氨基酸的離子交換色譜實驗報告

『壹』 氨基酸分析儀的辨別

1、原理。基於陽離子交換柱分離、柱後茚三酮衍生、光度法測定的離子交換色譜法（IEC）。此類方法由Stein和Moore兩人1958年發明，並於1972年獲諾貝爾獎，是當今國際標准和國家標准以及仲裁和涉外的方法。
2、重要指標。滿足分析需要的技術指標如分離度、重復性等要求，而其中的分離度又是更為重要的指標，因為，色譜理論一般以分離度達到1.2作為兩峰基本分離的判定前提，只有峰分開了，才有意義去討論定性和定量的重復性。
3、指標的真實性。有些廠家只標出個別氨基酸的指標如Asp或Arg，或只用平均數據替代全部數據等等，而儀器性能好，經營信譽較高的廠家就會標出全部氨基酸的指標供用戶參考。
4、儀器的可靠性。如果儀器今天堵了、明天漏了，用戶不僅要付出大量人力財力，分析結果的可信度也將大打折扣。
5、儀器的運行成本。例如是否可以使用國產試劑、柱子壽命（以多少次進樣計算、而不以多少年計算）等。
6、儀器設計是否有利於氨基酸分析。例如是否有惰性氣體保護（茚三酮極易被氧化）、是否提供在線脫氣、是否提供溶液和樣品的製冷控制等。
7、售後服務。分析過程中遇到困難是在所難免，廠家必須能夠快速響應、盡快解決問題。另外，常用備件的價格也是一個重要因素，因為用戶在購買前一般難以注意到售後的問題，而很多廠家也沒有公示自己的常用備件價格，這就為將來的使用埋下了隱患，事實上，也的確有很多儀器在出現一些看似微小的故障之後，就因為維修費用太高而被「束之高閣」。
我想，您要是按照以上的標准去選擇氨基酸分析儀的話，一定能夠選到滿意的儀器，成為您工作中得力的助手。

『貳』 如何用液相色譜儀測氨基酸

反相高效液相色譜法測定煙葉中的游離氨基酸
氨基酸是煙草中的一類重要化學物質，在煙草調制、醇化或發酵、加工直至燃燒過程中，游離氨基酸與還原糖之間可發生酶催化及非酶催化的棕色化反應，生成多種具有蒸煮、烤香、爆米花香味特徵的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶類等雜環化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸還可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。氨基酸含量與煙草製品的吃味有著密切的關系，氨基酸在燃燒裂解過程中一般形成具有刺激性的含氮化合物，對煙氣香吃味產生不良影響，個別氨基酸還產生HCN等危害健康的煙氣成分。一般說來，氨基酸含量太高，煙氣辛辣、味苦、刺激性強烈；含量太低時煙氣則平淡無味缺少豐滿度。因此對氨基酸的分析是一項很有意義的工作，二十世紀60年代以來，國內外在這方面做了大量的工作[1-5]。
植物游離氨基酸樣品的制備，國內外採用的提取劑和純化方法各不相同。據文獻報道[6-7]，鹽酸、不同濃度的乙醇溶液均可以用來提取植物組織中的游離氨基酸；提取液純化則有用陽離子交換樹脂、5%磺基水楊酸、活性炭或乙醚等方法。本實驗對不同的提取方式和不同的純化方法進行了對比研究，確定提取煙葉中游離氨基酸的較佳提取劑和純化方法。提取、純化後的樣品，採用OPA、FMOC聯合柱前衍生反相高效液相色譜法對煙葉中的游離氨基酸進行了測定。該方法使帶氨基和亞氨基基團的氨基酸能夠被同時測定，且得到較好的定性定量結果。
1 實驗
1.1 儀器
Agilent公司HP1100型高效液相色譜儀(帶可變波長紫外檢測器和自動進樣器)，PE公司Lambda Bio40 紫外-可見分光光度計。
1.2 試劑
正纈氨酸（Norvaline，內標），OPA ，FMOC，均為色譜純，Agilent公司提供；硼酸緩沖溶液，Agilent公司提供；
醋酸鈉(NaAc)，分析純，中國醫葯（集團）上海化學試劑公司；三乙胺（TEA），四氫呋喃（THF），乙腈（CH3CN），甲醇(MeOH)，均為色譜純，Fisher公司試劑；
氨基酸標樣包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬醯胺（Asn）、谷氨醯胺（Gln）、絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），均為生化試劑，中國醫葯（集團）上海化學試劑公司；
苯乙烯陽離子交換樹脂（732型），天津樹脂廠。
1.3 樣品處理
將煙葉在烘箱中恆溫40℃烘乾至恆重，粉碎，過80目篩，篩下物為實驗用煙樣粉末，置於廣口瓶中備用。准確稱取煙樣粉末1.000g於乾燥的潔凈試管中，用一定濃度的乙醇溶液室溫超聲波提取半小時，過濾，相同濃度的乙醇溶液洗滌，再提取一次，合並後的濾液用陽離子交換柱洗脫，然後用95ml 4mol/L氨水淋洗陽離子交換柱，淋洗液恆溫濃縮至干，最後用3ml 0.1mol/L稀鹽酸溶液溶解濃縮物，將此溶液離心分離20min，0.45μm微孔濾膜過濾，加入濃度為5nmol/μ1的內標10μ1，定容至50ml，HP1100液相色譜儀進行氨基酸分析。
樣品自動柱前衍生化：Agilent公司G1313A自動進樣器進樣。程序為：吸取5μl硼酸緩沖液，再吸取1μ1 OPA試劑，洗針一次，吸取樣品2μl，原位混合6次。吸取1μl FMOC試劑，洗針一次，原位混合3次，進樣。
1.4 色譜條件
色譜柱：Hypersil AA-ODS C18 2.1×200mm
流動相A：1.36±0.025g醋酸鈉，加入500ml純水溶解，加90μl三乙胺，用1%醋酸調pH=7.20±0.05，再加入1.5ml四氫呋喃，混合均勻。
流動相B：1.36±0.025g醋酸鈉，加入100ml純水溶解，用1%醋酸調pH=7.20±0.05，將此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中，並混合均勻。
流速：0.45ml/min
柱溫：40℃
紫外檢測波長: 0～16min， 338nm； 16～25min，262nm
淋洗梯度：見表1
表1 流動相的淋洗梯度表
Table 1 The gradient time table of mobile phase
序列 時間（min） 流動相A（%） 流動相B（%） 流速（ml/min）
1 0.00 100.0 0.0 0.450
2 15.50 40.0 60.0 0.450
3 18.00 0.0 100.0 0.450
4 21.00 0.0 100.0 0.800
5 23.90 0.0 100.0 0.800
6 24.00 0.0 100.0 0.450
7 25.00 100.0 0.0 0.450
1.5 氮基酸的定性
用標樣色譜圖、文獻參照和標樣加入的方法，通過對照保留時間進行定性，對氨基酸的出峰順序加以確認。
1.6 內標法定量
准確移取濃度為10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合標樣100μl於帶內襯管的樣品瓶中，再加入250pmol/μ1內標溶液100μl，充分混合，液相色譜分析，儀器自動計算各氨基酸的標准曲線。
2 結果與討論
2.1 萃取溶劑的比較
氨基酸可溶解於水、乙醇、甲醇、稀酸等，因此它們均可作為煙葉中游離氨基酸的萃取溶劑，傳統的方法是用乙醇和0.1mol/L的鹽酸。實驗發現，乙醇和0.1mol/L的鹽酸萃取方法比較，提取出的煙葉中的游離氨基酸的總量變化不大，但用鹽酸提取的樣品分析時RSD%較大，平均8.51%，其中超過10%的有4個，甘氨酸的RSD%最大為20%；而用乙醇提取的樣品分析時RSD%相對較小，平均5.12%，超過10%的只有1個。而且鹽酸提取液過濾速度慢，需要30-40min，而乙醇提取液過濾只需10min左右；因此，本實驗選擇乙醇作為煙葉中游離氨基酸的萃取溶劑。
2.2 乙醇濃度的選擇
選擇五種不同濃度的乙醇溶液進行了煙樣中游離氨基酸的提取，測定不同條件下提取液中游離氨基酸的總量，結果如圖1。圖中顯示，在乙醇溶液濃度為80%時，煙樣中總游離氨基酸的提取量最大。而且不同濃度下游離氨基酸的RSD%沒有明顯的變化，因此，選擇80%的乙醇溶液來進行煙樣中游離氨基酸的提取。

2.3 不同純化方法的確定
在最佳乙醇溶液濃度下，分別用活性炭加入提取液吸附雜質、乙醚加入提取液萃取分離雜質、5%磺基水楊酸加入提取液沉澱去除雜質和陽離子交換樹脂吸附雜質四種方法進行了純化實驗。結果發現，活性炭作為純化劑時其色譜圖中雜質峰較少，但同時氨基酸峰亦有多個消失，主要是因為活性炭對氨基酸也有較強的吸附，它在吸附雜質的同時也吸附了需要檢測的氨基酸，故活性炭不適合作為純化劑使用。乙醚和5%磺基水楊酸作為純化劑時，雜質去除不完全，其色譜圖均表現為雜質峰較多，湮沒了大量氨基酸峰，且基線漂移嚴重，給定性定量工作帶來困難。當用陽離子交換樹脂進行純化時，其色譜圖中雜質峰較少，基線平穩，氨基酸峰分離較好，均可以進行定性和定量分析，故本實驗選擇了陽離子交換樹脂作為純化手段。
2.4 色譜分離
2.5 線性范圍及標准曲線
分別取濃度為10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合標樣加入等體積的250 pmol/μ1的內標溶液，進行HPLC分析，以氨基酸濃度為橫坐標，氨基酸與內標的面積比為縱坐標，得到各個氨基酸的標准曲線，如表2所示。從表中可以看出，各氨基酸在10-1000 pmol/μ1的濃度范圍內均有良好的線性，各氨基酸標准曲線的線性相關系數均大於0.99。
表2 氨基酸的標准曲線
Table 2 Standard curves of 17 amino acids
氨基酸 線性方程 相關系數
Asp Y=0.007037x+0.004689 0.9972
Glu Y=0.007520x+0.005375 0.9961
Ser Y=0.006903x+0.038212 0.9988
His Y=0.003719x+0.020168 0.9945
Gly Y=0.005851x+0.018235 0.9966
Thr Y=0.006932x+0.021072 0.9978
Ala Y=0.006275x+0.015314 0.9912
Arg Y=0.006088x+0.016113 0.9920
Tyr Y=0.006734x+0.015022 0.9993
Cys Y=0.006004x+0.009876 0.9985
Val Y=0.006432x+0.009932 0.9927
Met Y=0.006574x+0.010346 0.9905
Phe Y=0.005098x+0.019023 0.9962
Ile Y=0.005976x+0.016235 0.9953
Leu Y=0.006044x+0.015332 0.9964
Lys Y=0.006833x+0.010437 0.9969
Pro Y=0.022455x+0.009376 0.9922
2.6 重現性實驗
取雲南C2F99煙樣做平行實驗（n=5），進行煙葉中游離氨基酸含量的檢測，結果發現： Asp和 Glu含量的RSD%分別為8.0%和8.6%，這可能是二者的分離度不高引起的；His的RSD%為9.0%，這可能與其含量較低，分離效果不好有關。其它氨基酸含量的RSD%均處在3%～7%。
2.7 回收率實驗
用標樣加入法進行回收率實驗，結果見表3。 Thr的回收率僅為68.0%，原因可能與其含量較少有關；其它15種氨基酸的回收率在81.0%～110.5%，平均回收率為93.9%，說明該方法的回收率結果令人滿意。
表3 分析方法的回收率
Table 3 Recovery percents of the analytical method
氨基酸 加入量（mg/g煙樣） 樣品含量（mg/g煙樣） 測定值（mg/g煙樣） 差值（mg/g煙樣） 回收率%
Asp 0.200 0.320 0.499 0.179 89.5
Glu 0.200 0.309 0.484 0.175 87.5
Asn 0.200 0.986 1.208 0.222 110.0
Ser 0.200 0.172 0.334 0.162 81.0
Gln 0.200 0.186 0.368 0.182 91.0
His 0.200 0.106 0.297 0.191 95.5
Gly 0.200 0.064 0.279 0.215 107.5
Thr 0.200 0.052 0.188 0.136 68.0
Ala 0.200 0.642 0.835 0.193 96.5
Arg 0.200 0.266 0.463 0.197 98.5
Val 0.200 0.090 0.259 0.169 84.5
Phe 0.200 0.218 0.406 0.188 94.0
Ile 0.200 0.026 0.191 0.165 82.5
Leu 0.200 0.028 0.199 0.171 85.5
Pro 0.200 1.432 1.653 0.221 110.5
Tyr 0.200 0.062 0.245 0.183 91.5
2.8 樣品分析
利用該方法對不同等級的煙葉中游離氨基酸的含量進行了分析，結果見表4。從表中可以看出，在所分析的樣品中，烤煙煙葉中含量最高的氨基酸是Pro，白肋煙煙葉中含量最高的氨基酸是Asp和Asn；白肋煙煙葉中氨基酸的含量高於烤煙煙葉；相同等級的烤煙煙葉，雲南煙葉中的氨基酸含量高於其它產區。
表4 不同等級煙葉中游離氨基酸的含量（mg/g煙樣）
Table 4 Amounts of free amino acids in different
grade tobacco leaves（mg/g tobacco leaves）
氨基酸 雲南烤煙C1F 雲南烤煙C2F 雲南烤煙C1L 雲南烤煙B1F 雲南烤煙B2F 福建烤煙B1F 福建烤煙C1F 四川烤煙C1F 四川烤煙B1F 貴州烤煙C1F 貴州烤煙B1F 貴州烤煙C1L 鄂西白肋中一 鄂西白肋中二
Asp 0.24 0.31 0.60 0.40 0.38 0.37 0.26 0.37 0.26 0.26 0.32 0.35 1.73 1.59
Glu 0.36 0.32 0.21 0.17 0.16 0.11 0.15 0.20 0.30 0.32 0.29 0.25 0.54 0.61
Asn 0.91 0.34 1.50 0.95 0.38 0.18 0.25 0.35 0.32 0.44 0.55 0.48 7.70 7.62
Ser 0.16 0.10 0.18 0.16 0.10 0.12 0.24 0.21 0.19 0.20 0.19 0.15 0.62 0.58
Gln 0.19 0.05 0.22 0.17 0.04 0.06 0.10 0.11 0.10 0.11 0.15 0.10 0.18 0.20
His 0.11 0.02 0.14 0.10 0.06 0.06 0.11 0.09 0.07 0.09 0.08 0.09 0.20 0.22
Gly 0.10 0.09 0.19 0.17 0.07 0.08 0.12 0.15 0.12 0.15 0.13 0.12 0.16 0.19
Thr 0.05 0.05 0.08 0.06 0.05 0.04 0.08 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.19 0.16
Ala 0.65 0.55 0.84 0.69 0.54 0.51 0.65 0.59 0.55 0.48 0.53 0.70 0.57 0.55
Arg 0.29 0.21 0.32 0.28 0.18 0.26 0.32 0.28 0.25 0.33 0.29 0.33 0.48 0.42
Tyr 0.06 0.07 0.06 0.07 0.06 0.05 0.07 0.05 0.06 0.06 0.07 0.06 0.10 0.15
Val 0.10 0.10 0.12 0.11 0.10 0.14 0.15 0.13 0.12 0.15 0.14 0.13 0.21 0.25
Met 0.07 0.07 0.09 0.08 0.06 0.06 0.08 0.08 0.08 0.07 0.09 0.08 0.12 0.13
Phe 0.26 0.12 0.28 0.23 0.10 0.21 0.25 0.21 0.25 0.28 0.30 0.33 0.44 0.59
Pro 1.14 0.83 2.13 1.51 0.69 0.66 1.03 1.23 1.11 1.32 1.18 1.09 0.25 0.35
總量 4.69 3.23 6.96 5.15 2.97 2.91 3.86 4.14 3.86 4.33 4.37 4.31 13.49 13.61
3 結論
本煙葉中游離氨基酸的分析方法採用80%的乙醇作為萃取溶劑，陽離子交換樹脂對提取液進行純化，能夠最大程度地提取煙葉中的游離氨基酸並較好地去除了影響氨基酸測定的雜質，使色譜圖中雜質峰較少；OPA、FMOC聯和柱前衍生使帶氨基和亞氨基基團的氨基酸同時得到測定；良好的梯度洗脫使各個氨基酸峰得到較好的分離，並使定量結果更加可靠。

『叄』 離子交換色譜法簡介

離子交換色譜法（Ion Exchange Chromatography, IEC），一種起源於20世紀70年代並於80年代迅速發展的高效分析手段，特別適用於無機化合物，特別是無機陰離子的混合物分析。

該方法基於一個基本原理，即被分離的化合物與其固定相之間通過離子交換作用實現分離。固定相的核心是離子交換樹脂，其分子結構中分布著許多可電離的活性位點。在分離過程中，待分析組分中的離子會與這些活性位點發生離子交換，形成一個動態的離子交換平衡。在這個平衡狀態下，待分離離子與固定相中的固有離子競爭占據交換中心，隨著流動相的移動，這種競爭導致它們在流動相和固定相之間發生相對移動，從而實現了有效的分離。

離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法進行分離。現在它不僅適用於無機離子混合物的分離，亦可用於有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質等生物大分子，因此應用范圍較廣。

『肆』 為什麼說離子交換色譜法是分離蛋白質的最佳方法

它是根據蛋白質的組成物質氨基酸的物理性質（基於氨基酸電荷行為）為分離基礎的方法。相對透析和超過濾及凝膠過濾來說，可以針對多種蛋白質中的某一種（前提是知道蛋白質的氨基酸組成及其離子交換樹脂的親和度及洗脫強度）進行分離。（而透析和超過濾還有凝膠過濾方法更大的取決於相對分子質量及其結構 分離出的單一蛋白質純度相對要低 並且凝膠過濾要求凝膠對要求組分不能有吸附作用 適用性較低 ） 相對鹽溶和鹽析來說，分離單一蛋白質的純度要高，且更好的保留其天然理化性（鹽溶要求蛋白質分子吸附某一鹽離子從而改變其溶解性 但有些蛋白質吸附某些鹽離子後其蛋白質構象及理化性會發生改變）。 相對有機溶劑分級分離法，更好的保留其天然理化性（有機溶劑分類法易造成蛋白質不可逆變形 且適用范圍窄） 相對凝膠電泳和等電聚焦來說 更易於實現大量制備分離 且不改變蛋白質結構和功能（電泳會影響蛋白質結構 且操作繁瑣 成本高） 相對親和層析來說 它更加易於實現且成本低廉效果也不錯（親和層析需要制備其配體並與載體交聯 因而制備難且成本較高）
PS: 最好的分離方法不是例子交換色譜法 而是高效液相色譜法 相對離子交換色譜來說有著更高的效率、更高的解析度和過柱速度

『伍』 離子交換色譜法表達式

離子交換色譜法是一種分離和分析技術，其核心概念是基於離子與樹脂之間的親和力差異。在這個過程中，一個重要的參數是分配系數，也被稱為選擇系數，它用以衡量離子在樹脂上結合和在流動相中游離的程度。這個參數的數學表達式為：

K_s = frac{[RX^+]}{[X^+]}

在這里，[RX^+] 代表與離子交換樹脂活性中心結合的特定離子（RX+）的濃度，它反映了離子在樹脂上的吸附程度。而 [X^+] 則表示在流動相中未被樹脂吸附的同種離子（X+）的濃度，代表了離子在流動相中的濃度。通過這個表達式，我們可以評估離子在色譜過程中的保留行為，從而進行有效的分離和分析。

離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法進行分離。現在它不僅適用於無機離子混合物的分離，亦可用於有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質等生物大分子，因此應用范圍較廣。