适用性快速评估方面展现出巨大的潜力. 该方法的主要特征是与AKTA Prime 系统联用, 采用脉动进样技术显著减少了蛋白质的用量;而利用双缓冲体系( 类似梯度洗脱) 的参数连续变化超滤技术, 在pH 或离子强度连续变化的情况下考查pH 或离子强度对蛋白质透过率或截留率的影响, 进一步缩短了实验时间, 降低了蛋白质的用量,极大地减少了实验量, 加快了过程优化进程; 另外,载体相超滤技术的应用则可保证超滤分离自始至终在设定的条件下进行, 从而最大限度地保证超滤过程的稳定性.
2012-02-25
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研究蛋白质的技术手段
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随着新的技术手段不断运用于生物膜的研究，科学家发现膜蛋白...，有的蛋白质是...在磷脂双分子层中的。
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2. 柱层析原理及影响因素
柱层析总的原理，就是让目标蛋白结合在层析填料（树脂）上，然后通过特定的缓冲液将其洗脱下来，以达到纯化的效果。具体几种分类稍微归纳了下给你参考
免疫亲和层析
原理：亲和色谱分离蛋白以一个蛋白与特异性配基配对到色谱基质上，且蛋白质与配基间具有可逆的相互作用作为基础。目标蛋白与配基之间的生物学相互作用，可以是由于静电学的相互作用或是分子间疏水的相互作用，也可以是范德华力或氢键结合力产生的。
影响因素：主要是亲和标签的完整程度，缓冲液的组分。
离子交换层析
原理：离子交换对分子的分离是基于它们表面净电荷的差异。以蛋白质为例，它由许多包含弱酸弱碱集团的不同氨基酸组成。它们表面的净电荷会随着周围环境的pH值改变而改变。对某一特定蛋白质来说，其表面净电荷与pH之间的相对关系是独特的，而离子交换层析正是利用了这一特点来完成对不同蛋白质的分离。
影响因素：主要是缓冲液的pH值，盐浓度。
疏水相互作用层析
原理：疏水层析根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白质与疏水层析介质疏表面可逆的相互作用来分离蛋白。纯水状态下，任何疏水作用都太弱而不能导致配基与蛋白之间的相互作用。某些盐却可以增强疏水相互作用。高浓度的盐会增强相互作用，而低浓度的盐会降低相互作用。但是目前尚无被广泛接受的关于疏水相互作用层析机制的理论。
影响因素：环境温度，盐浓度。
凝胶过滤层析
凝胶过滤根据分子通过凝胶填料大小不同对其进行分离。以蛋白质为例，因为分子不与凝胶填料结合，故缓冲液成分不会直接影响分辨率。
影响因素：蛋白质分子量。
3. 纯化生物产品的得率是如何计算的
生物药物的提取纯化技术
第一节 概述
一、生物药物的特点及纯化方法
许多生物药物具有生物活性，其稳定性受pH,一温度、离子强终提取过程所使用的溶剂和表面活性剂、金属离子等方面的严件物药物对剪切力很敏感，分子量越大，其稳定性就越差，在甘离纯化过程中，条件就应当越温和。一些组分的浓度非常低。但是生物药物产品的纯度却要求很高，含量要达到95%甚至98%以上。结晶态产品最好，药物还应具有正常的颜色、稳定性和溶解速率。
生物药物的制备，如蛋白质制备，涉及物理、化学和生物学知识。其主要原理有两个方面：一是利用混合物中组分分配率差别，把它们分配于可机械分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，经物理力场作用使各组分分配于不同区域而达分离目的，如电泳、超离心、超滤等。相互分离主要利用蛋白间各种性质的微小差别,诸如分子形状、分子量大小、带电性质、溶解度、生物功能专一性等，制备方法可按这些主要因素进行分类。按分子大小和形态分差速离心、超滤、分子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等；按电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性有亲合层析法等。
蛋白分离纯化比较困难。需要研究目的物质的微细特征，巧妙联用各种方法并进行严密的操作，并有必要了解精制过程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白可利用吸收光谱等物理性质或以相当于单位氮活性增加进行追踪；其他蛋白可用电泳、超离心、层析、扩散及溶解等测定纯度；不稳定蛋白，如分离SH-酶时，使用试剂及缓冲液等要确认不含重金属离子（特级试剂也需检定）。
蛋白质纯化的操作如脱盐、浓缩干燥等均与低分子物不同，须经独特的繁琐操作。
提纯蛋白和酶时常混有核酸或多糖，一般可用专一性酶解、有机溶剂抽取及选择性部分沉淀等法处理。小分子物质常在制备中经多次液相与固相转化被分离或最后用透析法除去。而同类物质分离，情况则复杂得多。主要采用盐析、有机溶剂沉淀，等电点沉淀、吸附、结晶、电泳、超离心及柱层析法等。其中，盐析、等电点及结晶法用于蛋白质和酶的提纯较多；有机溶剂抽提和沉淀用于核酸提纯较多；柱层析、梯度离心对蛋白和核酸的提纯应用十分广泛。
蛋白分离纯化方法很多。 Bonnerjea 等人对有关蛋白和酶的分离纯化方法及其特征进行了分析，发现主要有10种方法，它们的出现频率为：
离子交换 75%
亲和过程 60%
沉 淀 57%
凝胶过滤 50%
其 它 <33%
目前尚无一种方法可用以纯化各种蛋白质，但每种蛋白质都可设法分离纯化。选择纯化方法，需要考虑到纯度、活性、得率等。
二、提取纯化的单元操作和基本工艺流程
生物药物的提取和纯化可分为5个主要步骤：预处理、固液尹离产缩、纯化和产品定型（干燥，制丸，挤压，造粒，制片）每一步骤都可采用各种单元操作。在提取纯化过程中，要尽可能减少操作步骤，因为每一操作步骤都不可避免带来损失。操作步骤多，总收率就会下降。生物药物提取工艺流程的基本模式如1-1所示。根据主要分离因素排列的单元分离范围见图1-2。
图1-1 生物药物提取工艺流程的基本模式
表1-1根据主要分离因素排列的单元分离范围
三、提取纯化单元操作技术的特点
现代生物制药领域提取纯化技术的进步得益于生化分析分离技术开拓性工作的成果汾离纯化技术的特点之一是各种技术产互交叉，新型的分离纯化方法不断涌现。如沉淀技术和亲和技梦相结合•形成了亲和沉淀技术；超滤和亲和技术相结合，形成了严和超滤技术；萃取与载体膜相结合，形成了液膜载体萃取法。这种新方法取长补短，使分离纯化过程更加科学合理、快速有效、经济实用。尽管有些方法仍处于实验室的试验阶段，要用于工业规模还需要进一步探索，有的甚至没有实用价值，但都可为今后的产展提供新的思路。
生物药物提取纯化技术的另一特点是注重新材料的研制开发如膜分离介质，层析介质，亲和配基，新型萃取剂等在最近几年来发展非常快。提取纯化设备方面推陈出新，在设备的计算机控制及生产自动化，连续化及GMP规范化等方面取得很大的成就。
膜过滤技术发展很快，分为微滤、超滤和纳滤，不仅用于细胞的分离，还用于蛋白质的浓缩。超滤技术的主要特点是节能，对生物大分子类药物无破坏作用。液一液萃取广泛应用于抗生素及小分子量药物的提取。溶剂选择的余地大，且易实现大规模生产。高速离心式液体萃取机是目前效率最高，使用最广的装置。液一液萃取技术还衍生出许多新的萃取技术，如双水相萃取，亲和萃取，超临界萃取等。双水相萃取蛋白质类药物是大规模提取高纯度蛋白质类药物的有效技术。而超临界界萃取利用超临界流体的物理特性，即通过压力和温度的改变控制溶质在溶剂中的分子扩散能助，控制溶质的溶解度，从而实现分离。
层析（色谱）技术是最近几十年来发展最快的纯化技术。层析装置的种类很多，且分离纯化机理也各不相同，适应于许多药物产品的分离纯化。离子交换色谱是应用最广，且易于实现大规模生产的方法。应用于抗生素、氨基酸、核昔酸、蛋白质的提取和纯化。分子筛层析根据分子量大小不同的原理，适应于蛋白质类药物的纯化。层析分离技术的最高层次当属基于分子识别的技术如亲和层析。这一技术已衍生出一大批新的技术，如免疫亲和层析、染料亲和层析、金属离子鳌合层析。疏水性层析是基于分子的疏水性能来分离纯化的。高效液相色谱法本是分析化学的常用手段，现已将其扩展到生物药物的分离纯化的应用中。有些设备仅可进行分析，有的还可用于分离纯化，在新药开发的过程中，缩短了分离纯化所需时间。
与层析技术同步发展的各种分离介质是层析分离的技术保障，商品化的预装柱、缓冲剂、计算机程序控制还使操作变得简单易学。置换层析与洗脱层析不同，是指吸附在层析柱上的一种组分被另一种置换剂（与层析上的介质的亲和力大于原被吸附的组分）置换出层析柱的层析技术。该技术有上样量高，分辨率高的特点。被分离的样品在分离过程中还有浓缩作用。
总之，随着科技的发展，新的分离、提取、纯化技术还将不断得到改进。
四、提取纯化的工艺论证
我国1992年修订了GMP,要求从1993年3月1日以后新建或改建的药厂，均要符合GMP的要求。1994年开始了各项验证，其中工艺论证是关键的一个不可缺少的组成部分．产品的纯化是生产过程中关键的一步。这涉及到药物的质量。所谓工艺验证，就是通过系统的方法得到关于生产工艺的书面材料，证明并保证生产过程能始终如一地生产出特定的高质量的产品。提取纯化处理工艺验证的范围包括：厂房设施、工程仪表、机械设备、生产环境、工艺条件、计算机软件、介质、原材料、半成品、成品、操作人员素质和测试方法等。以上各个部分都要有验证材料或试验数据，根据这些材料和数据写出验证报告。当工艺的某一部分有较大变动时（如大修、工艺条件变化），要进行重新验证，即再验证．再验证是针对某一部分的行动，而不是整个工艺过程的验证．因此比较简单、快速、易行。验证的实施过程包括以下步骤：提出验证要求，组织验证小组，制定验证方案，实施验证试验，写出验证报告，再验证等。
现以生物制药纯化最常用的层析工艺为例，说明验证试验的过程。首先对层析设备进行安装验证，即在不通电源的情况下，根具设备说明书查看安装是否正确，并对接线、管路连接、安放地点、输人电压等逐项检查，无误后，再进行运转试验．接通电源后，观察电机、泵、监测器、信号系统、阀、压力、温度等是否正常．泵的输出流量要经过校正，监测波长也要校正，运转3-5次后，未见漏液、气泡等，一切正常，方可正式运转。层析柱是整个层析工艺的关键设备，要根据出厂标准，逐项验证，如载体外观、颗粒大小（用显微镜测量）、柱效率、分辨率、回收率、有无污染等．如更变层析柱或层析柱填料，要对新层析柱进行重新验证。总之，工艺验证是一项技术性很强，无固定章程可循，既费力，又耗时、耗材的工作．
高科技生物药物的生产工厂，已有“交钥匙工程”。所谓交钥匙工程，就是将整个工厂组装在高强度的，便于运输的钢制建筑结构内，整个建筑要达到洁净标准，所有的生产设备和公用设施都安装到位。在用户在场的情况下，要对整个工厂进行发货前的试运转及鉴定。然后，整个工厂的生产设备和公用设施直接运输到用户的厂址，在各车间组装后，与当地的水、电、下水道等系统及仓库对接，立即就可以投人生产。
五、生物药物生产的屏蔽防护技术
(Containment technology)
一些药物，如抗癌药，往往对生物活细胞具有毒性，因此必须对中试或大生产的全过程设置屏蔽防护装置．1984年，Flickinger等就提出了中试和生产规模细胞毒素剂的安全生产装置的设计概念，其基本要求是：人员进出口要加以控制；在工作场所保持负压（一级、二级或三级生物密封室）：空气的排放必须通过HEPA过胜器；对有烟雾产生的设备要有附加的屏蔽防护装置；有适当的个人防护措施；生产过程中所排放的废物要有生物学或化学的除污方法；对工作人员进行医疗监测；环境监测。
六、纯化工艺过程的质量控制
生物药物纯化工艺技术要求高，应尽可能选用高质量的设备，并要求有清洁的各级GMP厂房。纯化方法的设计应考虑到尽可能去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白、糖及其他杂质；要防止纯化过程中带人有害物质．如采用柱层析技术纯化，应提供填料的质量认证证明(IS09001证书），并证实从柱上不会掉下有害物质。样品上样前应除热原质等。若用亲和层析技术（以单克隆抗体品作为配基），应有检测可能污染此类外源性物质的方法，不应含有可测出的异种免疫球蛋白，柱层析配制溶液用水一律用超纯水(Milli Q水）。
关于纯度的要求，可视产品的来源、用途和用法而制定，例如经反复多次使用的真核细胞表达的制品，要求纯度达到98％以上；多次使用的原核细胞表达的制品要达95％以上；外用制品的纯度可降低要求。用于健康人群或用于重症患者，对纯度要求各不相同．
纯化工艺的每一步均应测定纯度，计算提纯倍数收率等。纯化工艺过程中应尽量避免加人对人体有害的物质，若不得不加人，应设法除尽；并在最终产品中检测残留量，残留量应远远低于危害剂量，还要考虑到多次使用的积蓄作用。
附：基因工程α一型干扰素制备及质，控制要点
干扰素是一组多功能的细胞因子，分为干扰素α、干扰素β、和干扰素γ。干扰素α为多基因产物。分为许多亚型，都是由许多氨基酸残基组成的多肤。人干扰素γ是一种免疫干扰素，是由100多个氨基酸残基组成的多肽，天然产品是一种糖蛋白，两处有糖基化位点．
发酵后可用离心法或其他方法收集菌体，要求尽可能缩小操作的范围，凡接触过菌液的用具，如离心杯、转头和玻璃器皿等应浸泡新洁尔灭杀菌1h以上，才可清洗。离心后的废弃液经杀菌后才能倒人下水道。收获的菌种如在24h内破菌裂解，可放在4-80C,否则应冻存于_30'C以下的冰箱中，在一300C保存的菌体可使用6个月。将收获的菌体用适当的缓冲液做成所需浓度的均匀悬液，可用物理、化学或生物学方法进行裂解，裂解后的菌液，可用高速离心沉淀或其他适当方法分离，上清液即为粗制干扰素。不得用对人体有害的化学试剂裂解菌体，用加酶或其他蛋白裂解菌体时，应在半成品内证明此种蛋白的含量在允许的范围内，对制品安全及效果没有影响，并提供检测方法．
浓缩与纯化方法应能去除绝大部分非干扰素物质。一般要用不同原理多步骤的纯化方法，并使干扰素浓缩至一定程度，应详细说明浓缩纯化的全过程。在纯化过程中不得加人对人体有害的物质，加入的物质应能在以后的纯化过程中被去除或证明其浓度在允许的范围内，不得影响制品的安全与效果。如用异种抗体亲和层析纯化，应说明其来源及纯度，并提供此种抗体微量IgG的检测方法，在半成品检定中应测定IgG的含量，并确定允许浓度。制备注射用制品时浓缩纯化过程应特别注意去除热原质，并采取措施防止溶液、试剂和容器污染，而造成制品热原质增加。
浓缩纯化最后所得的纯化干扰素即为“半成品原液”，取样供作纯度检定后，立即加人人白蛋白，使其最终含量为2％，称为加“白蛋白半成品”，取样测定干扰素效价，保存在一300C,应尽量避免冻融，直到制剂配制时才取出融化、合并、离心、除菌过滤、制备成品，“加白蛋白半成品”在一300C下保存不得超过半年。
制剂配制：除菌过滤采用0.3μm薄膜，过滤后样品应做无菌试验，并取样测定干扰素效价，根据除菌样品的效价测定结果，将让述无菌试验合格的“加白蛋白半成品”用无菌的2 %白蛋白缓冲液稀释至所需浓度，不得加防腐剂，稀释后的“加白蛋白半成品”需做热原测定、效价测定和无菌试验。
冷冻干燥：冻干工艺应不损害干扰素的活性，并使冻干后制品的水分达到一定的标准。
基因工程干扰素分注射用和外用两种．其质量标准不同，应分别予以规定。每种制品又分为半成品和成品检定．
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5. 用聚酰胺柱色谱法分离纯化绿原酸，怎么做，就高人指点。
如果你对纯化的要求不是特别高，大约在50-60%的纯度范围内，聚酰胺应该能够满足你的需求。具体步骤如下：首先，将提取物用70%乙醇在50度进行超声提取，料液比为1:10。然后，浓缩提取液回收乙醇，并将料液冷藏沉淀。接着，过滤，滤液上聚酰胺树脂柱。使用乙醇装柱，之后用纯水冲洗树脂柱，收集10%乙醇洗脱液中的绿原酸部分，以及50%乙醇洗脱液中的黄酮部分。10%乙醇洗脱液中的绿原酸纯度大约在50%左右。
如果需要得到98%以上的纯度绿原酸，需要将10%乙醇洗脱液通过反向层析树脂SKP-20-4300，去除异构体和其他杂质。如果你只是为了进行试验，不追求高收率和高纯度，使用聚酰胺进行分离和纯化就足够了。
值得注意的是，聚酰胺柱色谱法在绿原酸的纯化过程中具有一定的优势，能够有效去除杂质，提高绿原酸的纯度。通过调整洗脱液的浓度，可以分别收集绿原酸和黄酮，从而实现较好的分离效果。
此外，聚酰胺柱色谱法在绿原酸纯化中的应用已经得到了广泛的研究和验证。该方法具有简单、操作方便、成本较低等特点，适合于实验室规模的绿原酸纯化。然而，在实际操作中，需要注意控制温度、料液比、洗脱条件等参数，以确保最佳的分离效果。
总之，使用聚酰胺柱色谱法分离纯化绿原酸是一种有效的手段，能够满足不同纯化要求。根据具体需求，可以选择合适的洗脱条件，从而获得不同纯度的绿原酸。对于试验规模的纯化，聚酰胺柱色谱法是一个不错的选择。
6. 急求~离子交换柱清洗方法
离子交换层析
Tina 发表于 2006-2-21 12:21:00
材料与仪器
DEAE-32纤维素，pH8.0 0.01 mol/L Tris-HCl，工程菌破碎离心后的上清液；
层析柱
二、 方法与步骤
1） 装柱：
用水清洗层析柱，柱内留存水距底部约1cm，加入18ml介质（凝胶溶液）。
2） 平衡：
加0.01M,PH8.0,tris-HCl缓冲液，直至流出液PH与缓冲液一致。
3） 上样：
用量筒量出上清液体积，再加入等体积缓冲液混合，取EP管留1.5ml。待柱中水流出，至刚好覆盖凝胶表面，靠璧缓慢加样。
4) 用50ml缓冲液洗涤，用EP管随机收集样品穿出液和洗涤穿出液。
5) 洗脱：
将梯度洗涤仪和层析柱连接，洗脱瓶A（混合器）加200µl缓冲液，开口打开至两瓶液面相平，相通管道出无气泡，关闭连接，A中加入6gNaCl溶解，把装置放在梯度混合仪上，开动搅拌器开关，打开A和B的连接通道，层析柱下端连收集器，收集洗脱流出液。
6） 控制流速，约4min/管，2-3ml/管。
分子筛的是凝胶层析
Sephadex G-100凝胶层析
Tina 发表于 2006-2-21 12:27:00
材料与仪器
Sephadex G-100，0.5 mol/L pH8.0 Tris-HCl，浓缩液
层析柱
二、 方法与步骤
1） Sephadex G-100 凝胶预处理
a) 100ml烧杯，称取5克sephadex G-100,加入50ml去离子水，浸泡溶胀24小时。
b) 倾去sephadex G-100溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0 mol/L NaOH液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡1小时处理后倾去。用去离子水洗涤。洗涤过程中，用倾去法除去细颗粒。其方法是用搅棒将凝胶搅匀（注意不要过分用力搅拌，以防止颗粒破碎），放置数分钟，将未沉淀的细颗粒随上层水倒掉。浮选3-5次，直至上层没有细颗粒为止，再浸泡水洗至PH中性。
c) 将Sephadex G-100凝胶水溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30分钟，除去凝胶溶液内的气泡，将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入烧杯中，其中盛有1/2去离子水。
2) 装柱
a) 层析柱(1.0Î50cm)用水清洗干净，柱的上、下端联接塑料管接上小乳胶管，装上螺旋夹。将层析柱垂直装好。校直过程用下端绑有钥匙的绳子挂于铁架的不同位置，从多角度校正使柱垂直。打开柱上端口，从柱底下出口管朝柱内注入水，使柱底全部充满水而不留气泡，关闭柱出口。最终柱内留存有2 cm的水。从出口处接上一根直径2 mm细塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。
b) 搅动凝胶溶液（切勿搅动太快，以免空气再逸入），使形成均一的薄胶浆，并立即沿玻棒倒入层析管内，让加入的凝胶在柱内自然沉降，待柱底面上积起约1-2 cm的凝胶床后，打开柱出口水流。随着柱内水的流出，上面不断加入凝胶液，使形成的凝胶床面上有凝胶连续下降（如果凝胶床面上不再有凝胶颗粒下降，应该用搅棒均匀地将凝胶床搅起数厘米高，然后再加凝胶，不然就会形成界面，影响层析效果）。
c) 凝胶沉积到柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。若层析柱不均一，必须重新装柱。
3） 平衡
柱装好后，使层析床稳定15-20分钟，然后连接洗脱瓶出口和层析柱顶端，用3-5倍体积地缓冲液平衡层析柱。平衡过程中控制上柱缓冲液地进柱操作压保持恒定。保持流速每滴/10秒。直至流出液的PH与上柱缓冲液完全相同。
4） 样品洗脱
a) 上样准备：
i) 上样前打开层析柱上端，先检查凝胶床界面是否平整，如果倾斜不平整，可用玻棒将凝胶床界面轻轻搅起后，再使凝胶自然沉降，形成平整状态的凝胶床界面。用毛细吸管小心吸去大部分清液，然后让液面自然下降，直至几乎露出凝胶床界面。
ii) 样品放入高速离心机，12000r/min、离心5 min。
iii) 上样前吸取50µl样品于EP管中，以备走电泳。
b) 样品上样：
i) 将样品由玻棒引流沿管壁加入到凝胶床面上，注意不要将床面凝胶冲起。同时打开层析柱下面流出液开关（控制流速1滴/20秒），保持层析柱下面流出滴速与上样的滴速一致，控制凝胶床界面不能脱水，并控制样品区带尽量狭窄。
ii) 当1.5ml样品全部加入后，用 1-2 ml的0.5mol/L PH8.0 Tris-HCl洗脱液同上样时一样地保持层析柱下面流出滴速与上样的滴速一致以控制凝胶床界面不能脱水，小心清洗凝胶床界面表面，使黏附着的样品全部洗入凝胶床。
iii) 然后开始控制上样的滴速大于层析柱下面流出滴速，使几乎与凝胶床界面相平的洗脱液液面慢慢提高至凝胶床界面高出2cm左右，封闭层析柱上端。
iv) 保持层析柱上柱洗脱液入口处与层析柱下面流出处有一定势压。控制上柱缓冲液的进柱操作压保持恒定。
c) 洗脱：
用0.1 mol/L PH8.0 Tris-HCl 缓冲液洗脱，用部分收集器收集，4分钟/管（约2-3ml/管），收集约1-30管。
5） 酶活、酶浓度测定，参见2.6.2，2.6.3
6） 最高酶活收集管洗脱液留50µl，以备走电泳。
7） 将酶活较高的收集液10~14管合并，测定总体积为7.1 ml，精确测定酶活性。并用考马思亮蓝测定蛋白浓度。测酶活时体系稀释了200倍，定蛋白时无稀释。
7. 离子交换柱的工作原理是什么
离子复交换柱的原理制
采用离子交换方法，可以把水中呈离子态的阳、阴离子去除，以氯化钠（NaCl）代表水中无机盐类，水质除盐的基本反应可以用下列方程式表达：
1、阳离子交换树脂：R—H+Na+→R-Na+H+
2、阴离子交换树脂：R—OH+CL-→R-CL+OH+
阳、阴离子交换树脂总的反应式即可写成：
RH+ROH+NaCL—RNa+RCL+H2O
由此可看出，水中的Nacl已分别被树脂上的H+和OH-所取代，而反应生成物只有H2O，故达到了去除水中盐的作用。
3、混合离子交换柱（混床）：混床是装阳、阴树脂按一定比例（一般为1:2,以便阳、阴树脂同时达到交换终点而同时再生）装入混合柱而成，实际上它组合成了水中的H+和OH-立即生成电离度很小的水分子（H2O）,几乎不存在阳床或阴床交换时产生的逆交换现象，故可以使交换反应进行得十分彻底，因而混合床的出水水质优于阳、阴床串联组成的复床所能达到的水质，能制取纯度相当高的成品水。