凯氏定氮法半微量法蒸馏液

㈠ 请问半微量凯式定氮法的详细步骤，谢谢！！顺便问下全量半微量和微量的区别是什么呢

(一) 方法原理

样品与硫酸一同加热消化, 分解有机质, 释放出的NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解NH3 ,用硼酸吸收, 用标定过的盐酸或硫酸滴定, 从而计算出总氮量, 换算为蛋白质量。
(二) 仪器、设备

1. 仪器
分析天平: 感量0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管, 容积10毫升；硬质凯氏烧瓶: 容积25毫升, 50毫升；锥形瓶: 容积150毫升；电炉: 600瓦。

2. 试剂
(1) 盐酸: 分析纯, 0.02mol/L, 0.05mol/L标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)；
(2) 氢氧化钠: 工业用或化学纯, 40%溶液(W/V)；
(3) 硼酸: 分析纯, 2%溶液(W/V)；
(4) 硼酸混合指示剂: 溴甲酚绿0.1克, 甲基红0.1克分别溶于95%乙醇中,混合后稀至100毫升, 将混合指示剂与2%硼酸溶液按 1:100比例混合, 用稀酸或稀碱调节PH值为4.5, 使呈灰紫色, 此溶液放置时间不宜过长, 需在1个月之内使用；
(5) 加速剂: 五水合硫酸铜(分析纯)10克, 硫酸钾(分析纯)100克在研钵中研磨, 仔细混匀, 过40目筛；
(6) 浓硫酸: 比重1.84, 无氮；双氧水: 分析纯,30%；蔗糖: 分析纯；
(7) 双氧水硫酸混合液(简称混液): 双氧水、硫酸、水的比例为3:2:1, 即在100毫升蒸馏水中,慢慢加入200毫升浓硫酸, 待冷却后, 将其加入300毫升30%双氧水, 混匀, 此混液可一次配制500～1000毫升贮藏于试剂瓶中备用, 夏天最好放入冰箱或阴凉处贮藏, 室温(20℃)上下时不必冷藏, 贮藏进间不超过1个月 。

(三) 操作步骤

1. 样品的选取和制备 选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净, 按四分法缩减取样, 取样量不得少于20克。将种子放于60～65℃烘箱中干燥8小时以上, 用粉碎机磨碎, 95%通过40目筛, 装入磨口瓶备用。
2. 称样 称取0.1克试样两份(含氮1～7毫克), 精确至0.0001克, 同时测定试样的水分含量。
3. 消煮1 将试样置开25毫升凯氏瓶中, 加入加速剂粉末。除水稻为1克外, 其它均为2克。然后加3毫升硫酸, 轻轻摇动凯氏瓶, 使试样被硫酸湿润, 将凯氏瓶倾斜置于电炉上加热, 开始小火, 待泡沫停止后加大火力, 保持凯氏瓶中的液体连续沸腾, 沸酸在瓶颈中部冷凝回流。待溶液消煮到无微小的碳粒并呈透明的蓝绿色时, 谷类继续消煮30分钟,豆类继续消煮60分钟。
4. 消煮2 将试样置于50毫升凯氏瓶中, 加入0.5克加速剂和3毫升混液,在凯氏瓶上放一曲颈小漏斗, 倾斜在电炉上加热, 开始小火(用调压器将电压控制在175伏左右), 保持凯氏瓶中液体呈微沸状态。5分钟后加大火力(将电压控制在200伏左右)。保持凯氏瓶中液体连续沸腾, 消煮总时间, 水稻、高粱为30分钟, 其它均为45分钟。
注: 消煮中列入两种消煮条件, 经与国际谷物化学协会标准法(ICC)比较, t值测验均不显著, 准确度与精密度也基本一致,在具体工作中可根据实际情况取其一种。
5. 蒸馏 消煮液稍冷却后加少量蒸馏水, 轻轻摇匀。移入半微量蒸馏装置的反应室中,用适量蒸馏水冲洗凯氏瓶4～5次。蒸馏时将冷凝管末端插到盛有10毫升硼酸指示剂混合液的锥形瓶中, 向反应室中加入40%氢氧化钠溶液15毫升(如采用消煮2的条件, 加10毫升即可)。然后通气蒸馏, 当馏出液体积约达50毫升时,降下锥形瓶。使冷凝管末端离开液面, 继续蒸馏1～2分钟, 用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均需流入锥形瓶中。
6. 滴定 谷类以0.02mol/L, 豆类以0.05mol/L标准盐酸或硫酸滴定至锥形瓶中的溶液由蓝绿色变成灰紫色为终点。空白用0.1克蔗糖代替样品作空白测定。消耗标准酸溶液的体积不得超过0.3毫升。

(四) 结果计算

式中:
V2 滴定试样时消耗标准酸的体积(毫升)
V1 滴定空白时消耗标准酸的体积(毫升)
N标准酸溶液的浓度(mol/L)
K 氮换算成粗蛋白质的系数
W 试样重量(克)
X 试样水分含量
0.0140每毫摩尔氮的克数
平行测定的结果用算术平均值表示,保留小数后二位。
两份试样粗蛋白质的平行测定结果为15%以下时, 其相对相差不得大于3%；15%～30%进为2%；30%以上为1%。

凯氏定氮法中的常量，微量，和半微量区别：
区别在于检测用样品量，你可以按标准进行操作，没有必要拘泥于某一方法
主要看你样品量是否足够
1、常量由于可以把全部消化液一同蒸馏测定，故较适合蛋白质含量低的样品。
2、微量、半微量差别在装置上，二者皆属于水蒸汽蒸馏操作，只是前者把蒸汽直接导入反应室内，后者把蒸汽导入反应室外加热，由于二者皆取消化液的一部份操作，可平行蒸馏操作，但检测限要较常量法高。
3、纯粹从回收率的角度看，半微量要稍好。

㈡ 氮测定法第二法（半微量法）

以下是改写后的文章内容：

首先，准备蒸馏装置，具体包括1000ml圆底烧瓶A、安全瓶B、带氮气球的蒸馏器C、漏斗D、直形冷凝管E、100ml锥形瓶F以及橡皮管夹G和H。连接装置后，A瓶中加入适量水和甲基红指示液，并调整为酸性环境，加入玻璃珠或沸石以防止暴沸。向D漏斗加入50ml水，关闭G夹，打开冷凝水，煮沸烧瓶。当蒸气冷凝时，移除火源，关闭H夹，使C瓶中的水通过B瓶反抽，然后打开G夹排出B瓶的水，关闭B瓶和G夹。将冷凝管尖端插入约50ml水中，重复此过程2-3次，以清洗仪器。

接下来，取适量的供试品（约含1.0-2.0mg氮），精确称量后放入干燥的30-50ml凯氏烧瓶，加入硫酸钾（或无水硫酸钠）0.3g、30%硫酸铜溶液5滴，再沿瓶壁慢慢加入2.0ml硫酸。将烧瓶倾斜45度，小火加热保持低于沸点，观察气泡停止产生后逐渐加大火力，沸腾至溶液呈绿色后，保持10分钟，冷却后加2ml水。

在100ml锥形瓶中加入10ml2%硼酸溶液，再加入甲基红-溴甲酚绿混合指示液。将凯氏烧瓶中的溶液通过D漏斗转移到C蒸馏瓶中，清洗烧瓶和漏斗后，加入10ml40%氢氧化钠溶液。关闭G夹，加热A瓶进行蒸气蒸馏，直到溶液颜色从酒红色变为蓝绿色。继续蒸馏约10分钟，将冷凝管尖端提出液面，冲洗1分钟后用水清洗，停止蒸馏。

蒸馏液用0.005mol/L硫酸滴定液滴定，直至溶液颜色从蓝绿色变为灰紫色。滴定结果需用空白试验校正，每毫升硫酸滴定液相当于0.1401mg的氮。若供试品质量大于0.1g，需适当增加硫酸和40%氢氧化钠溶液的用量以确保完全消化。

㈢ 凯式定氮法的操作步骤

1. 样品的选取和制备 选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净, 按四分法缩减取样,
取样量不得少于20克。将种子放于60～65℃烘箱中干燥8小时以上, 用粉碎机磨碎, 95%通过40目筛, 装入磨口瓶备用。
2. 称样
称取0.1克试样两份(含氮1～7毫克), 精确至0.0001克, 同时测定试样的水分含量。
3. 消煮1 将试样置开25毫升凯氏瓶中,
加入加速剂粉末。除水稻为1克外, 其它均为2克。然后加3毫升硫酸, 轻轻摇动凯氏瓶, 使试样被硫酸湿润, 将凯氏瓶倾斜置于电炉上加热, 开始小火,
待泡沫停止后加大火力, 保持凯氏瓶中的液体连续沸腾, 沸酸在瓶颈中部冷凝回流。待溶液消煮到无微小的碳粒并呈透明的蓝绿色时,
谷类继续消煮30分钟,豆类继续消煮60分钟。
4. 消煮2 将试样置于50毫升凯氏瓶中,
加入0.5克加速剂和3毫升混液,在凯氏瓶上放一曲颈小漏斗, 倾斜在电炉上加热, 开始小火(用调压器将电压控制在175伏左右),
保持凯氏瓶中液体呈微沸状态。5分钟后加大火力(将电压控制在200伏左右)。保持凯氏瓶中液体连续沸腾, 消煮总时间, 水稻、高粱为30分钟,
其它均为45分钟。
注: 消煮中列入两种消煮条件, 经与国际谷物化学协会标准法(ICC)比较, t值测验均不显著,
准确度与精密度也基本一致,在具体工作中可根据实际情况取其一种。
5. 蒸馏 消煮液稍冷却后加少量蒸馏水,
轻轻摇匀。移入半微量蒸馏装置的反应室中,用适量蒸馏水冲洗凯氏瓶4～5次。蒸馏时将冷凝管末端插到盛有10毫升硼酸指示剂混合液的锥形瓶中,
向反应室中加入40%氢氧化钠溶液15毫升(如采用消煮2的条件, 加10毫升即可)。然后通气蒸馏, 当馏出液体积约达50毫升时,降下锥形瓶。使冷凝管末端离开液面,
继续蒸馏1～2分钟, 用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均需流入锥形瓶中。
6. 滴定 谷类以0.02mol/L,
豆类以0.05mol/L标准盐酸或硫酸滴定至锥形瓶中的溶液由蓝绿色变成灰紫色为终点。空白用0.1克蔗糖代替样品作空白测定。消耗标准酸溶液的体积不得超过0.3毫升。

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㈣ 凯氏定氮法中用含氨蒸馏水,则测定结果

通过测氮的含量而得出蛋白质含量.公式：蛋白质含量=蛋白氮X6.25（注:氮元素占蛋白质中组成百分比为16%,式子中的6.25是16%的倒数）凯氏定氮法测定的氮，包括蛋白质中的氮还有样品中其它的氮.所以测得结果高于样品蛋白质的实际含量。

以凯氏定氮法测定氮含量换算蛋白质的方法，是国际上通用的标准方法，操作简单，测定结果重复性和重现性都很好，广泛用于各种食品、谷物、饲料等样品的蛋白质含量测定。此法又分为常量、半微量、微量法三种。国家标准规定为半微量凯氏定氮法。

凯氏定氮法

是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

㈤ 油厂棉粕蛋白化验蛋白的微量做法怎么做

微量做法就是凯氏半微量定氮法，具体操作步骤如下：
饲料粗蛋白的检测方法（凯氏半微量定氮法）
1 原理
凯氏法测定试样含氮量，即在催化剂存在下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵，加入强碱（NaOH）并蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，用标准盐酸溶液滴定测出含氮量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白质含量。
2 仪器设备
2.1实验室用样品粉碎机或研钵
2.2分样筛：孔径0.45mm（40目）
2.3分析天平：感量0.0001g
2.4消煮炉或电炉
2.5滴定管：酸式25mL
2.6凯氏烧瓶：100mL
2.7凯氏蒸馏装置：半微量水蒸汽蒸馏式
2.8锥形瓶：150mL
2.9容量瓶：100mL
3 试剂
3.1硫酸：分析纯
3.2硫酸铜：分析纯
3.3硫酸钾：分析纯
3.4硒粉：分析纯
3.5氢氧化钠：分析纯40g溶于100mL蒸馏水配成40%水溶液。
3.6硼酸：分析纯2g溶于100mL蒸馏水配成2%水溶液。
3.7混合指示剂：甲基红分析纯0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿分析纯0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期三个月以内。
3.8 0.02N盐酸标准溶液：1.67mL盐酸分析纯溶于1000mL 蒸馏水中。
3.8.10.02N盐酸标准溶液的标定（碳酸钠法）
精确称取0.04g于270—300°C灼烧至恒重的基准级无水碳酸钠，准确至0.0001g，无损失地转入100 mL三角瓶中，加入无CO2蒸馏水(新做蒸馏水或蒸馏水煮沸数分钟放凉后使用)50mL溶解，并加入混合指示剂10滴，用盐酸标准溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2分钟，冷却后继续滴定至溶液呈暗红色，同时做空白试验。
3.8.2盐酸标准溶液当量浓度的计算
G
N =
(V1-V2)×0.05299
式中：G——无水碳酸钠的重量，g；
V1——盐酸标准溶液消耗的体积，mL；
V2——空白试验所消耗盐酸标准溶液的体积，mL；
0．05299——每毫克当量碳酸钠的克数；
注：标定各浓度间的相对偏差不大于0.2%。
3.9蔗糖：分析纯
3.10硫酸铵：分析纯，干燥。
4 试样的选取与制备
选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分变化。

5 测定方法及步骤
5.1试样的消煮
称取0.5—1g试样 （粗蛋白含量在25%以下称取1g，粗蛋白含量在25%以上称取0.5g），准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.4g，无水硫酸钾6g，硒粉0.004g，与试样混合，再加浓硫酸12.5mL，在消煮炉上小心加热，待样品焦化，泡沫消失，加强火力，至溶液澄清后，再加热至少1h。
5.2氨的蒸馏（半微量水蒸汽蒸馏法）
将上述消煮液冷却，无损失地转入100 mL容量瓶中，冷却后定容为试样分解液，取20 mL 2%硼酸溶液，加混合指示剂2滴，使半微量蒸馏装置的末端浸入此溶液，准确移取试样分解液10 mL注入反应室中，塞好入口玻璃塞，再加入10mL 40%NaoH溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室（加碱时流速不可过快，否则会引起硼酸吸收液倒流），塞好玻璃塞，并在入口处加水密封好，防止漏气，蒸馏，自吸收液变为蓝色开始计时，4分钟后，使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1分钟，用蒸馏水洗净冷凝管末端，洗液均流入吸收液。
5.3滴定
吸收氨后的吸收液立即用0.02mol/L的标准溶液滴定，溶液由蓝色变成灰红色为终点，记录所耗标准溶液的体积。
5.4空白测定
称取蔗糖0.5g代替试样，重复上述操做，以校正药品不纯所发生的误差，消耗0.02mol/LHCL应不超过0.3mL。

6 测定结果的计算与分析
6.1计算公式如下：
（V-V0）×(N×0.014×6.25) ×100
粗蛋白（%）=
W×V/V′
式中：V-----滴定试样时所需酸标准溶液体积，mL；
V0------滴定空白时所需酸标准溶液体积，mL；
N-------盐酸标准溶液当量浓度；
W------试样重量，g；
V-------试样分解液总体积，mL；
V′------试样分解液蒸馏用体积，mL；
0.0140------氮的毫克当量数；
6.25-----氮换算成蛋白质的平均系数。
6.2重复性
每个试样取两个平行样，以其算数平均值为结果；
粗蛋白含量在25%以上，允许相对偏差为1%；粗蛋白含量在10-25%之间，允许相对偏差为2%；粗蛋白含量在10%以下，允许相对偏差为3%；

7 测定步骤的检验
精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按上述步骤操作，按上述公式计算（不乘系数6.25），测得硫酸铵含氮量为21.19±0.2%，否则应检查加碱，蒸馏和滴定各步骤是否正确。
8 注意事项
8.1试样消煮时，先低温加热，避免泡沫溢出，待泡沫消失后，再逐渐增加温度，使之微沸，避免剧烈沸腾，否则会使氮分子损失。
8.2加碱必须过量，碱除了与铵盐和剩余的硫酸作用，还与硫酸铜作用生成蓝色氢氧化铜，然后分解为黑色氧化铜。
8.3消化过程中，若硫酸损失过多，可酌量补加硫酸，勿使瓶内干涸。