『壹』 考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量的原理是什麼
在酸性條件下，考馬斯亮蘭G-250染料與蛋白質疏水區結合，導致最大吸收峰由465 nm 變為595 nm，同時顏色也由棕色變為藍色,該藍色化合物顏色的深淺與蛋白質濃度的高低成正比關系。將蛋白質樣品或稀釋的BSA 與Bradford試劑混合，測量在595 nm處的吸收值，在建立由一系列稀釋的BSA建立的標准曲線的情況下，蛋白質的濃度可以根據標准曲線而確定。
考馬斯亮藍G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測定蛋白質含量屬於染料結合法的一種。在游離狀態下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合後變為青色，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用於蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內保持穩定。
該法是1976年Bradford建立，試劑配製簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度范圍為0～1 000μg/mL，最小可測2.5μg/mL蛋白質，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。
考馬斯亮藍有G250和R250兩種。其中考馬斯亮藍G250由於與蛋白質的結合反應十分迅速，常用來作為蛋白質含量的測定。考馬斯亮藍R250與蛋白質反應雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。
考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程：
該方法用於大多數蛋白質的定量是比較精確的，但不適用於小分子鹼性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0．2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然後，用蒸餾水補充至1000ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。
2．標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標准。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標准曲線。
3．將待測樣本溶於緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，如出現沉澱，過濾除去。
5．每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min．
6．根據標准曲線計算待測樣本的濃度。
『貳』 考馬斯亮藍g250配製，溶解時間
一般攪拌20分鍾吧，完全溶解不太可能，攪拌後加上水會容的更多一些，最後要過濾的
『叄』 有人有western blot的Tris-乙酸膠的配方嗎還有相關電泳液的配方急！急！急！非常感謝！
一、SDS-PAGE電泳所用溶液：
1）30 %聚丙烯醯胺溶液 (100 mL)
丙烯醯胺 (Arc) 29 g
N,N』-亞甲雙丙烯醯胺 (Bis) 1 g
用雙蒸水定容至100mL，過濾備用，4℃存放
丙稀醯胺29.2g，N-N-甲叉雙丙稀醯胺0.8g，加入去離子水定容至100mL，pH值不能超過7.0，過濾於棕色玻璃瓶中4℃貯存。
2）5×Tris-甘氨酸緩沖液 (1 L)
Tris鹼 15.1 g
甘氨酸(電泳級) 94 g
10 %SDS 50 mL
使用時稀釋5倍使用
3）2×SDS凝膠加樣緩沖液(10mL)
0.5 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 2 mL
10％(W/V)SDS 4 mL
甘油 2 mL
β-巰基乙醇 1.0 mL
(DTT（二硫蘇糖醇） 0.31g)
溴酚蘭 0.02g
雙蒸水 0.5 mL
室溫存放備用
4）考馬斯亮藍染色液
考馬斯亮藍R-250 （G-250） 1.0 g
甲醇 450 mL
冰醋酸 100 mL
ddH2O 450 mL
0.2g考馬斯亮藍R250+84mL 95％乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，過濾備用
5）考馬斯亮藍脫色液（甲醇脫色液效果好，但有毒性）
甲醇 100 mL
冰醋酸 100 mL
ddH2O 800 mL
醫用酒精：冰醋酸：水=4.5：0.5：5(V：V：V)
二、SDS-PAGE所需溶液:
A液——30％丙稀醯胺（W/V）：丙稀醯胺29.2g，N-N-甲叉雙丙稀醯胺0.8g，加入去離子水定容至100mL，pH值不能超過7.0，過濾於棕色玻璃瓶中4℃貯存。B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs鹼，溶於80mL（40mL）去離子水中，加入約3mL(1.5mL)以上的濃鹽酸調節pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs鹼，溶於80mL（40mL）去離子水中，加入約7mL(3.5mL)以上的濃鹽酸調節pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶於去離子水中，定容至100mL(20mL)，加熱至68℃助溶。E液——10％過硫酸銨：5g(0.5g)過硫酸銨，溶於50mL(5mL)去離子水中；現配現用或分裝至0.5mL離心管中冷凍備用。
F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室溫保存。
三、配製Tris-甘氨酸SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分離膠所用溶液
表1.配製Tris-甘氨酸SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分離膠所用溶液成分 | 配製不同體積和濃度凝膠所需各成分的體積/mL | |||||||
5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 40 | 50 | |
10 %膠 | ||||||||
水 | 1.9 | 4.0 | 5.9 | 7.9 | 9.9 | 11.9 | 15.9 | 19.8 |
30 %丙烯醯胺混合液 | 1.7 | 3.3 | 5.0 | 6.7 | 8.3 | 10.0 | 13.3 | 16.7 |
1.5 mol/L Tris(pH8.8) | 1.3 | 2.5 | 3.8 | 5.0 | 6.3 | 7.5 | 10.0 | 12.5 |
10 % SDS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
10 % 過硫酸銨 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
TEMED | 0.002 | 0.004 | 0.006 | 0.008 | 0.01 | 0.012 | 0.016 | 0.02 |
12 %膠 | ||||||||
水 | 1.6 | 3.3 | 4.9 | 6.6 | 8.2 | 9.9 | 13.2 | 16.5 |
30 %丙烯醯胺混合液 | 2.0 | 4.0 | 6.0 | 8.0 | 10.0 | 12.0 | 16.0 | 20.0 |
1.5 mol/L Tris(pH8.8) | 1.3 | 2.5 | 3.8 | 5.0 | 6.3 | 7.5 | 10.0 | 12.5 |
10 % SDS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
10 % 過硫酸銨 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
TEMED | 0.002 | 0.004 | 0.006 | 0.008 | 0.01 | 0.012 | 0.016 | 0.02 |
表2. 配製Tris-甘氨酸SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳濃縮膠所用溶液 | ||||||||
成分 | 配製不同體積和濃度凝膠所需各成分的體積/ml | |||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 8 | 10 | |
水 | 0.68 | 1.4 | 2.1 | 2.7 | 3.4 | 4.1 | 5.5 | 6.8 |
30 %丙烯醯胺混合液 | 0.17 | 0.33 | 0.5 | 0.67 | 0.83 | 1.0 | 1.3 | 1.7 |
1.5 mol/L Tris(pH6.8) | 0.13 | 0.25 | 0.38 | 0.50 | 0.63 | 0.75 | 1.0 | 1.25 |
10 % SDS | 0.01 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 | 0.08 | 0.1 |
10 % 過硫酸銨 | 0.01 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 | 0.08 | 0.1 |
TEMED | 0.001 | 0.002 | 0.003 | 0.004 | 0.005 | 0.006 | 0.008 | 0.01 |
『肆』 測蛋白用的考馬斯亮藍怎麼配的
測蛋白用的考馬斯亮藍配方
稱取考馬氏亮藍G250（注意不是R250）50mg，
加95%乙醇25ml溶解，
加85%磷酸50ml，
H2O定容到500ml，
過濾去除少量未溶解物。
4度保存備用。