① 抗體偶聯葯物（ADC）分析與表徵
抗體偶聯葯物(ADC)作為生物治療葯物的新興領域，融合抗體、連接子和小分子細胞毒素，展現出獨特的優勢。ADC的復雜結構與傳統抗體葯物不同，其復雜性源自抗體種類、偶聯方式、連接子與毒素種類等因素。因此，建立ADC分析方法具有特殊性，需針對每類ADC的自身質量屬性進行差異化開發，以應對產品安全性和有效性相關的物理、化學、生物或微生物性質的檢測需求。關鍵質量屬性包括一級結構、高級結構、純度與雜質、載葯量與葯物分布、含量、效價等。ADC產品的質量控制重點關注於載葯量與葯物分布、游離葯物、分子大小變異體和電荷變異體。
DAR（Drug-to-Antibody Ratio）是衡量每個抗體上偶聯的小分子葯物數量的關鍵指標，直接影響ADC的療效和安全性。常規定量方法如光譜（UV-Vis）、色譜（HPLC）和質譜（LCMS）在DAR分析中發揮重要作用。UV-Vis光譜適用於具有紫外可見發色團的有效載荷，其分析需滿足抗體部分和載荷部分的光吸收性質差異。HPLC中的疏水色譜（HIC）和反相色譜（RP）分別通過結合和洗脫條件的不同，實現ADC分子的分離和DAR的定量。質譜方法（LC-MS）利用電噴霧電離和飛行時間或Orbitrap技術區分ADC的異質分子物種，提供足夠的解析度。
游離葯物是所有ADC共有的重要質量屬性，監測其數量有助於評估潛在毒性風險。開發和應用適當的方法來檢測、表徵和量化游離葯物是關鍵，常規方法包括UV-Vis光譜、HPLC、LC-MS等。
分子大小變異體，如聚集體、片段等，是影響蛋白質療法療效和安全性的關鍵因素。體積排阻色譜（SEC）、光散射（SEC-MALS）等技術可用於分析ADC分子聚合體，非還原/還原毛細管電泳（non-reced/reced Capillary Electrophoresis）則適用於ADC片段的分析表徵。
電荷變異體作為關鍵質量屬性，對穩定性和生物活性具有潛在影響。ADC中觀察到的與電荷相關的異質性源於多種因素，包括抗體電荷變異性、偶聯工藝過程引入的修飾、小分子葯物結構以及偶聯位點引起的電荷變化等。離子交換色譜（IEX）和等點聚焦電泳（iCIEF）等技術可用於監測電荷變異體。
ADC的分析技術不斷進步，為開發人員提供工藝和處方開發所需的信息，同時也確保了質量控制批放行和穩定性測試的穩健性。ADC作為抗癌治療的潛力葯物，通過改進分析技術，為開發更高效、安全的葯物提供了關鍵支持。
② 從牛奶中分離出蛋白質的方法
從牛奶中分離酪蛋白和乳糖
一、引言
牛奶中主要的蛋白質是酪蛋白，含量約為35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸鈣-磷酸鈣復合體膠粒存在，
膠粒直徑約為20～800納米，平均為100納米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白會沉澱，加工後可製得乾酪或乾酪素。本實驗利用加酸，當達到酪蛋白等電點PH=4.7時，酪蛋白沉澱。脫脂乳中除去酪蛋白後剩下的液體為乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，還有溶解狀態的乳糖，乳中糖類的99.8%以上是乳糖，可通過濃縮、結晶製取乳糖。
二、實驗材料和試劑
脫脂乳或脫脂奶粉。
醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（PH=4.7），95%乙醇，乙醚，碳酸鈣粉末，苯肼試劑。
三、實驗步驟
1. 從牛奶中分離酪蛋白
在燒杯中加入2g脫脂奶粉，再加入40ml40℃，PH=4.7的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液40ml，
用PH精密試紙檢驗液體的PH值。靜置冷卻至室溫，傾去上層清液（留作分離乳糖用），剩下的懸浮液分別裝入兩支離心試管中，用轉速為2000轉/分離心分離3～5分鍾，傾出上層清液，（合並於上一清液中），得酪蛋白粗品。於離心管中加入5ml蒸餾水，用玻棒充分攪拌，洗滌除去其中的水溶性雜質（如乳清蛋白，乳糖以及殘留的緩沖溶液），離心後棄去上層液，再用蒸餾水洗一次。於試管中加入5ml95%乙醇，充分攪拌，離心後棄去乙醇溶液，用乙醇洗滌主要是除去磷脂類物質。最後再用5ml乙醚以同樣方法洗滌，以除去脂肪類物質。將酪蛋白沉澱物涼干，稱重、並計算得率。
2. 從牛奶中分離乳糖
在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，攪拌均勻後加熱至沸。加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加熱時乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉澱。過濾除去沉澱，在濾液中加入1～2粒沸石，加熱濃縮至3～5ml，加入10ml 95%乙醇（注意離開火焰）和少量活性炭，攪拌均勻後在水浴上加熱至沸騰，趁熱過濾，濾液必須澄清。加塞放置過夜，乳糖結晶析出，抽濾，用95%乙醇洗滌產品。
3. 乳糖成脎試驗
取自製乳糖溶於少量水中，濃度約為5%，在試管中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼試劑①，搖勻，試管口用棉花塞住，在沸水浴中加熱，並不時振搖，加熱10～15分鍾後，取出放置冷卻，乳糖脎成結晶析出。取少量乳糖脎在顯微鏡下觀察其結晶形態，可證實為乳糖。
①苯阱試劑有毒，小心使用，勿觸及皮膚，如觸及皮膚先用稀醋酸洗，再用水洗。
另外附上：
蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：
（一）材料的預處理及細胞破碎
分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要採用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：
1. 機械破碎法
這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。
2. 滲透破碎法
這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。
3. 反復凍融法
生物組織經凍結後，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜採用此法。
4. 超聲波法
使用超聲波震盪器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。
5. 酶法
如用溶菌酶破壞微生物細胞等。
(二) 蛋白質的抽提
通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利於蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。
（三）蛋白質粗製品的獲得
選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：
1. 等電點沉澱法
不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉澱法使它們相互分離。
2. 鹽析法
不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉澱析出。被鹽析沉澱下來的蛋白質仍保持其天然性質，並能再度溶解而不變性。
3. 有機溶劑沉澱法
中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉澱出來，因此可用來沉澱蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由於有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。
（四）樣品的進一步分離純化
用等電點沉澱法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。