⑴ 一个关于蛋白质的问题
可以根据其特点选择适当的温度(0-4度）
选择材料及预处理
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
蛋白质的分离纯化
一，蛋白质（包括酶）的提取
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
二、蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
细胞的破碎
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。
4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
浓缩、干燥及保存
一、样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值：
膜名称
分子量截留值
孔的大的平均直径
XM－300
300，000
140
XM－200
100，000
55
XM－50
50，000
30
PM－30
30，000
22
UM－20
20，000
18
PM－10
10，000
15
UM－2
1，000
12
UM05
500
10
用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。
二、干燥
生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。
三、贮存
生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。
1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。
2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定
⑵ 制备蛋白质类制剂需注意哪些问题
可以根据其特点选择适当的温度(0-4度）
选择材料及预处理
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
蛋白质的分离纯化
一，蛋白质（包括酶）的提取
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
二、蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
细胞的破碎
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。
4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
浓缩、干燥及保存
一、样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值：
膜名称
分子量截留值
孔的大的平均直径
XM－300
300，000
140
XM－200
100，000
55
XM－50
50，000
30
PM－30
30，000
22
UM－20
20，000
18
PM－10
10，000
15
UM－2
1，000
12
UM05
500
10
用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。
二、干燥
生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。
三、贮存
生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。
1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。
2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定
⑶ 包涵体染色的方法有哪些原理是什么
包涵体染色的方法有哪些？原理是什么
包涵体染色的方法有哪些？原理是什么
包涵体染色的方法有哪些？原理是什么
蛋白包涵体-溶解原理及方法2009年03月15日；维持包涵体内蛋白质结构的作用力是分子内的作用力，；1.遵循标准；包涵体蛋白质的溶解同样是一个工艺的关键的步骤；(1)快速溶解的动力学；；(2)与蛋白质的结合是可逆的；；(3)对细胞碎片的分离方法没有干扰作用；；(4)对温度没有依赖作用；；(5)抑制蛋白质酶的降解作用；；(6)与蛋白质的氨基没有化学修饰作用；；
维持包涵体内蛋白质结构的作用力是分子内的作用力，这种作用力也维持天然蛋白质的稳定性的结构。先前有报道这种作用力是共价键结合的，但是，现在趋向于一致，就是维持包涵体内部的蛋白质的紧密的结构的是非共价键的作用力。二硫键，无论是正确的还是错误的二硫键，在维持内部蛋白质的紧密的结构中都没有发挥直接的作用。最经常的获得活性蛋白质的第一步是溶解这些包涵体蛋白质，溶解液是使这些包涵体蛋白质完全变性的成分，当蛋白质被溶解以后，则进入到蛋白质的体外折叠的过程。
1. 遵循标准
包涵体蛋白质的溶解同样是一个工艺的关键的步骤。溶剂的选择会影响后续的操作、最终的各种蛋白质的收率以及最终的成本，必须遵循以下的标准：
(1) 快速溶解的动力学；
(2) 与蛋白质的结合是可逆的；
(3) 对细胞碎片的分离方法没有干扰作用；
(4) 对温度没有依赖作用；
(5) 抑制蛋白质酶的降解作用；
(6) 与蛋白质的氨基没有化学修饰作用；
(7) 在可能的情况下，选择最低的溶解浓度和廉价的溶剂，并适于以后的复性方法。
2. 溶解包涵体的试剂
最经常使用溶解包涵体的试剂包括离液剂或者去垢剂。
最经常使用的溶解和制备蛋白质的离子型的离液剂最早于1969年Hatefi等人发展的离子型的去垢剂如SDS是另外一种溶解包涵体蛋白质和膜蛋白质的试剂，但是一般不用来大规模的生产，而是用来定性。除了强酸、强碱和利用有机溶剂来提取疏水性很强的蛋白质以外，其他的变性方法如非可逆的共价修饰在工业的大规模生产中很少用到。一旦蛋白质被溶解，蛋白质中的巯基很容易快速地氧化并形成共价的聚集体或者分子内错配的二硫键，然后这些蛋白质就不能再进行折叠。为了防止氧化，可以使这些基团或者利用缓冲液中含有低分子量的疏基试剂保持在还原的状态或形成磺酸盐或者形成混合的二硫键。
（1）去垢剂
去垢剂是一种最经济的溶解包涵体蛋白质的方法，一个最大的优点是溶解的蛋白质有可能保持全部的生物活性，说明在此条件下保持了蛋白质的四级结构。最重要的是稀释以后蛋白质的聚集比其它溶剂生成的很
少。阳离子型、阴离子型的和非离子型的去垢剂都可以使用，使用时的浓度一般高于去垢剂的临界胶束浓度（CMC ），通常是0.5-5%。
SDS仅仅在大量生产牛生长激素、干扰素和白介素-2中用到。SDS由于具有较低的临界胶束浓度（CMC）而使得结合到蛋白质分子上的SDS比较难于除去。由于N-十二烷肌氨酸它的CMC比SDS高0.4%，也被用来溶解包涵体蛋白质并可用稀释的方法使蛋白质复性，残余的去垢剂可以使用阴离子交换色谱或者超滤的方法除去。这种去垢剂是一种比较温和的去垢剂，可以选择性地溶解一些包涵体，但是不能溶解完全的变性的蛋白质的聚集体和大肠杆菌的内膜的蛋白质分子。使用去垢剂一个主要的缺点是对以后的纯化和复性的步骤的干扰，去垢剂结合到蛋白质上的强度大离子交换色谱复性蛋白质小不同，比较难于除去，并干扰离子交换和疏水相互作用色谱的过程，在变性的浓度时超滤膜会吸附这些变性剂。所以复性后需要尽量洗涤这些去垢剂，也可以使用环状糊精链状糊精或者环状淀粉从复性缓冲液中提取去垢剂。
一个不容忽视的问题是去垢剂可以溶解全部的膜蛋白质中的蛋白质酶，这些蛋白质酶的活性在去垢剂的存在的情况下被活化，可能造成溶解和复性过程的收率的降低。蛋白质复性的收率可以通过以下的方法来提高： a) 先期使用可以溶解膜蛋白质但是不溶解包涵体蛋白质的溶剂尽量洗涤包涵体蛋白质；
b) 包涵体的含有的菌体碎片被完全除去；
c) 溶解包涵体的液体中含有蛋白质酶的抑制剂，如EDTA，苯甲基磺酰氟（PMSF ）等 。
（2）离液剂
其它的离液剂也被用来溶解包涵体蛋白质，最主要的溶解包涵体蛋白质的离液剂是盐酸胍和尿素，这是最经常使用的溶解试剂，一般情况下选择6-8mo1/L的浓度，蛋白质浓度在1-10mg/mL。
在溶解色氨酸合成酶A的过程，发现阳离子的溶解能力顺序是Gdm+ > Li+ > K+ > Na+，阴离子的顺序是SCN- > I- > Br- >Cr-。一些离液剂由于它们的溶液比盐酸胍和尿素有更高的密度和黏度而不适合用于溶解包涵体，因为利用离心和色谱分离起来比较困难。
为了溶解包涵体蛋白质需要的尿素或者盐酸胍的浓度根据蛋白质的不同而不同。如果蛋白质天然形态需要溶解的变性剂的浓度不能获得，则在溶解包涵体时需要首先确定离液剂的浓度。
盐酸胍由于比较贵，所以一般用来溶解一些附加值比较高的药物蛋白质分子，选择盐酸胍作为溶解试剂，是因为盐酸胍是一种比脲更为强烈的变性剂，甚至可以溶解脲所不能溶解的包涵体；尿素，由于可能被自发的形成的氰酸盐或者已有的氰酸盐的污染，特别是在碱性环境中，从而造成蛋白质的自由的氨基被不可逆的修饰。消除此种影响的方法是用阴离子的缓冲系统如Tris-HCl溶解脲或者脲在使用之前利用阴离子交换色谱纯化，并且配制的溶解和复性的缓冲液在当天使用。脲溶液中影响蛋白质变性的因素与盐酸胍的不同。溶在脲中的蛋白质受到pH和离子强度的影响，从而影响电荷的蛋白质残基之间的电荷作用，但是由于盐酸胍含有高浓度的离子强度，所以这两个因素的影响很少。
（3）混合溶剂
一般情况下去垢剂并不联合使用，Lilly等人发现去垢剂和尿素的混合液有效的摩尔浓度较低。尿素和去垢
剂型的盐混合可以使蛋白质变性，但是尿素和非去垢剂的盐如氯化钠反而降低包涵体蛋白质的溶解性，所以要避免使用。
去垢剂结合其他的试剂或者溶解增强剂也被使用，发现尿素和乙酸，尿素和二甲亚枫，尿素和高pH等是比较有效的溶解包涵体蛋白质的方法。
高压（1-2kbar）、超声也可以溶解包涵体蛋白质，此时使用的溶解试剂浓度可以比较低，便于后续的复性步骤。
3. 极端pH
酸碱度也是比较廉价的有效的溶解包涵体的方法。最经常使用酸的是有机酸，浓度在5-80%之间。Gavif和Better使用低的（pH≤2.6）和高温（85℃ ）溶解抗真菌的重组蛋白质的肤段，低温和高PH需要溶解时间要长。Reddy和合作者也使用20%乙酸溶解一种麦芽糖结合的蛋白质。但是，同样的一些不可逆的修饰作用或者酸降解会在极端pH下发生，所以此种方法并不是经常使用的溶解包涵体的方法。
高pH（≥12）也被用来溶解生长激素和原胰岛素。在高pH下一些蛋白质同样可能发生非可逆的变性，原因在于半胱氨酸在碱性条件下的脱硫过程。所以这种方法尽管比较简单、廉价，同样仅仅用于一些特定的蛋白质，特别对于药用蛋白质一般不采用这种方法。
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摘要 基因重组蛋白在大肠杆菌中表达时，由于表达量高，往往形成无生物活性的包涵体。包涵体必须经过变性和复性的过程才能获得有活性的重组蛋白。如何提高基因重组蛋白质的复性率，是生物工程技术的一个研究热点。对近年来的重组蛋白质的复性方法做一评述，为研究蛋白质折叠以及复性技术的进一步应用提供依据。
关键词 重组蛋白 包涵体 复性 二硫键
到目前为止，人们表达的重组蛋白质已有4000多种，其中用E.coli表达的蛋白质要占90%以上，尽管基因重组技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，然而人们在分离纯化时却遇到了意想不到的困难，即这些蛋白质在E.coli中绝大多数是以包涵体形式存在，重组蛋白不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1~3.0μm的固体颗粒[1]。自从应用大肠杆菌体系表达基因工程产品以来，人们就一直期望得到高活性、高产量的重组蛋白。不可溶、无生物活性的包涵体必须经过变性、复性才能获得天然结构以及生物活性，因此应该选择一个合适的复性过程来实现蛋白质的正确折叠，获得生物活性，近年来的研究可以使复杂的疏水蛋白、多结构域蛋白、寡聚蛋白、含二硫键蛋白在体外成功复性。
包涵体形成的原因
重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是原核表达体系或真核表达体系甚至高等真核表达体系，都会形成包涵体[2]。主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的[3]。
1、 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
3、 重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
5、 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。
减少包涵体形成的策略
1、 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成[4]。
2、 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl[5]。
3、 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。
包涵体的分离及溶解
对于生物制药工业来说，包涵体的形成也是有利的，不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏。由于包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然后5000~20000g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离，接着，包涵体沉淀需用去污剂（Triton X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解[6、7、8]。
包涵体的溶解必须用很强的变性剂，如8mol/L尿素、6~8mol/L盐酸胍，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强；去污剂，如SDS[7]，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸，如70%甲酸[9]，可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于目标蛋白没有二硫键的有时也应使用还原剂，为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子与还原状态的巯基发生氧化反应[10]。
蛋白质的折叠机理
包涵体蛋白在变性剂作用下，为可溶性伸展态，在变性剂去除或浓度降低时，就会自发的从变性的热不稳
状态向热力学稳定状态转变，形成具有生物活性的天然结构[11]。然而在去除变性剂的同时，重组蛋白质在体外折叠，分子间存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，包涵体蛋白折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争[1]。对于蛋白质的折叠机制，目前有多种不同的假设，但很多学者认为有一个“熔球态”的中间状态，在“熔球态”中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构，总之，蛋白质的具体步骤可用下式描述[12、13、14]：
伸展态→中间体→后期中间体→天然态体→聚集体
在折叠反应中，从伸展态到中间体的速度是非常快的，只需要几毫秒，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是一个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争，故而应尽量避免聚集体的产生。一般认为，蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用，一是分子内的疏水相互作用，可促进蛋白质正确折叠；一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用，在复性过程中，部分折叠的中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。
提高重组蛋白质折叠复性的方法
一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少[15]。
1、 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大[16]。
2、 高蛋白浓度下的复性方法：一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中[17]。在两次蛋白加入之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚集的中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。第二种方法是用温度跳跃策略[4]。变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行[18]，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。
3、 添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。通常使用的添加剂有：a、共溶剂：如PEG6000~20000，通过与中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；b、去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；c、氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率[19]；d、小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集，它们的作用可能为：稳定蛋白的活性状态、降低非正确折叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、增加解折叠状态的稳定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。f、添加分子伴侣和折叠酶：分子伴侣是指能够结合和稳定
⑷ 蛋白质的分离方法有哪些它们各依据蛋白质的什么性质或特点
（一）水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解.提取的温度要视有效成份性质而定.一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间.但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作.为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等）.
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择.
1、pH值
蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH
范围内.用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液.
2、盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶,称为盐溶作用.同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐,一般以0.15摩尔.升浓度为宜.缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液.
（二）有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液.但必须在低温下操作.丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内（度为10%,40度为6.6%）不会引起酶的变性失活.另外,丁醇提取法的pH及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料.
二、蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多,主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶；当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出.盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好.由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀.
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外,一般可在室温中进行.一般温度低蛋白质溶介度降低.但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低,更容易盐析.（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低.（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）.因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%.
蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等.
其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升）,在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性.硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节.
蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸）,用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行.此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短.
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用.
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行.
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开.
超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质.
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一.柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex
ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）.
（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开.
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开.值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质.
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT
FACE="宋体"
LANG="ZH-CN">纤维素）,当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来.（详见层析技术章）
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity
chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高.这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合.其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离（Separation）,提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分,至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此往往采取几种方法联合使用.
细胞的破碎
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度.此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等.
2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织.
3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施.对超声波敏感和核酸应慎用.
4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎.
5、化学处理法：有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好.
无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取.
浓缩、干燥及保存
一、样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀,为了保存和鉴定的目的,往往需要进行浓缩.常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低,减压的真空度愈高,液体沸点降得愈低,蒸发愈快,此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩.
2、空气流动蒸发浓缩
空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液,表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室,用电扇对准吹风,使透过膜外的溶剂不沁蒸发,而达到浓缩目的,此法浓缩速度慢,不适于大量溶液的浓缩.
3、冰冻法
生物大分子在低温结成冰,盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中,操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体,然后缓慢地融解,利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的.如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时,不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面,蛋白质和酶则集中于下层溶液中,移去上层冰块,可得蛋白质和酶的浓缩液.
4、吸收法
通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩.所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应,对生物大分子不吸附,易与溶液分开.常用的吸收剂有聚乙二醇,聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等,使用聚乙二醇吸收剂时,先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里,外加聚乙二醇复盖置于4度下,袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积.
5、超滤法
超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法,不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时,溶剂和小分子透过,大分子受阻保留,这是近年来发展起来的新方法,最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐,并具有成本低,操作方便,条件温和,能较好地保持生物大分子的活性,回收率高等优点.应用超滤法关键在于膜的选择,不同类型和规格的膜,水的流速,分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同,必须根据工作需要来选用.另外,超滤装置形式,溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响.Diaflo
超滤膜的分子量截留值：
膜名称分子量截留值孔的大的平均直径
XM－300300,000140
XM－200100,00055
XM－5050,00030
PM－30 30,00022
UM－2020,00018
PM－1010,00015
UM－21,00012
UM05500 10
用上面的超滤膜制成空心的纤维管,将很多根这样的管拢成一束,管的两端与低离子强度的缓冲液相连,使缓冲液不断地在管中流动.然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中.当缓冲液流过纤维管时,则小分子很易透过膜而扩散,大分子则不能.这就是纤维过滤秀析法,由于透析面积增大,因而使透析时间缩短10倍.
二、干燥
生物大分子制备得到产品,为防止变质,易于保存,常需要干燥处理,最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥.真空干燥适用于不耐高温,易于氧化物质的干燥和保存,整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外,同时增加了温度因素.在相同压力下,水蒸汽压随温度下降而下降,故在低温低压下,冰很易升华为气体.操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体,然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去.此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点,适用于各类生物大分子的干燥保存.
三、贮存
生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系.干燥的制品一般比较稳定,在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化,贮藏要求简单,只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封,保持0－4度冰箱即可,液态贮藏时应注意以下几点.
1、样品不能太稀,必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏,样品太稀易使生物大分子变性.
2、一般需加入防腐剂和稳定剂,常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等.蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等,如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性.此外,钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用.核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中.
3、贮藏温度要求低,大多数在0度左右冰箱保存,有的则要求更低,应视不同物质而定.
⑸ 超滤膜有哪几种材质，哪几种规格的啊请知道的朋友告诉我一下，谢谢。
超滤膜的材质：
PAN材质：
PAN是较早应用的一种膜材料，本身为种亲水性材料，易于版成膜。但强度低，脆性权大，耐酸碱程度较弱，但制膜成本低。
应用于净水过滤，尤其是家用净水器。
PVC材质
强度和伸长率比PAN好，不易断丝，材料来源广泛，价格低廉。缺点是非亲水性材料，需亲水改性才能制成性能优良的超滤膜。
应用于净水过滤，工业水处理。
PS材质
具有良好的化学稳定性,耐酸碱性好，透水性能较好,强度比较好，耐高温，生物融合好，但原料价格很较高，可做很低的截留分子量的超滤膜。
适合特殊物料分离，浓缩提纯以及耐高温的特殊应用。
PVDF材质
此种材质最大特点是，伸长率极高，不易断丝。耐酸碱性很好，抗污染性强，耐化学清洗及耐高浓度的余氯溶液。其缺点是材料成本很高，过滤精度低，表面强度低。
适合工业废水处理的应用。
PP材质
材料价格低，制膜过程环保，低耗，成本低，耐酸碱性很好，耐有机溶剂。通常采用拉伸法生产，达到微滤级，过滤精度低，容易受污染，不易反洗恢复，强拉伸强度高，膜面积大。
应用于净水过滤，污水处理。
⑹ 中空纤维超滤膜湿膜拆封后能保存多久
超滤膜如抄果本身是湿法保存的，那么拆封后必须保持湿润，否则膜微孔结构会受到破坏。
如果膜本身是干法保存的，那么只要保持干燥就可以保存很久。但是只要膜被湿润了，就应该继续保持湿润，并防止细菌污染。关于防菌药剂的使用要视中空纤维膜材质而定，比如说PVDF、PS材质的膜，可以使用氧化性药剂，PP材质的膜就要用非氧化性药剂了。
⑺ 关于化学制药的污水处理方面的论文
1、污水除油的必要性随着经济发展和人们生活水平的提高，城市污水的水质也在发生着变化，污水中动植物油及矿物油等油类物质逐渐增多。据有关资料报道，到2000年，我国已建成并投入运行的城市污水处理厂约180座，设计处理能力达到1050×104ｍ3 /ｄ，其中二级生化处理能力约750×10 4ｍ3 /ｄ，这些污水处理厂大多存在着油类物质的污染问题[1]；尤其是一些中小城镇的污水处理厂，由于其水量较小，水质波动较大，在用水高峰期，大量餐饮污水进入处理厂，对污水处理厂的正常运行产生严重影响。以西南科技大学污水处理厂为例，该厂占地20亩，日处理能力1×104m3/d，服务人口30000人左右，采用改进型三沟式氧化沟工艺。该污水处理厂在设计过程中没有考虑进水中的油类物质，但自2003年5月运行以来，发现进水中油类物质逐渐增多，尤其是学校教师公寓和两个学生食堂完工以后，其状况更加严重。在过去的三年间，每到冬季，油类物质覆盖整个氧化沟表面，严重影响了氧化沟的充氧效率和出水水质状况，对进水中油类物质的测定发现其含量在86mg/L～420mg/L之间，其中夏季进水中油的平均含量为120mg/L，冬季为210mg/L。2 污水的除油方法分析目前，国内外对含油污水治理的研究方法主要有以下三类：化学处理法、物理处理法和生化处理法。化学处理法主要包括化学混凝法、化学沉淀法、催化氧化法及各种方法的结合运用；物理处理法包括离心分离法、过滤和超过滤法、澄清法和气浮法；生化法包括生物接触氧化法、生物转盘法、活性污泥法等[2]。2.1 化学处理法化学处理法主要指投加一定的化学物质，使其与水中的油类物质发生絮凝、沉淀或催化氧化等反应，达到将油类物质从水中去除的目的。目前，在污水的除油过程中，化学法的研究主要集中在新型的絮凝剂的开发方面[3~8]。絮凝剂主要包括无机和有机絮凝剂，在无机絮凝剂方面，大庆石化总厂炼油厂曾对铁盐在炼油污水处理中的应用进行了研究[3]，认为在浮选投加复合聚合铝铁，在浮选除油的同时还具有除硫作用。有机絮凝剂主要包括非离子、阴离子、阳离子、两性离子有机聚合物等类型，由于分子量大，吸附悬浮物及胶质能力强，形成的絮体尺寸大，沉降快，用量少，且产生的污泥量少，易脱水，对处理水不产生负面影响，近年来备受青睐。在其应用方面，已经批量生产的主要是聚丙烯酰胺（PAM）、聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDMDAAC）和曼尼期反应的阳离子聚丙烯酰胺。在对有机絮凝剂的研究方面，唐善法等人利用丙稀酰胺与二甲基二烯丙基氯化铵、烷基二甲基烯丙基氯化铵进行多元共聚对聚丙烯酰胺进行阳离子化和疏水改性而合成的JH系列絮凝剂具有良好的絮凝除浊、破乳除油和去除有机物的能力[4]；段宏伟等人利用改性环乙环丙阳离子聚醚等合成的RD－1反相破乳剂对污水中油类的去除具有较好的效果[5]；除此之外，还有对二硫代氨基甲酸盐等絮凝剂的研究[6~8]。近几年，污水除油方法在能量化学领域也有研究[9~12]，如磁化学技术的研究[9~11]，废水中的浮油或分散油可使用被服油膜磁粉法和油层悬浮磁粉过滤法来处理。前者是用一些化学物质对磁性颗粒进行表面处理，使其表面被服一层亲油和疏水性物质的薄膜，磁种吸附油后，用磁场回收磁种即可除油；后者是利用吸附油膜的磁粉，或吸附油的磁种层来过滤油，通过磁场来固定滤层，为增加滤层与污水中油珠的碰撞，可使用交变磁场。另外，在电化学方面[11,12]，可运用直接电解、间接电解、电化学吸附与脱附等方法对污水进行除油。2.2 物理处理法物理处理法是污水除油系统中应用最多的一类方法，其核心思想是采用物理的方法达到油水的分离。在污水的除油过程中，物理法的研究主要集中在油水分离器的研究开发，其中包括浮选技术及浮选器、旋流技术及旋流器、膜技术及膜器等方面。2.2.1 浮选技术浮选净化技术是国内外正在深入研究与不断推广的一种水处理新技术[13~15]。浮选除油就是在水中通入空气或其它气体产生微细气泡，使水中的一些细小悬浮油珠及固体颗粒附着在气泡上，随气泡一起上浮到水面形成浮渣，从而完成固、液分离的一种新的除油方法。根据在于水中形成气泡的方式和气泡大小的差异，浮选处理法大体上可分为四大类，即溶气浮选法、诱导浮选法、电解浮选法和化学浮选法，其详细分类及每种方法的优缺点如表1所示。表1浮选处理方法的分类方法名称具体方法浮选成因主要优点主要缺点溶气浮选法加压溶气浮选法 真空浮选法在加压下，使气体溶解于污水，又在常压下释放出气体，产生微小气泡。在减压下，使溶解于水中的气体释放出来，产生微小气泡。气泡的尺寸小、均匀、操作稳定、设备简单、管理维修方便、除油率高上浮稳定、絮凝体破坏可能性小、能耗小流程较复杂、停留时间长、设备庞大、操作麻烦 溶气量小、操作及结构复杂诱导浮选法机械鼓气浮选法叶轮浮选法 射流浮选法让气体通过无数个微小的孔隙或缝隙，产生微小气泡。叶轮转动产生负压吸入气体，并依靠其剪切力使吸入气体变成小气泡。依靠水射器的作用使污水中产生微小气泡能耗小、浮选室结构简单。 溶气量大、停留时间短、处理速度高于溶气浮选工艺、除油效率高、设备造价低、耐冲击负荷。噪声小、工艺简单、总体能耗低、产生气泡小、除油效率好于叶轮式需投加表面活性剂才能形成微小气泡、使用范围受限、微孔易堵。浮选中必须添加浮选助剂、气泡大小不均匀、可能产生些无效气泡、制造维修麻烦。水射器要求高电解浮选法电解浮选法电絮凝浮选法选用惰性电极，使污水电解产生微小气泡。选用可溶性电极（Fe、Al等）在阳极上产生微小气泡，在阴极上有混凝作用的离子气泡小、除油率高。 气泡小、浮选与絮凝同时进行、除油率高极板损耗大、运行费用高。 同上化学浮选法化学浮选法依靠物质之间的化学反应，产生微小气泡（生成CO2，O2）。设备投资低、气泡量易于控制、尤适用于悬浮物含量高的污水污泥量增加、劳动强度大。 2.2.2 旋流技术水力旋流器是利用油水的密度差，在液流高度旋转时受到不等离心力的作用而实现油水分离的。含油污水切向进入圆筒涡旋段，并沿旋流管轴向螺旋态流动。在同心缩径段，由于圆锥截面的收缩，使流体增速，并促使已形成的螺旋流态向前流动，由于油和水的密度差，使水沿着管壁旋转，而油珠移向中心。流体进入细锥段，截面不断缩小，流速继续增大，小油珠继续移到中心汇成油芯。流体进入平行尾段，由于流体恒速流动，对上段产生一定的回压，使低压油芯向溢流口排出，而水则从净水出口排出。其工作原理见图1。图1 水力旋流器的工作原理示意图国外水力旋流除油研究始于1967年，经过多年的科学研究和工程应用，现已进入重大技术发展阶段。目前，美国 Conoco公司、Krebs公司、Kvanemer公司、Mpe公司、Amoco公司，澳大利亚 BWN Vortoil 公司，瑞典 ALFALAVAL公司都开始生产油水旋流分离器。国内许多研究单位和企业也先后开展了水力旋流器的研制工作，如西安交通大学、西南石油学院、四川大学、大庆石油学院、大连理工大学、江汉石油机械研究所、河南石油勘探局设计院、胜利油田设计院、大港油田设计院、江都环保器材厂、沈阳新阳机器制造厂等单位[16~22]。2.2.3 膜技术膜处理技术是最近兴起的一项污水除油的新技术[22,23]，其核心思想是利用半透膜作选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中的其他组分从而达到分离目的的技术总称。它具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高和节能等优点，已作为一种单元操作在污水除油过程中日益受到人们的重视。在膜技术的研究应用方面，天津天膜技术工程公司曾采用中空纤维超滤膜对含油污水进行处理研究[23]，表明中空纤维超滤膜用于处理经过预处理的含油量较低的污水较为理想，而对未经过处理的含油量高的污水除油除浊效果较好；中国计量科学研究院利用一种破乳功能膜处理含油污水，取得较好效果[24]。但在膜技术应用中，都不同程度的存在膜的清洗问题。2.3 生化处理法生化处理是利用水中的微生物处理污水中的有机污染物的一种工艺，现有的污水处理厂的生物处理单元，对污水中的油类物质有部分去除效率，但去除率较低。目前生物技术在污水除油中的应用主要集中在筛选优化、培养和驯化嗜油微生物菌种。新疆环境监测中心通过利用餐饮服务业的含油污水培养筛选出28株具有较强除油能力的菌种进行研究，发现将其回接污水后，平均除油率达68%，其优选菌种回接污水24ｈ后的除油率达90 %，而同批污水自然存放10ｄ后的除油率仅为29%。采用选培优良菌种集中快速处理，可以显著提高此类污水的处理效率[25]。3 除油方案探讨针对西科大污水厂的油类物质，2003年～2005年冬季我们曾采用水力冲刷氧化沟表面和在沉砂池前投加石灰的方法进行实验。水力冲刷虽然可以暂时使氧化沟表面的油类物质吸附在污泥表面沉淀下来，但在下一个运行阶段油类物质会重新布满池面；沉砂池前投加石灰可以减少氧化沟中的油污，但石灰同时会对部分微生物产生抑止，其产生的沉淀物质在沉砂池中很难沉淀下来，带到氧化沟后容易堵塞沟中微孔曝气器，因此投加量受到限制，而其他的絮凝剂有存在价格偏高的问题。为了暂时避免氧化沟的缺氧问题，我们将氧化沟出水堰的挡板去掉，使漂浮的油污随出水进入接触池，在接触池的起端清捞。可以说上述的措施并未达到理想的除油目的。在选择除油方案时，我们也考虑了水力旋流器等物理方法，但由于其细格栅和沉砂池之间的空间限制以及昂贵的能耗费用和分离出来的油类的去向等问题的困扰，故未能采用。由于西科大污水厂的油类的来源较为单一，我们考虑在两个学生食堂外的设置隔油池，分离出来的油污和食堂的潲水一起集中处理；同时在污水厂氧化沟中培养驯化嗜油微生物，通过微生物技术对其余的油类进行处理，从而达到节约费用，提高除油效率的目的。4 结论4.1 污水处理厂除油的方法很多，目前在化学、物理及生化处理方法方面均有研究应用。4.2 中小城镇的污水处理厂由于存在资金困难等因素，在设计过程中往往没有考虑除油设施，而运行中油类的污染又直接影响其处理效果，因此其除油措施的实施必须结合各厂的具体情况。4.3 对于油类物质来源比较单一的城镇污水处理厂，从源头治理会起到简单、经济和实用的效果。4.4 微生物技术作为一种新兴的技术，在污水除油领域的研究应用正在不断深化，筛选优化、培养和驯化嗜油微生物菌种对于中小型污水处理厂的除油具有节能、高效等优点。
⑻ 电泳超滤膜清洗的方法
超滤膜清洗技术目前共有三种，分别为物理清洗技术、化学清洗技术版、生物清洗技术。权在阴极电泳线超滤系统中常用到的为物理清洗技术和化学清洗技术。
1. 物理清洗技术是指以水力清洗技术和气-液脉冲技术为主，用于去除超滤膜表面的可逆污染。水力清洗技术是用气/空气、水的混合流体通过正洗或反洗来除去膜内部及表面污染物的方法。2.化学清洗是利用清洗剂与孔内及膜表面的污染物反应来清洗超滤膜污染物，常用的清洗化学品有KOH、Na0H、NaC10、柠檬酸、甲酸、草酸等。
具体方法为：
（1）用纯水正洗40分钟，排空清洗箱，放入新鲜纯水反洗40分钟；
（2）放入超滤液至清洗箱，正洗至超滤液温度升至45℃，浸泡2h，反洗40分钟，反洗超滤液温度不超过46℃，往复2~3遍；
（3）若超滤液清洗无法洗净超滤膜，则用体积占比5%的甲酸和5%的草酸配成纯水溶液，重复第（2）步操作。清洗时清洗泵压0.2Mpa左右，清洗水箱放水50Kg左右。