Ⅰ 某蛋白質等電點為8.14,如採用離子交換色譜法來純化,如何選擇填料和緩沖體系
我的話，第一步會選擇pH7.0-7.4左右過陰離子交換，讓大多數雜蛋白（大多數雜蛋白pI在6左右）、核酸、色素等雜質結合，收集流穿液，此時蛋白溶液的純度和澄清度會大大提高，再校pH7.0或更低pH過陽離子交換進行純化。講究一點的話，在緩沖選擇上可以區分一下陰陽離子緩沖，多數情況影響不大，不必糾結。
Ⅱ 在使用離子交換色譜時,應該選擇什麼樣的離子交換劑選擇什麼樣的骨架
離子交換技術：
Sober 和 Peterson於1956年首次將離子交換基團結合到纖維素上，製成了離子交換纖維素，成功地應用於蛋白質的分離。從此使生物大分子的分級分離方法取得了迅速的發展。離子交換基團不但可結合到纖維上， 還可結合到交聯葡聚糖（S-ephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）上。 近年來離子交換色譜技術已經廣泛應用於蛋白質、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體和多糖的分離和純化。它們的優點是:⑴具有開放性支持骨架，大分子可以自由進入和迅速擴散，故吸附容量大。⑵具有親水性，對大分子的吸附不大牢固，用溫和條件使可以洗脫，不致引起蛋白質變性或酶的失活。⑶多孔性，表面積大、交換容量大，回收率高，可用於分離和制備。
一、基本理論
離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解離的基團，這些基因在水溶液中能與溶液中的其它陽離子或陰離子起交換作用。雖然交換反應都是平衡反應，但在層析柱上進行時，由於連續添加新的交換溶液，平衡不斷按正方向進行，直至完全。因此可以把離子交換劑上的原子離子全部洗脫下來，同理，當一定量的溶液通過交換柱時，由於溶液中的離子不斷被交換而波度逐減少，因此也可以全部被交換並吸附在樹脂上。如果有兩種以上的成分被交換吸著在離子交換劑上，用洗脫液洗脫時，在被洗脫的能力則決定於各自洗反應的平衡常數。蛋白質的離子交換過程有兩個階段——吸附和解吸附。吸附在離子交換劑上的蛋白質可以通過改變pH使吸附的蛋白質失去電荷而達到解離但更多的是通過增加離子強度，使加入的離子與蛋白質競爭離子交換劑上的電荷位置，使吸附的蛋白質與離子交換劑解開。不同蛋白質與離子交換劑之間形成電鍵數目不同，即親和力大小有差異 ，因此只要選擇適當的洗脫條件便可將混合物中的組分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的。
Ⅲ 鍏ㄦ槸騫茶揣涓ㄧ誨瓙浜ゆ崲鑹茶氨錛圛EC錛夊師鐞嗐佹搷浣滆佺偣鍙婂簲鐢
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Ⅳ 離子交換層析蛋白純化
離子交換層析是一種基於不同蛋白質與離子交換樹脂上電荷基團可逆結合力的差異進行分離的技術。離子交換樹脂是帶有電荷基團的高分子聚合物凝膠顆粒，通過這一技術，依據流動相中蛋白質的電荷性質，實現對目標蛋白的分離與純化。
離子交換樹脂主要分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交換樹脂帶負電，能與陽離子物質結合，通常分為強酸型、中等酸型和弱酸型；陰離子交換樹脂帶正電，能與陰離子物質結合，分為強鹼型、中等鹼型和弱鹼型。這些樹脂的離子交換特性取決於電荷基團的解離度，強酸型樹脂對H＊的結合力比Na＋小，弱酸型樹脂對H＇的結合力比Na＊大；強鹼型樹脂對OH 的結合力比CI小，而弱酸型樹脂對OH 的結合力比CT大。
離子交換樹脂的交換容量反映了其與溶液中蛋白質進行交換的能力，它不僅與樹脂本身有關，還與實驗條件密切相關。離子交換樹脂的總交換容量用每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團的毫克當量數來表示，對分離蛋白質的離子交換樹脂而言，通常用每毫克或每毫升交換劑能夠吸附某種蛋白質的量來表示。
在離子交換層析實驗中，選擇合適的離子交換樹脂對於分離效果至關重要。陽離子交換樹脂在等電點pl＜pH條件下與蛋白結合，等電點pl＞pH的蛋白與之結合。強型離子交換樹脂使用的pH范圍廣，適合制備去離子水和分離在極端pH溶液中解離且較穩定的物質。樹脂基質的疏水性影響蛋白質的穩定性和分離效果，分離生物大分子時，應選擇親水性基質的交換劑，以溫和的方式吸附和洗脫蛋白質，避免破壞生物大分子的活性。
離子交換層析的基本步驟包括離子交換樹脂的選擇、離子交換層析柱的制備、緩沖液的制備、加樣、洗脫以及離子交換柱的再生。在加樣過程中，需注意樣品液的離子強度和pH，上樣量應由交換容量決定。洗脫過程中，採用線性梯度洗脫，通過逐步增大離子強度，使結合在離子交換樹脂上的蛋白質組分依次被洗脫下來。洗脫液的選擇需保證在整個洗脫液梯度范圍內，所有待分離蛋白質組分穩定，並能夠被洗脫下來。洗脫速度需保持恆定，以獲得較好的解析度，但需考慮解析度與洗脫速度之間的關系，以優化分離效果。
在離子交換層析實驗中，影響交換容量的因素主要有樹脂顆粒大小、顆粒內孔隙大小、離子強度和pH。顆粒大小和孔隙大小影響離子交換樹脂與樣品組分作用的有效表面積，pH對弱酸和弱鹼型離子交換樹脂影響較大，而離子強度增大通常導致交換容量下降。通過優化實驗條件和參數，可以實現對目標蛋白質的高效純化。
Ⅳ 離子交換層析速問速答
離子交換層析是一種基於樣品的帶電性質進行分離的技術，主要用於蛋白純化。以下為離子交換層析的問答，旨在深入理解該技術。
01、離子交換層析分為哪幾種？
離子交換層析根據配基的不同，主要分為陽離子交換層析和陰離子交換層析。陽離子交換柱可以吸附帶正電荷的蛋白，而陰離子交換柱則吸附帶負電荷的蛋白。
02、如何選擇陽離子還是陰離子？
蛋白是兩性分子，具有等電點（PI）。當緩沖液的PH值低於蛋白的等電點（PI），蛋白帶正電荷時，應選擇陽離子交換柱；反之，當PH值高於等電點（PI），蛋白帶負電荷時，選擇陰離子交換柱。
03、強和弱離子交換劑的區別？
強離子交換劑在PH范圍內載量恆定，弱離子交換劑載量隨PH變化。優先使用強離子交換劑，若選擇性不足，嘗試使用弱離子交換劑。
04、如何選擇緩沖液的PH值？
建議使用PH 6-8的中性緩沖液。通常，選擇與等電點相差1個PH值的緩沖液作為初始嘗試。為了達到最佳分離效果，通常需要進行PH條件的摸索。
05、若不知道蛋白的等電點？
大多數蛋白的等電點低於PH 7，可以使用Q柱進行嘗試，緩沖液使用PH 7。也可以選擇離子交換試劑盒進行摸索。
06、緩沖液的配置？
請參照說明書，注意在添加氯化鈉後調整PH。
07、初次實驗的標准條件？
開始使用緩沖液A：20-50 mM，洗脫緩沖液B：20-50 mM + 1M NaCl。
08、樣品未結合？
可能原因包括：樣品鹽濃度太高、PH優化不足、緩沖液含有帶電物質（如去垢劑）、柱效下降。解決方法包括CIP清洗。
09、結合後無法洗下？
嘗試增加洗脫液鹽濃度、評估蛋白穩定性、優化PH值。
10、純度不足？
解決方法包括：採用線性梯度洗脫、優化緩沖液條件、使用更高解析度產品、增加分子篩、疏水等多步純化。