凯氏定氮法蒸馏前的顺序

㈠ 凯氏定氮仪使用方法和步骤

使用凯氏定氮仪的步骤分为消化、蒸馏和吸收三部分：

1. 消化阶段: 准备6个标号的凯氏烧瓶，分别加入蛋白溶液、接触剂、硫酸、过氧化氢。1-3号烧瓶加入样品，4-6号作为空白对照，用蒸馏水代替样品。烧瓶连接抽气装置，先微火加热至烧瓶内物质炭化变黑，泡沫消失后加大火力，保持微沸，期间需转动烧瓶以保证完全消化。消化过程中需用抽水泵排除SO2气体，整个过程应在通风橱中进行。

2. 蒸馏和吸收阶段: 仪器安装前需清洗干净，使用时需进行蒸气洗涤。在蒸馏装置中，加蒸馏水、硫酸保持酸性、沸石防爆沸，加蒸馏水使水封。蒸煮5分钟后移开煤气灯，冲洗并检查不漏气。无机氮标准样品蒸馏吸收需先练习，如用硫酸铵标准液进行重复实验，颜色变化指示蒸馏结束。

3. 未知样品和空白的蒸馏吸收: 消化好的样品或空白对照液加入热蒸馏水稀释，洗涤并倒入反应室，按标准硫酸铵的操作进行蒸馏。注意消化液可能需要稀释以防止结晶堵塞。

4. 滴定阶段: 蒸馏完毕后，用0.0100mol/L的标准盐酸溶液滴定，观察颜色变化以确定滴定终点。空白对照液颜色变化不明显时，可不进行滴定，记录每次滴定的用量。

㈡ 蛋白质的测定方法

测定蛋白质含量的方法有凯氏定氮法、双缩脲法、考马斯亮蓝法等。

2、双缩脲法：是一种用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂呈蓝色，是一种碱性含铜测试溶液，它由几滴1%硫酸铜，1%氢氧化钾和燃握敬酒石酸钾钠制成。

3、考马斯亮蓝法：基本原理是基于蛋白质可以与考马斯亮蓝G-250定量结合。

㈢ 有谁知道凯氏定氮的具体步骤，注意事项，！！

1、消化:精密称取大豆样品1.0g左右，放入干燥的250 ml消化管中，加入0.4g CuSO4 7g K2SO4 10ml H2SO4先200'C炭化，待泡沫停止后提高温度到450'C，加热至液体沸腾，待瓶内液体呈蓝绿色透明后，再继续加热0.5h。

冷却后加入20ml水，移入100ml容量瓶中，用少量水洗涤消化管2~3次，洗液合并于容量瓶中定容。

2、蒸馏:连接凯氏定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至2/3处，加甲基红指示剂数滴及数ml硫酸，保持水呈酸性。加入数粒玻璃珠以防暴沸，调节火力加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

3、向吸收瓶内加入20g/L硼酸溶液20ml及混合指示剂2滴，并使冷凝管下端插入液面以下，吸取10ml样品消化稀释液由进样口进入反应室，并以10ml水洗涤进样口使其流入反应室内，将400g/L NaOH溶液10ml倒入进样口，立即夹紧螺旋夹，并加入少量蒸馏水，密封进样口。

当蒸汽通入反应室时，准确计时，反应产生的氨气通过冷凝管进入吸收瓶，蒸馏5min，移动吸收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏Imin，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下吸收瓶。

停止加热，使反应室内的液体进入汽水分离器，打开进样口的螺旋夹，将汽水分离器的液体放出。再向反应室内加入蒸馏水，夹紧螺旋夹，再次进行加热至水蒸汽放出，停止加热，使反应室内的水进入汽水分离器，进行洗涤。

4、滴定:用0.025mol/L硫酸标准溶液滴定吸收液至灰色。

5、计算:X= 2cVX 14X5.71/m

X为样品中蛋白质的含量，%；c为硫酸标准溶液的浓度，molL；V为样品消化液消耗硫酸标准溶液的体积，ml；m为样品的质量，g。

注意事项

(1) 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

(2) 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万-沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

(3) 消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢(H2O2)2-3ml，促使氧化。

(4) 在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

(5)如硫酸缺少， 过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。

(6)加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。

(7)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

(8) 氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。

(3)凯氏定氮法蒸馏前的顺序扩展阅读：

凯氏定氮法原理

凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程 称为有机物的消化。

为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。

硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。

㈣ 凯氏定氮法测定食品中蛋白质的操作要点及注意事项、常见问题解答汇总！

蛋白质作为生物体细胞组织的重要构成成分，在食物中起着至关重要的作用。它们是人体氮的主要来源，具有不可替代的重要性。蛋白质区别于其他有机化合物的一个重要标志是其含氮量。在检测食品中的蛋白质时，通常先测定食品中的总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，以此得出蛋白质含量。凯氏定氮法，由Kieldahl于1883年首次提出，至今仍是标准检测方法。

凯氏定氮法的原理是：在样品中加入浓硫酸和催化剂，使其充分混合并加热消化，使样中的碳和氢被氧化为二氧化碳和水，而有机氮转化为硫酸铵。通过碱化蒸馏使氨游离，使用硼酸吸收后，以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即可得出蛋白质的含量。

样品消化过程中，浓硫酸的作用是脱水性和氧化性，使有机物中的碳、氢氧化为二氧化碳和水，并使蛋白质分解为氨，氨随后与硫酸结合生成硫酸铵。为了提高消化效率，通常会加入硫酸钾和硫酸铜作为催化剂。硫酸钾能提高溶液的沸点，而硫酸铜则作为催化剂，且能指示消化终点，当有机物完全消化后，溶液会呈现清澈的蓝绿色。

蒸馏过程中，消化液中的硫酸铵在碱性环境下转化成氨。为了防止水蒸气发生器中的氨气逸出，需要保持水的酸性。消化液中的氨通过硼酸溶液吸收，硼酸吸收氨的作用微弱酸性，不影响后续滴定时指示剂的变色反应。

滴定步骤中，待吸收完全后，使用硫酸或盐酸标准溶液进行酸碱滴定。滴定液的浓度直接影响结果准确性，必须按照要求进行配制和标定。滴定终点时，指示剂呈灰色。

在进行凯氏定氮法时，需注意以下几点：所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制；取样应具有代表性，取样前需充分混匀；样品称量放入凯氏烧瓶时，切勿使样品粘附在瓶颈部；消化过程中需不时转动凯氏烧瓶；消化脂肪或糖含量较高的样品时，应先消化加热并不断摇动；消化液浑浊或未澄清透明时，可先将凯氏烧瓶放冷至室温，再加入过氧化氢继续消化；加碱后需进行水封，避免氨逸出影响结果准确性；蒸馏时需保证蒸汽均匀、充足，防止发生倒吸；若加碱后消化液呈蓝色而未生成氢氧化铜沉淀，说明碱量不足，需适量补加碱；蒸馏前检查蒸馏装置是否漏气，使用碎瓷片或玻璃珠消泡，冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下，蒸馏完毕后先提离液面，再蒸1min清洗管口，最后移开吸收瓶并关闭热源，避免发生倒吸。

对于凯氏定氮法，常见问题解答如下：消化过程中沾壁和黑色残留物，可通过在消化较完全时摇动定氮瓶解决；硫酸钾的作用是提高溶液沸点，加快有机物分解；硫酸铜作用为催化、指示消化终点以及蒸馏时碱性反应指示剂；混合指示剂必须临用时混合；蒸馏后需冲洗冷凝管下端，以防止产生结果误差；蒸馏装置检漏可通过滴加少量水在接口和瓶塞处观察气泡产生；硼酸使用量需按国标要求，10mL足够；滴定时消耗盐酸溶液量不宜更改国标浓度；空白消耗标准滴定液的体积即为试剂空白实验消耗的标准滴定溶液的体积；同时含有多种蛋白质，需按复合配方食品换算蛋白质系数。

总结，凯氏定氮法是一个经典且准确的检测方法，适用于食品中蛋白质的测定。然而，由于样品中可能含有的非蛋白质含氮化合物，凯氏定氮法测得的结果为样品中粗蛋白质含量，而非蛋白质含量。在实际实验操作中，应严格遵循标准规定进行每一步操作，以确保结果准确性。本文为作者日常实验总结所得，希望能为实验者提供一些帮助。

㈤ 凯式定氮法的操作步骤

1. 样品的选取和制备 选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净, 按四分法缩减取样,
取样量不得少于20克。将种子放于60～65℃烘箱中干燥8小时以上, 用粉碎机磨碎, 95%通过40目筛, 装入磨口瓶备用。
2. 称样
称取0.1克试样两份(含氮1～7毫克), 精确至0.0001克, 同时测定试样的水分含量。
3. 消煮1 将试样置开25毫升凯氏瓶中,
加入加速剂粉末。除水稻为1克外, 其它均为2克。然后加3毫升硫酸, 轻轻摇动凯氏瓶, 使试样被硫酸湿润, 将凯氏瓶倾斜置于电炉上加热, 开始小火,
待泡沫停止后加大火力, 保持凯氏瓶中的液体连续沸腾, 沸酸在瓶颈中部冷凝回流。待溶液消煮到无微小的碳粒并呈透明的蓝绿色时,
谷类继续消煮30分钟,豆类继续消煮60分钟。
4. 消煮2 将试样置于50毫升凯氏瓶中,
加入0.5克加速剂和3毫升混液,在凯氏瓶上放一曲颈小漏斗, 倾斜在电炉上加热, 开始小火(用调压器将电压控制在175伏左右),
保持凯氏瓶中液体呈微沸状态。5分钟后加大火力(将电压控制在200伏左右)。保持凯氏瓶中液体连续沸腾, 消煮总时间, 水稻、高粱为30分钟,
其它均为45分钟。
注: 消煮中列入两种消煮条件, 经与国际谷物化学协会标准法(ICC)比较, t值测验均不显著,
准确度与精密度也基本一致,在具体工作中可根据实际情况取其一种。
5. 蒸馏 消煮液稍冷却后加少量蒸馏水,
轻轻摇匀。移入半微量蒸馏装置的反应室中,用适量蒸馏水冲洗凯氏瓶4～5次。蒸馏时将冷凝管末端插到盛有10毫升硼酸指示剂混合液的锥形瓶中,
向反应室中加入40%氢氧化钠溶液15毫升(如采用消煮2的条件, 加10毫升即可)。然后通气蒸馏, 当馏出液体积约达50毫升时,降下锥形瓶。使冷凝管末端离开液面,
继续蒸馏1～2分钟, 用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均需流入锥形瓶中。
6. 滴定 谷类以0.02mol/L,
豆类以0.05mol/L标准盐酸或硫酸滴定至锥形瓶中的溶液由蓝绿色变成灰紫色为终点。空白用0.1克蔗糖代替样品作空白测定。消耗标准酸溶液的体积不得超过0.3毫升。

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㈥ 说明常用蛋白质测定方法的原理,并对各种方法加以比较

1、凯氏定氮法

准备4个50mL凯氏烧瓶并标号，想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化。

消化完毕后进行蒸馏，全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。

2、双缩脲法

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色， Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。

利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线，将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合，并只加入硫酸钠不含血清的试管作对照，将两支试管加入等量的双缩脲试剂，混合后于37℃环境中放置10分钟，在540nm波长进行比色，以对照管调零，读取吸光度值，标准曲线上直接查出蛋白质含量。

3、酚试剂法

取6支试管标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量加入蒸馏水补足而保持一致，混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

5、考马斯亮蓝法

Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。

标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。

将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，出现沉淀，过滤除去。

每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min。根据标准曲线计算待测样本的浓度。