細胞培養箱超純水未高壓

1. 二氧化碳培養箱污染怎麼辦

二氧化碳培養箱在放好後，再對箱體和內部進行消毒處理，並且對各項指標進行系統校正，等各項數值穩定一段時間後方可使用。因CO2氣體對於健康是有害的，因此細胞室需安裝足夠的通風裝置。空氣中的粉塵氣溶膠易造成二氧化碳培養箱的污染，需要一個流通的空氣環境。將二氧化碳培養箱的管理任務分派給有經驗的檢查人員是十分重要的。如長期不使用二氧化碳時，應將CO2開關關閉，防止CO2調節器失靈，避免給實驗室帶來安全性事件。

2. 細胞培養常用器材有哪些

1. 超凈工作台

目前絕大部分細胞實驗室使用超凈工作台實現無菌操作，具有操作簡單、安裝方便、佔用空間小且凈化效果很好。安徽人和凈化為您介紹兩種主要超凈工作台-側流式（垂直式）和外流式（水平層流式）。工作原理一般是將室內空氣經粗過濾器初濾，由離心風機壓入靜壓箱，再經高效空氣過濾器精濾，由此送出的潔凈氣流以一定的均勻的斷面風速通過無菌區，從而形成無塵無菌的高潔凈度工作環境。

（1） 側流式工作台：空氣凈化後的氣流由左或右側通過工作檯面流向對側，也有從上向下或從下向上流向對側，形成氣流屏障保持工作區無菌，工作台結構為封閉式；

（2） 外流式工作台：凈化後的空氣面向操作者流動，因而外方氣流不致混入操作，工作台結構為開放式，但進行有害物質實驗操作對操作者不利。超凈工作台應需要定期請有關部門檢查潔凈度，符合要求的超凈工作台其潔凈度應達到100級，用塵埃粒子計數儀檢測粒徑≤5μm的塵埃粒子數量不應超過3.5個/L；空氣流量應控制在0.75-1.0m3/s；細菌菌落數平均<1個，根據無菌狀況必要時需要置換過濾器。

2. 顯微鏡

倒置式顯微鏡是細胞培養實驗室日常工作常規必備設備，主要用於日常了解細胞的生長情況並觀察有無污染發生。如資金允許，建議選用配置有照相系統的高品質相差顯微鏡、解剖顯微鏡、熒光顯微鏡、錄像系統或縮時電影拍攝裝置等，可隨時拍攝並記錄細胞生長情況。

3. 培養箱

體外培養的細胞和體內細胞一樣，需要在恆定的溫度下生存，一般最適生長溫度為37℃，溫差變化不應超過±0.5℃。溫度升高2℃時，變不利於細胞生存，溫度達到40℃以上細胞將很快死亡。因此，可精確控溫的恆溫培養箱、CO2培養箱是最佳選擇。

（1） 恆溫培養箱：應選隔水式或晶體管式自控溫培養箱，此類培養箱靈敏度高，溫度控制較穩定。一般的恆溫培養箱價格較便宜，其缺點是只宜於作密閉式培養。

（2） CO2培養箱：目前多數的細胞培養室已廣泛使用。CO2培養箱的優點是能夠提供進行細胞培養時所需要的一定量的CO2（常用濃度為5％），易於穩定培養液pH，適用於開放或半開放培養。使用培養瓶時，為使培養瓶內與外界保持通氣狀態，可將瓶蓋略微旋松，為避免細胞被污染，使用這種培養方式時，培養箱內空氣必須保持清潔，需定期用紫外線照射或酒精消毒，同時培養箱內應放置盛有無菌蒸餾水的水槽，防止培養液蒸發，保持箱內相對濕度在100%。

（3） 細胞培養耗材：培養細胞的器皿可用培養皿、培養板或培養瓶。

4. 烘箱（乾燥箱）

用於細胞培養的一些器械、器皿必須烘乾後才能使用，玻璃器皿等須乾熱消毒。乾熱消毒時，烘箱內溫度一般要達到160℃以上，通常使用鼓風式烘箱。其優點是溫度均勻、效果較好，缺點是升溫過程較慢。升溫時不能先升溫後鼓風而應鼓風與升溫同時開始，至100℃時，停止鼓風。需注意避免包裹器皿的紙或棉花燒焦，燒焦的碎屑可影響細胞的生長。消毒後不能立即打開箱門，以免驟冷導致玻璃器皿破裂，應等溫度自然下降至100℃以下後可開門。

5. 水純化裝置

細胞培養對水的質量要求較高，細胞培養、細胞培養相關液體的配製用水以及清洗細胞培養器皿用水都必須事先經過嚴格的純化處理。目前有多種純化方法相結合，可使普通水純化為純水和超純水的純水裝置使用非常靈活方便，可掛壁式、台式、可配儲水箱、也可直接用分液槍、還可根據各類實驗用水要求選擇配置殺菌功能，有效去除DNA酶、RNA酶、蛋白酶等，更有可有效去除掉熱源、內毒素的超濾型純水裝置。

6. 冰箱

細胞培養實驗室必備設備，應專用，不得存放易揮發、易燃燒等對細胞有害的物質，且應保持清潔。一般包括普通冰箱、低溫冰箱和超低溫冰箱。

普通冰箱：儲存培養液、生理鹽水、Hanks液試劑等培養用的物品，可短期保存組織樣本。

-20℃低溫冰箱、超低溫冰箱：用於儲存需要冷凍以保持生物活性以及需長時期存放的制劑，如酶、血清等。

7. 細胞冷凍儲存器

儲存器常用的液氮容器，根據使用需要分為不同類型和規格。選擇液氮容器時需要考慮三個因素：容積大小、取放使用方便、液氮揮發量。液氮容器的大小一般在25-500L，可以儲存1ml的凍存管250-15000個左右。液氮溫度最低文帝可達-196℃，使用時應注意避免凍傷。由於液氮易揮發，需注意觀察剩餘液氮量，及時補充，避免液氮不足使細胞受損或死亡。目前有許多智能型細胞冷凍儲存器可供選擇，可配置有電子控制器的液氮儲存器，實現凍存自動化；並可監測液氮水平和樣品溫度，確保樣品溫度始終處於設定溫度點；可配置報警系統，設置液氮液面、溫度、電池、電壓、電源等失常情況下報警；同時具備熱氣體旁路系統，防止高於-130℃的暖空氣進入液氮罐，從而更有效地保護樣品，防止容器內升溫。另外，可選擇液氮供應罐通過連接管給儲存罐補充液氮，保證樣品安全。

8. 離心機

細胞培養時，通常使用離心機制備細胞懸液、調整細胞密度、洗滌和收集細胞。一般常規配置4000rpm台式離心機；若要做細胞沉降，需要使用80-100G離心力，因為離心力過大會損傷細胞。根據不同要求，有大容量、可調溫度離心機、高速離心機和低溫冷凍離心機等更多功能離心機可選擇。

9. 天平

常用的有精密天平和分析天平。分析天平的精確度一般為0.1mg、0.01mg和0.001mg。一般根據取樣量量和精度要求選擇合適的天平：取樣量大於100mg宜選用精確度0.1mg的天平；取樣量100-10mg，選用精確度0.01mg的天平；取樣量10mg宜選用精確度0.001mg的天平。天平需要定期校準，可選擇有自動校準功能的天平，方便維護。天平使用需要注意清潔，避免腐蝕性粉末、液體直接接觸稱量台。答案來自

3. 細胞培養會用到哪些重要的實驗儀器如何做到細胞培養的無菌操作(

重要的實驗儀器蒸餾器、儲品櫃、超凈工作台、水浴鍋、三氧消毒殺菌機。細胞培養的無菌操作需要在無菌台上操作。

具體設備如下：

准備室的設備：單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品櫃（放置未消毒物品）、儲品規（放置消毒過的物品）、包裝台。

配液室的設備：扭力天平和電子天平（稱量葯品）、PH計（測量培養用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。

培養室的設備：液氮罐、儲品櫃（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統、低溫冰箱（-80℃）、空調、二氧化碳缸瓶、邊台（書寫實驗記錄）。

必須放在無菌間的設備：離心機（收集細胞）、超凈工作台、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4℃冰箱（放置serum和培養用液）。

無菌操作：

1、凡是帶入超凈工作台內的酒精、PBS、培養基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。

2、靠近酒精燈火焰操作。

3、器皿使用前必須過火滅菌。

4、繼續使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。

5、各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、准確，不能亂碰。

如吸管不能碰到廢液缸。

6、吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。

4. 如何預防細胞培養的污染問題

1、從物品、用品消毒滅菌著手
細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，並在取樣檢菌一周後確認無菌才能使用。同時，在無菌過濾操作中，隨著濾過體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應選擇最後過濾的液體進行檢測。定期對二氧化碳培養箱進行消毒。具體操作：75%的酒精搽拭培養箱後，使用可移動的紫外燈至少消毒 30min，加入高壓滅菌過的超純水於培養箱水槽中保持濕度。也可配製300ml的飽和硫酸銅加3L滅菌超純水混合成硫酸銅溶液加入水槽中。
2、添加抗生素
各種抗生素性質不同，對各種微生物的作用也不同，聯合應用比單用效果好，預防性應用比污染後使用好。但反復使用抗生素會使微生物產生耐葯性，且對細胞本身也有一定影響，因此為避免誘導抗葯細菌，應定期更換悔態培養系統中的抗生素，或盡可能不用抗生素處理。
3、從操作者做起
（1）進無菌室前要徹底洗手，按規定穿隔離衣。開始操作前要用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。
（2）操作者動作要輕，安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等操作應在火焰近處並經過燒灼進行。但要注意，金屬器械不能在火焰中長時間燒灼，以防退火；燒過的器械要冷卻後才能使用；已吸過培養液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內的培養液成分如蛋白質等燒焦後會產生有害物質，吸管再用時會將其帶到培養液中；膠塞、橡皮乳頭及塑料的細胞培養用品過火焰是也不能時間太長，以免燒焦產生有毒氣體，危害培養細胞，同時塑料細胞培養用品也會產生變形影響使用。
（3）操作時盡量不要談話，咳嗽以防止來自唾沫和呼出的氣流所造成的污染。
（4）使用培養液前不宜過早開瓶，開瓶後的培養液應保持斜位，避免直立，以防止下落細菌的污染。不再使用的培養液應立即封閉瓶口，培養的細胞在處理之前勿過早暴露在空氣中。
（5）操作完畢後應整理好工作檯面，用消毒水浸泡的紗布擦拭檯面。
（6） 吸取培養液、細胞懸液時，應專管專用，一旦發現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去，以防止污染擴大或造成培養物之間的交叉污染。
4、防止細胞交叉污染
所有從別處轉來的或是自己所建的細胞系都要早期留有的充足的凍存儲備，一旦懷疑發生交叉污染，可做細胞遺傳學方面的鑒定，如發現原有的細胞遺傳物發生改變，可以復甦早期凍存的細胞使用。重要細胞系（株）的傳代工作應由兩人獨立進行。
5、無菌室的徹底消毒
1） 新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室。使用前應稀釋即配即用。新潔爾滅和酒精相比，最大的優點是便宜，因為新潔爾滅500ml只需5元，而且可以稀釋50倍用，而同樣量的酒精價格可能是新潔爾滅的幾十倍。
2）甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣體對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。甲醛價廉，熏蒸消毒時不損壞衣服、傢具、皮革、橡膠等。市售的甲醛水溶液中一般含37-40%的甲醛。
其主要用法為：
a）熏蒸消毒：每立方米空間甲醛用量為10~15毫升，熏蒸消毒時應密閉門窗封閉至少4h以上。高錳酸鉀加40%甲緩前滑醛（1:1）混合後放入一開發容器中，立即可見白色甲醛煙霧。消毒後可放入25%氨水蒸發中和刺激氣味。氨水用量為所用甲醛水溶液的一半，時間為30分鍾。甲醛氣體毒性非常強，所以操作時一定需帶上防毒面具。
b）自然揮發： 將較大量的甲醛水溶液放入一敞開容器擾臘中，室內溫度保持在18攝氏度以上，同時室內噴水以保持相對濕度在70%以上，經16小時可達到室內消毒的目的

5. 細胞實驗室是否需要純水，超純水，設計時要不要把純水

細胞實驗室肯定會用到純水、超純水的；不過細胞實驗室用水量不會太大，可以選用小型實內驗室純水系統容，現用現制；例如賽多利斯arium® mini 實驗室純水系統是針對實驗室用水量低於10L而設計，用於制備非關鍵應用所需的緩沖液和培養基。

6. 骨髓瘤 培養

雜交瘤技術在具體操作上，各實驗室使用的程序不盡一致。本節中介紹的方法是作者所在實驗室採用的、實踐證明成熟的程序，該程序適合國內大多數實驗室。

在開展雜交瘤技術制備單抗之前，培養骨髓瘤和雜交瘤細胞必須具備下列主要儀器設備：超凈工作台、CO2恆溫培養箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機（水平轉子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細胞培養瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青黴素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細胞培養板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細胞計數板，叢頌可調微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細胞的篩選與檢測的儀器設備，依據檢測單抗的方法不同而各異，請參閱本節有關部分。

淋巴細胞雜交瘤技術的主要步驟包括：動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等，圖6-1概括了淋巴細胞雜交瘤技術研製單抗的主要過程。

1、動物免疫

(1) 抗原制備制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質不穩定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用於抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定於所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。

(2) 免疫動物的選擇根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源於BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來滑鄭孝源於LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便於操作。

(3) 免疫程序的確定免疫是單抗制備過程中的重要環節之一，其目的在於使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利於細胞融合形成雜交細胞，並增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能適用於各種抗原。現用的免疫程序中多數是參照制備常規多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也採用足墊、皮內、滴鼻或點眼。最後一次加強免疫多採用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇後者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。在最後一次加強免疫後第3天取脾融合為好，許多實驗室的結果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞

融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現的高峰與小鼠血清抗體的滴度並無明顯的平信稿行關系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細胞，這在最後一次加強免疫後第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道採用脾內免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節省時間，一般免疫3天後即可融合。

表6-1 不同免疫抗原的免疫程序

免疫原特性 抗原量 接種次數 間隔時間 單抗的特性 抗體滴度 親和性

免疫原性強（如細胞、細菌和病毒等） 106-107個細胞或1-10ug 2-4 2-4周 高 中等至強

免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高中等或強

免疫原性弱 A.20-400ug 2-4 隨後 2-3 每月 2-3月中等 強

B.10-50ug 其後 200-400ug 2 其後 4 每月 每天 中等 中等

C.10-100ug 2 其後 4 其後「休息」 最後加強 每月 10天 1-2月

中等 中等或強

體內免疫法適用於免疫原性強、來源充分的抗原，對於免疫原性很弱或對機體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能採用體內免疫法。因此，針對這些情況，可採用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細胞（或淋巴結細胞，或外周血淋巴細胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養，然後再與骨髓瘤細胞進行融合。其基本方法是取4-8周齡BALB/c小鼠的脾臟，製成單細胞懸液，用無血清培養液洗滌2-3次，然後懸浮於含10%小牛血清的培養液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，細胞抗原105-106個細胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細胞培養上清液；在37℃，6%CO2濃度下培養3-5天，再分離脾細胞與骨髓瘤細胞融合。

2、細胞融合

（1） 主要試劑的配製

a、 細胞培養基雜交瘤技術中使用的細胞培養基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）兩種基礎培養基，具體配製方法按廠家規定的程序，配好後過濾除菌（0.22um），分裝，4℃保存。

"不完全RPMI-1640培養基：RPMI-1640培養基原液96ml

100×L.G.溶液1ml

雙抗溶液1ml

7.5% NaHCO3溶液1-2ml

HEPES溶液1ml

"不完全DMEM培養基：DMEM 13.37g

超純水或四蒸水980ml

NaHCO3 3.7g

雙抗溶液10ml

100×L.G.溶液10ml

用1N HCl調試PH至7.2-7.4，過濾除菌，分裝4℃保存。

"完全RPMI-1640或DMEM培養基：不完全RPMI-1640或DMEM培養基80ml

小牛血清15-20ml

用於骨髓瘤細胞SP2/0和建株後的雜交瘤細胞培養。

"HT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基99ml

HT貯存液1ml

"HAT培養基：完全RPMI-1640或DMEM培養基98ml

HT貯存液1ml

A貯存液1ml

b、 氨基喋呤（A）貯存液（100×，4×10-5mol/L） : 稱取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶於90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再補加超純水或四蒸水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。

c、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 稱取136.1mg次黃嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超純水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃凍存。用前可置37℃加溫助溶。

d、 L-谷氨醯胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L） : 稱取2.92g L-谷氨醯胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培養液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。

e、 青、鏈黴素（雙抗）溶液（100×）: 取青黴素G（鈉鹽）100萬單位和鏈黴素（硫酸鹽）1g，溶於100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。

f、 7.5% NaHCO3溶液 : 稱取分析純NaHCO3 7.5g，溶於100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。

g、 HEPES溶液（1mol/L）: 稱取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶於100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。

h、 8-氮鳥嘌呤貯存液（100×）: 稱取200mg 8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解後，加入超純水或四蒸水99ml，過濾除菌；分裝小瓶，-20℃凍存。使用時按1%濃度加入到培養液中（即終濃度為20ug/ml）。

g. 用新配製的10% Giemsa染液染色10-20分鍾，然後用自來水洗去染液，自然乾燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保溫2小時，加甲醇33ml混勻，保存於棕色瓶內作為原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。

h. 鏡檢：選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細胞進行觀察分析。每份標本應計數100個完整的中期核細胞，並注意觀察是否有標志染色體。

i、 50% PEG: 稱取PEG 1000 或4000 20-50g於三角瓶中，蓋緊，60-80℃水浴融化，0.6ml分裝於青黴素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鍾，-20℃存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養基，用少許7.5% NaHCO3調PH至8.0，或購買Sigma或Gibco公司現成產品。

⑵ 髓瘤細胞的准備
融合前骨髓瘤細胞維持的方式，對成功地得到雜交瘤是最為重要的。目標是使細胞處於對數生長的時間盡可能長，融合前肯定不能少於1周。凍存的細胞在復甦後要2周時間才能處於適合於融合的狀態，長過了的骨髓瘤細胞至少幾天才可能恢復。在實驗室中處於對數生長的骨髓瘤細胞維持在含10%小牛血清的培養基中，方法是用6個裝5ml培養基的培養瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細胞。1周後到細胞相當密而又未長過的一瓶重新移植。典型的倍增時間為14-16小時。
骨髓瘤細胞懸液的制備方法如下：
a、於融合前48-36小時，將骨髓細胞擴大培養（一般按一塊96孔板的融合試驗約需2-3瓶100ml培養瓶培養的細胞進行准備）。
b、融合當天，用彎頭滴管將細胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集於50ml離心管或融合管內。
c、 1000r/min離心5-10分鍾，棄去上清。
d、加入30ml不完全培養基，同法離心洗滌一次。然後將細胞重懸浮於10ml不完全培養基，混勻。
e、取骨髓瘤細胞懸液，加0.4%台盼藍染液作活細胞計數後備用。細胞計數時，取細胞懸液0.1ml加入0.9ml台盼藍染液中，混勻，用血球計數板計數。計算細胞數目的公式為：每毫升細胞數=4個大方格細胞數×105/4；或每毫升細胞數=5個中方格細胞數×106/2

⑶ 脾淋巴細胞的准備
取已經免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，並分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡於75%酒精中5分鍾，於解剖台板上固定後掀開左側腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈台中用無菌手術剪剪開腹膜，取出脾臟置於已盛有10ml不完全培養基的平皿中，輕輕洗滌，並細心剝去周圍結締組織。將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內芯擠壓脾臟），使脾細胞進入平皿中的不完全培養基。用吸管吹打數次，製成單細胞懸液。為了除去脾細胞懸液中的大團塊，可用200目銅網過濾。收獲脾細胞懸液，1000r/min離心5-10分鍾，用不完全培養基離心洗滌1-2次，然後將細胞重懸於10ml不完全培養基混勻，取上述懸液，加台酚藍染液作活細胞計數後備用。通常每隻小鼠可得1×108-2.5×108個脾細胞，每隻大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細胞。

⑷ 飼養細胞（Feeder cells）的制備
在細胞融合後選擇性培養過程中，由於大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養細胞。飼養細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明了，一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。
常用的飼養細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞。其中以小鼠腹腔巨噬細胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：
按上述采小鼠脾細胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定後，用消毒剪鑷從後腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鍾，隨後吸出注入的培養液。1000r/min離心5-10分鍾，棄上清。先用5ml HAT培養基將沉澱細胞懸浮，根據細胞計數結果，補加HAT培養基，使細胞濃度為2×105/ml，備用。通常對巨噬細胞來說，96孔培養板每孔需2×104個細胞，24孔板每孔需105細胞。每隻小鼠可得3-5×106個細胞，因此一隻小鼠可供兩塊96孔板的飼養細胞。也可在細胞融合前1-2天制備並培養飼養細胞，這樣使培養板孔底先鋪上一層飼養細胞層。做法是，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當於2滴），然後置37℃ 6% CO2的培養箱中培養。

⑸ 細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養
細胞融合的程序已報道的有很多種，這里介紹的是作者所在實驗室常用的一種。
A、將1×108脾細胞與2×107-5×107骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14混合於一支50ml融合管中，補加不完全培養基至30ml，充分混勻。
B、 1000r/min離心5-10分鍾，將上清盡量吸凈。
C、在手掌上輕擊融合管底，使沉澱細胞鬆散均勻;置40℃水浴中預熱。
D、用1ml吸管在1分鍾左右（最佳時間為45秒）加預熱至40℃的50% PEG（PH 8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。
E、用10ml吸管在90秒內加20-30ml預熱至37℃的不完全培養基；20-37℃靜置10分鍾。
F、 1000r/min 5分鍾；棄去上清。
G、 加入5ml HAT培養基，輕輕吹吸沉澱細胞，使其懸浮並混勻，然後補加含腹腔巨噬細胞的HAT培養基至80-100ml。
H、分裝96孔細胞培養板，每孔0.10-0.15ml；分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml；然後將培養板置37℃，6% CO2培養箱內培養。
I、 5天後用HAT培養基換出1/2培養基。
J、 7-10天後用HT培養基換出HAT培養基；（第14天後可用普通完全培養基）。
L、經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。

3、雜交瘤細胞篩選

雜交瘤細胞在融合後2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測。抗體檢測的方法很多，通常根據所研究的抗原和實驗室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、准備、簡便，便於一次處理大量樣品等特點。因為往往有幾百個樣品需要在短短幾個小時就報告結果，以便決定雜交瘤細胞的取捨。所以選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費小和節省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測方法，並克服可能存在的問題。另一個重要問題是抗體檢測方法所需要的「動力學范圍」，即檢出背景以上的最強與最弱信號之比，依所用的檢測抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質抗原的，100%的抗原參與反應，一個陽性/陰性判別系統就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對細胞表面微量的蛋白抗原，檢測系統可能需要能測出微弱信號，則動力學范圍至少應為10：1，最好為100：1。另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預定的用途的影響。結合補體的抗體可以用基於細胞毒性反應的檢測方法來選出。如需結合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結合蛋白A的檢測方法。

下面簡要介紹幾種常用的抗體檢測方法：

⑴ 免疫酶技術

免疫酶技術是將抗原抗體反應的特異性和酶對底物顯色反應的高效催化作用有機結合而成的免疫學技術。由於它特異性強，靈敏度高，現已廣泛用於篩選和鑒定單抗。

A、器材和試劑

a. 包被緩沖液：

碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸餾水，調PH至9.6。

Tris-HCl緩沖液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸餾水至1000ml。

b. 洗滌緩沖液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4"12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至1000ml。

c. 稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。

d. 酶反應終止液（2mol/L H2SO4）：取蒸餾水178.3ml，滴加濃硫酸（98%）21.7ml。

e. 底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L檸檬酸24.3ml，再加50ml蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩定，易形成沉澱，因此一次不宜配製過多。

f. 底物使用液：

OPD底物使用液（測490nm的OD值）：OPD 5mg，底物緩沖液10ml，3% H2O2 0.15ml。

TMBS或TMB底物使用液（測450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物緩沖液10ml，1% H2O2 25ul。

ABTS底物使用液（測410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物緩沖液1ml，3% H2O2 2ul。

g. 抗體對照：以骨髓瘤細胞培養上清作為陰性對照，以免疫鼠血清作為陽性血清。

h. 抗原：可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。

病毒感染的傳代細胞或全菌抗原。

淋巴細胞等懸液。

i. 酶標抗鼠抗體或酶標SPA或其他類似試劑。

j. 細胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸餾水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20℃甲醇。

k. 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。

l. 酶聯免疫閱讀儀；或光鏡。

m. 吸管、加樣器及水浴箱、離心機等。

B、 可溶性抗原的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

a. 純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。

b. 以50-100ul/孔量加入酶標板孔中，置4℃過夜或37℃吸附2小時。

c. 棄去孔內的液體，同時用洗滌液洗3次，每次3-5分鍾，拍干。

d. 每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃封閉2小時；該步驟對於一些抗原，可省略。

e. 洗滌液洗3次；此時包被板可-20℃或4℃保存備用。

f. 每孔加50-100ul待檢雜交瘤細胞培養上清，同時設立陽性、陰性對照和空白對照；37℃孵育1-2小時；洗滌，拍干。

g. 加酶標第二抗體，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小時，洗滌，拍干。

h. 加底物液，每孔加新鮮配製的底物使用液50-100ul，37℃10-30分鍾。

i. 以2mol/L H2SO4終止反應，在酶聯免疫閱讀儀上讀取OD值。

j. 結果判定：以P/N≥2.1，或P≥N 3D為陽性。若陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結果。

C、 全菌抗原的ELISAS

a. 新鮮培養的細菌用蒸餾水或PBS懸浮，並調整細菌濃度至1×108個/ml。必須指出，對於人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是滅活處理。

b. 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml 25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小時，蒸餾水洗滌3次；加上述細菌懸液50ul/孔；37-56℃烘乾；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃ 2小時封閉。

c. 步驟b也可採用先每孔加50ul細菌懸液，37℃-56℃烘乾，然後用-20℃預冷的無水甲醇室溫作用15分鍾，蒸餾水洗滌3次；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃ 2小時封閉。

d. 洗滌液洗3次；此時包被板可在-20℃或4℃保存備用。

e. 以下步驟同上法。

D、 用全細胞抗原的ELISA

a. 按常規方法培養細胞，接種病毒，收獲感染細胞和未感染細胞，進行細胞計數，用PBS製成適當濃度懸液。

b. 淋巴細胞懸液的制備採用新鮮外周血加肝素抗凝後，滴加於淋巴細胞分離液之上，1500rpm離心30分鍾，吸取界面細胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細胞懸液。該細胞懸液中若仍混有紅細胞，離心後加0.83%的氯化銨溶液，室溫10分鍾，洗滌一次即可。將該細胞懸液稀釋至適當濃度。

c. 每孔加100ul上述a或b的細胞懸液，使每孔含細胞5×104個；1500r/min 15分鍾，甩去上清；室溫乾燥或吹乾後用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分鍾；可4℃或-20℃保存備用。

d. 以下步驟同上法。

E、抗體捕捉ELISA試驗

本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb，再依次加抗原、酶標多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELISA中較理想的一種；其操作步驟如下：

a. 以適當濃度的純化抗鼠Ig抗體包被酶標板，每孔加100ul，37℃ 2小時或4℃過夜。

b. 洗滌、拍干後加待測的McAb樣品，37℃ 1-2小時。

c. 洗滌後加適量的抗原，37℃ 1-2小時。

d. 洗滌後加入酶標多克隆抗體，37℃ 1-2小時。洗滌後加底物顯色，判定結果。

7. 生物類實訓室對於環境有哪些要求

要求：

1、通風：

實驗室在實驗過程中會產生大量的有毒有害氣體，對人體產生傷害鎮備，實驗室應保持良好的通風，並裝備相應的通風設施。如通風櫃、萬向排氣罩、原子吸收罩及其他局部排風裝置。必要時需對整個房間設計整體排風和補風系統。

2、溫度和濕度：

為了保障實驗室工作人員有一個適合的工作環境，以及儀器設備有一個穩定的工作狀態，實驗室應保持適宜的溫度和濕度。夏季適宜溫度為18-28℃，冬季為16-20℃，濕度控制在30%-70%之間，在局部實驗區域對濕度和溫度有嚴格要求的可以建立恆溫恆濕室。

3、潔凈度：

經常保持實驗室的清潔非常重要，實驗室換氣過程中室外塵土及其他污染物容易進入實驗室內，導致實驗室含塵量過高，空氣不潔凈影響實驗結果。而且塵土及微粒落在儀器設備元件表面，容易形成故障，或其他潛在危險。

通常實驗室在補風入口加裝過濾網，並及時對室內及設備做清潔。在對潔凈度有特殊要求的實驗區域，應建立潔凈間，根據潔凈要求不同可分為百級、千級、萬級、十萬級等。

(7)細胞培養箱超純水未高壓擴展閱讀：

生物類實訓室常規設備介紹:

1、超凈工作台/生物安全櫃

細胞培養需要無菌要求高的環激旅埋境，在進行操作細胞的實驗時，需要在100級的空氣下進行，那我們就需要購買能提供百級潔凈度的超凈工作台或生物安全櫃了。

2、二氧化碳培養箱

細胞培養所用的緩沖體系是碳酸氫鈉+HEPES體系，所以需要二氧化碳提供緩沖能明螞力維持pH。這時我們就需要一個二氧化碳培養箱來對細胞進行培養。並且由於二氧化碳培養箱通常不具有製冷壓縮機，所以需要用戶確定其細胞房內在夏天也有全天候的空調製冷，否則會造成箱內溫度超標。

3、倒置顯微鏡

需要倒置顯微鏡的幫助。對於一些熒光免疫細胞實驗（IF），則還需要購買倒置的熒光顯微鏡。

4、純水機/超純水機

細胞培養還需要超純水系統，普通的純水和蒸餾水是無法用於細胞培養的，而超純水主要用於配置一些培養基和試劑，超純水的進水可為自來水或二級純水（質量好些的去離子水，電阻10兆歐左右）。

5、移液槍，電動移液槍

細胞實驗操作時，需要使用各種吸頭及移液管，所以配置移液槍是必要的。

6、離心機

細胞培養需要離心收集傳代細胞，一般轉速在1000轉到1500轉之間，所以需要購買低轉速的常溫離心機，而且要帶10ml，50ml及培養板的轉子。另外還需要一台高速冷凍離心機用於收集細胞沉澱或細胞上清。

8. 實驗室純水分幾個等級

實驗室純水分四個等級，即：

1、蒸餾水：

實驗室最常用的一種純水，雖設備便宜，但極其耗能和費水且速度慢，應用會逐漸減少。蒸餾水能去除自來水內大部分的污染物。

2、去離子水：

應用離子交換樹脂去除水中的陰離子和陽離子，但水中仍然存在可溶性的有機物，可以污染離子交換柱從而降低其功效，去離子水存放後也容易引起細菌的繁殖。

3、反滲水：

反滲水克服了蒸餾水和去離子水的許多缺點，利用反滲透技術可以有效的去除水中的溶解鹽、膠體，細菌、病毒、細菌內毒素和大部分有機物等雜質。

4、超純水：

超純水在TOC、細菌、內毒素等指標方面並不相同，要根據實驗的要求來確定，如細胞培養則對細菌和內毒素有要求，而HPLC則要求TOC低。

拓展資料：

實驗室純水的分類與標准：國家實驗室純水標准（GB/T 6682）依據水的純度（水的導電性）分1、2、3級，1級電導率小於0.1μs/cm；2級電導率小於1.0μs/cm；3級電導率小於5.0μs/cm；

泉瑞QTCJ系列小型去離子水設備可滿足用戶的不同需求，產水水量10L-50L/h，水質完全符合國家實驗室1、2、3級標准，不同級別的水其生產工藝、生產產本相差較大，所以其用途也相以區分。

三級水是**級別的實驗室級純水，推薦用於玻璃器皿洗滌；水浴、高壓滅菌鍋用水以及超純水系統的進水。

二級水一般用於常規實驗室應用，比如緩沖液、pH 溶液及微生物培養基的制備；為超純水系統、臨床生化分析儀、培養箱、老化機供水；也可為化學分析或合成制備試劑。

一級水往往用於嚴格的實驗應用，如HPLC 流動相制備；GC 空白樣制備和樣品稀釋、HPLC、AA、ICP-MS等高精度分析技術；緩沖液、哺乳動物培養基制備及試管嬰兒；分子生物學試劑制備(DNA 測序、PCR 擴增等)；電泳及雜交實驗溶液配製等。

通常我們實驗室工作人員為了實驗的准確與精確性，採用一級標準的水用於二級水的實驗應用中。

9. 細胞實驗室是否需要純水、超純水，設計時要不要把純水系統設計進去

你做細胞實驗基本是離不開純水和超純水的，不論你是做動植物實驗、細胞免疫化學、PCR實驗、蛋白質純化以及電泳/凝膠分析，都是要用到超純水的。建議你設計時最好把超純水系統也設計進去，以後你的幾個實驗室直接用設計好的超純水系統的管道取水即可。你可以聯系南京權坤。

10. 如何預防和去除細胞培養過程中的污染

試用中心實驗方法資訊采購保障中心品牌專區NSFC如何預防細胞培養的污染問題2009-10-11 00:00體外培養的細胞受到嚴重污染時，有時即使想盡各種辦法也難以挽回。因此，防止污染，預防是關鍵。只有將預防措施貫穿於整個細胞培養的始終，才能將發生污染的可能性降到最小程度。一般預防可從以下幾方面著手：1、從物品、用品消毒滅菌著手細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，並在取樣檢菌一周後確認無菌才能使用。同時，在無菌過濾操作中，隨著濾過體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應選擇最後過濾的液體進行檢測。定期對二氧化碳培養箱進行消毒。具體操作：75%的酒精搽拭培養箱後，使用可移動的紫外燈至少消毒 30min，加入高壓滅菌過的超純水於培養箱水槽中保持濕度。也可配製300ml的飽和硫酸銅加3L滅菌超純水混合成硫酸銅溶液加入水槽中。2、添加抗生素各種抗生素性質不同，對各種微生物的作用也不同，聯合應用比單用效果好，預防性應用比污染後使用好。但反復使用抗生素會使微生物產生耐葯性，且對細胞本身也有一定影響，因此為避免誘導抗葯細菌，應定期更換培養系統中的抗生素，或盡可能不用抗生素處理。3、從操作者做起（1）進無菌室前要徹底洗手，按規定穿隔離衣。開始操作前要用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。（2）操作者動作要輕，安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等操作應在火焰近處並經過燒灼進行。但要注意，金屬器械不能在火焰中長時間燒灼，以防退火；燒過的器械要冷卻後才能使用；已吸過培養液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內的培養液成分如蛋白質等燒焦後會產生有害物質，吸管再用時會將其帶到培養帶裂液中；膠塞、橡皮乳頭及塑料的細胞培養用品過火焰是也不能時間太長，以免燒焦產生有毒氣體，危害培養細胞，同時塑料細胞培養用品也會產生變形影響使用蠢胡閉。（3）操作時盡量不要談話，咳嗽以防止來自唾沫和呼出的氣流所造成的污染。（4）使用培養液前不宜過早開瓶，開瓶後的培養液應保持斜位，避免直立，以防止下落做皮細菌的污染。不再使用的培養液應立即封閉瓶口，培養的細胞在處理之前勿過早暴露在空氣中。（5）操作完畢後應整理好工作檯面，用消毒水浸泡的紗布擦拭檯面。（6） 吸取培養液、細胞懸液時，應專管專用，一旦發現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去，以防止污染擴大或造成培養物之間的交叉污染。4、防止細胞交叉污染所有從別處轉來的或是自己所建的細胞系都要早期留有的充足的凍存儲備，一旦懷疑發生交叉污染，可做細胞遺傳學方面的鑒定，如發現原有的細胞遺傳物發生改變，可以復甦早期凍存的細胞使用。重要細胞系（株）的傳代工作應由兩人獨立進行。