❶ 急求：離子交換柱層析分離氨基酸的講義
一、目的
學慣用陽離子交換樹脂柱分離氦基酸的操作方法和基本原理.
二、原理
各種氨基酸分子的結構不同,在同一PH時與離子交換樹脂的親和力有差異,因此可依親和力從小到大的順序被洗脫液洗脫下來,達到分離的效果.
三、器材
1、20cmX 1cm層析管 2、試管
3、吸管． 4、恆壓洗脫瓶
5、部分收集器 6、搪磁杯
7、電爐 8、分光光度計
四、試劑和材料
1、．苯乙烯磺酸鈉型樹脂（強酸 lx 8,l00一200目,可用上海華東化工學院產品）
2 、2 mol／L鹽酸溶液
3、2mol／L氫氧化鈉溶液
4、標准氨基酸溶液 天冬氨酸、賴氨酸和組氨酸均配製成 2 mg／mL的0.1M鹽酸溶液.
5、混合氫基酸溶液將上述天冬氨酸、賴氨酸和組氨酸溶液按1：2．5：10的比例混合.
6、檸檬酸－氫氧化鈉一鹽酸沖液（pH5.8）,鈉離子濃度0 .45M）
取檸檬酸（C6O7H8.H20 ）14.25g、氫氧化鈉9.30g和 濃鹽酸 5．25 mL溶於少量水後,定容至 500 mL,冰箱保存.
7、顯色劑 2 g水合茚三酮溶於 75mL乙二醇單甲醚中．加水至 100 mL.
8、50%乙醇水溶液
五、操作
1、層析柱的准備：將強酸型陽離子交換樹脂用氫氧化鈉處理成Na+型後洗至中性（處理方法見第三篇實驗十二）．攪拌一小時後裝成一個直徑1cm．高 16～18 cm的層析柱.
2、氨基酸的洗脫：用P H5.8的檸檬酸緩沖液流洗平衡交換住（裝置如圖）.調節流速為 0.5 mL／min,流出液達床體積的4倍時即可上樣.由柱上端仔細加人氨基酸混合液0．25—0．5 mL,同時開始收集流出液.當樣品液彎月面靠近樹脂頂端時,即刻加入0.5 mL擰檬酸緩沖液沖洗加樣品處.待緩沖液彎月面靠近樹脂頂端時.再加入0．5 mL緩沖液.如此重復兩次,然後用滴管小心注入檸檬酸緩沖液（切勿攪動床面）,並將柱與洗脫瓶和部分收集器相連.開始用試管收集洗脫液,每管收集lmL．共收集60一80管.
3、氨基酸的鑒定：向各管收集液中加lmL水合茚三酮顯色劑並混勻,在沸水浴中淮確加熱15分鍾後冷卻至室溫．再加15 mL的50％乙醇液.放置10分鍾.以收集液第2管為空白,測定A570nm波長的光吸收值.以光吸收值為縱坐標,以柱洗脫體積為橫坐標繪制洗脫曲線.以已知3種氨基酸的純溶液為樣品,按上述方法和條件分別操作,將得到的洗脫曲線與混合氨基酸的洗脫曲線對照．可確定3個峰的大致位置及各蜂為何種氨基酸.
❷ 多糖分離純化—離子交換層析和柱層析
多糖，與蛋白質一樣，對生命過程起著關鍵作用，其復雜結構直接決定了其特性和功能。要深入理解多糖，分離純化步驟至關重要。其中，離子交換層析和凝膠層析是常用的手段。
離子交換層析在多糖純化中應用廣泛，其根據多糖特性，選擇合適的陽離子、陰離子或硼砂交換劑，如DEAE cellulose、DEAE Sephadex（葡聚糖）、DEAE Sepharose（瓊脂糖）系列。以DEAE cellulose-52為例，它作為陰離子交換柱，其填料二乙氨乙基纖維素帶有正電荷，能有效分離中性和酸性多糖，如果膠，通過鹽溶液洗脫，中性糖先被洗脫，陰離子多糖隨後。通過檢測洗脫液糖含量，形成洗脫曲線，實現不同多糖的分離。
相比之下，凝膠層析則側重於分子量的分離。其原理是利用分子篩特性，大分子先流出，小分子後流出，如Sephadex G系列填料，如G-15、G-25用於寡糖分離，G-100和G-200則適用於大分子多糖。通過觀察洗脫曲線，可以精確收集不同分子量的樣品。
❸ 常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種各自的作用原理是什麼
常用的蛋白質純化方法有離子交換色譜、親和色譜、電泳、疏水色譜等等
離子交換色譜：蛋白質和氨基酸一樣會兩性解離，所帶電荷決定於溶液pH。pH小於pI時蛋白質帶正電，pH大於pI時蛋白質帶負電。不同蛋白質等電點的蛋白質在同一個溶液中，表面電荷情況不同。離子交換就是利用不同蛋白質在同一溶液中表面電荷的差異來實現分離的。
親和色譜：生物大分子有一個特性，某些分子或基因對它們有特異性很強的吸附作用。如鎳柱中Ni可以與His標簽的蛋白結合，這種只針對一種或一類物質的吸附就是親和色譜的原理。
電泳：SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中， 與SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，這種復合物由於結合大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態形成僅保持原有分子大小為特徵的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由於SDS與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決於分子大小。
疏水色譜：疏水色譜基於蛋白質表面的疏水區與介質疏水配體間的相互作用，在高濃度鹽作用下，蛋白質的疏水區表面上有序排列的水分子通過鹽離子的破壞被釋放，裸露的疏水區與疏水配體相互作用而被吸附。疏水色譜就是利用樣品中各組分在色譜填料上配基相互作用的差異，在洗脫時各組分移動速度不同而達到分離的目的。隨著鹽離子濃度的降低，疏水作用降低，蛋白質的水化層又形成，蛋白質被解吸附。
❹ 血紅蛋白凝膠過濾層析所需儀器、用具、物品和實驗的具體方案
一、實驗目的
1.了解凝膠柱層析的原理及應用；
2.掌握凝膠柱層析的基本操作技術，為進一步掌握離子交換柱層析、親和層析及吸附層析等其它分離方法打下良好的基礎。
二、實驗原理
凝膠層析：原理與應用
凝膠層析又稱凝凝膠過濾，是一種按分子量大小分離物質的層析方法。該方法是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然後用緩沖液洗脫。大分子無法進入凝膠顆粒中的靜止相中，只能存在於凝膠顆粒之間的流動相中，因而以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，並很快在流動相和靜止相之間形成動態平衡，因此就要花費較長的時間流經柱床，從而使不同大小的分子得以分離。
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凝膠過濾柱層析所用的基質是具有立體網狀結構、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質。這種物質可以完全或部分排阻某些大分子化合物於篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數Kav（被分離化合物在內水和外水體積中的比例關系）表示。Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關，即：
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恆定值，而Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值小；反之，則Kav值增大。因此，在同一凝膠柱上分離分子量不同的物質時，由於流動相的作用，這些分離物質將發生排阻和擴散效應。若緩沖液連續地傾入柱中，柱中物質的排阻和擴散效應也將連續地發生，其最終結果是分子量大的物質先從柱中流出，分子量小的物質則後從柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等時地收集起來，檢測後分段合並相同組分的各管流出物，即等於把分子量不同的物質相互分離開了。其分離效果受操作條件（如基質的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等）的影響，而最直接的影響是Kav值的差異性，Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小，則分離效果很差，或根本不能分開。
分配系數Kav既是判斷分離效果的一個參數，又是測定蛋白質分子量的一個依據。從公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要測出床體積Vt 和外水體積Vo 以及洗脫體積Ve，即可計算出Kav值。而凝膠床總體積Vt可用測量法得到：
由凝膠床的組成可知，床體積Vt等於外水體積Vo、內水體積Vi與凝膠顆粒實際佔有體積Vg之和。即
Vt = Vo+Vi+Vg = Vo+Vi
而Vo和Vi可通過實驗測得：當把分子量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時，其在內水體積和外水體積中的分布是不一樣的。溶液中的分子大於凝膠孔徑上限者不能進入凝膠網孔內，而被排阻在外水體積的溶液中。凝膠床的洗脫體積Ve剛好等於外水體積。即Ve=Vo (Kav=0)。然而，溶液中的分子小於凝膠孔徑下限者能自由進入凝膠網孔內，凝膠床的洗脫體積Ve應等於凝膠床總體積，即Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)。而溶液中的分子大小介於凝膠孔徑上限和下限之間者，則能進入部分凝膠網孔中，故其洗脫體積Ve是在Vo和Vt之間（Kav在0－1之間）。
以床體積Vt（等於pr2h）和測得值Vo來計算分配系數的值為Kav，若以床體積Vt（等於Vo+Vi）和測得值Vo來計算分配系數的值為Kd。在同一層析條件下，對同一物質計算出來的Kav和Kd值盡管有一定的差異性，但都是有效的。只因Kav計算方便，所以目前多使用Kav。分離物在凝膠過濾層析時的行為，除用Kav和Kd表示外，還可用Ve/Vo或Vo/Ve（R值）表示。
反應原理
凝膠過濾不僅常用做物質的分離，還可以根據需要用某種試劑非常方便地處理某種物質，當該物質流經試劑區時，因為可連續接觸新鮮試劑，因而可以充分發生反應，最後經過洗脫，再與過量的試劑分開。本實驗就是通過凝膠過濾，用還原劑FeSO4處理血紅蛋白。即首先在層析柱中加入含有還原劑的溶液，使形成一個還原區帶，當血紅蛋白樣品（血紅蛋白與鐵氰化鉀的混合液）流經還原區帶時，褐色的高鐵血紅蛋白立即生成紫色的還原型血紅蛋白，隨著還原型血紅蛋白繼續下移，與緩沖液中的氧分子結合又形成了鮮紅的血紅蛋白。鐵氰化鉀則因分子量小，在層析柱中呈現其本來的黃色帶而遠遠地落在血紅蛋白的後邊。本實驗操作簡便，直觀性強，趣味性濃，通過肉眼觀察即可檢驗分離效果。
三、實驗材料
1.器材：層析柱，?10×200
2.試劑：
(1) 20mM磷酸二氫鈉
(2) 20mM磷酸氫二鈉
(3) 40mM FeSO4(用時現配)
(4) 0.2M Na2HPO4，80mM Na2H2EDTA
(5) 抗凝血（哺乳動物血樣，以1：X的比例加入%檸檬酸鈉，置於4℃冰箱中保存。貯存期以不超過3個月為宜）
(6) Sephadex G-25
(7) 固體鐵氰化鉀
四、儀器設備
鐵架台、恆流泵
五、實驗步驟
1．凝膠的處理 取3克葡聚糖凝膠（Sephadex-25）乾粉，浸泡於蒸餾水中充分溶脹（室溫，6小時），然後傾斜法除去表面懸浮的小顆粒，最後加入等體積pH7磷酸緩沖液繼續浸泡（磷酸緩沖液用試劑1、2以39:51的比例混合，並用pH計校對）。
2．裝柱 將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約5-7cm高的緩沖液，把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊到入柱中，同時開啟止水螺絲，控制一定的流速，使柱中的凝膠一直處在溶液中。最好一次連續裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現界面。裝柱長度至少8cm。最後放入略小於層析柱內徑的濾紙片，以防將來加樣時凝膠被沖起。
3．平衡 用磷酸緩沖液洗脫，平衡20分鍾。注意液面不要低於凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。
4．血紅蛋白樣品的制備 取1ml抗凝血於燒杯中，加入10ml pH7 20mM磷酸緩沖液，再加入固體鐵氰化鉀，使濃度達到5mg/ml。
5．層析柱還原層的形成 取1ml 40mMFeSO4於小燒杯中，加入1ml 0.2M Na2HPO4,80mM Na2H2EDTA混合液攪拌均勻。待層析柱上緩沖液幾乎全部進入凝膠時，速取該混合液0.4ml加入層析柱中，待混合液完全進入柱床後加入0.7ml緩沖液。（注意還原劑的混合液要新鮮配製，盡可能縮短在空氣中暴露的時間）。
6．上樣 將柱中多餘的液體從底部流出後關閉止水螺絲,取前面制備好的血紅蛋白樣品0.5ml，將樣品溶液小心加到凝膠柱上，打開止水螺絲，使樣品溶液流入柱內。
7．洗脫 用緩沖液進行洗脫，控制緩沖液在約每5秒一滴的流速，觀察並記錄實驗現象。
8．清洗 待所有色帶流出層析柱後，加快流速，繼續清洗層析柱5min