發酵液中鏈黴菌過濾

A. 在制黴菌素化學效價測定中，為什麼要加磷酸，而且還要沸水浴啊

制黴菌素發酵、提取與效價測定

1.1.1 目的與要求

(1) 了解抗生素發酵的一般過程及發酵過程中一些重要理化指標檢測方法；

(2) 學習抗生素（制黴菌素）的提取純化工藝；

(3) 了解制黴菌素化學效價測定的原理；

(4) 掌握抗生素生物效價測定的常規方法——管碟法的原理與操作。

1.1.2 基本原理

1.1.2.1制黴菌素

制黴菌素(nystatin)是由諾爾斯鏈黴菌(Streptomyces noursei)產生的一種多烯大環內酯類(polyene macrolides) 抗真菌抗生素。此類抗生素的結構特點是在分子中既有經內酯化作用而閉合的大碳環，又有一系列的共軛雙鍵。

制黴菌素存在於菌絲體中，其純品為淡黃色微細晶體；不溶於水、氯仿和丙酮等；稍溶於低級醇等；溶於吡啶、冰醋酸和NaOH溶液，但均能使其破壞而失效；對較高和較低的pH以及光和熱均不穩定。臨床上使用的制黴菌素，其主要成分為制黴菌素A1，化學結構式如下圖所示：

圖1-1 制黴菌素化學結構圖

它的氨基糖部分是氨基海藻糖，即3-氨基-3,6-二脫氧-D-吡喃甘露糖，非糖部分為38元的多烯大環內酯。
制黴菌素對各種真菌如白色念珠菌、隱球菌、莢膜組織胞漿菌及球孢子菌等有抑製作用。主要用於白色念珠菌感染，如消化道念珠菌病、鵝口瘡、念珠菌性陰道炎及外陰炎等。但口服治療全身性真菌感染或深部真菌感染則無效。制黴菌素的作用機理是與真菌細胞膜上的特異甾醇相結合，導致原生質膜破壞，通透性改變，以致重要的細胞內容物外漏而死亡，從而殺滅真菌。由於細菌原生質膜上不含甾醇，故本品對細菌無效；對腸道正常菌叢也無作用。

1.1.2.2 抗生素發酵生產工藝簡介

抗生素液體發酵共分為三大工序：菌種、發酵和提取。配合三個工序進行分析化驗和有關產物測定。具體而言，其過程為菌種→孢子制備→種子制備→發酵→發酵液預處理→提取與精製→成品包裝。

菌種一般採用液氮超低溫保藏或沙土管保藏。一般生產用菌種經多次轉接往往會發生變異而退化，故必須經常進行菌種選育和純化，以提高其生產能力。

生產用的菌株須經純化和生產能力的檢驗，若符合規定，才能用來制備種子。制備孢子時，將保藏的處於休眠狀態的孢子，經過嚴格的無菌程續，將其接種到經滅菌過的固體斜面培養基上，在一定條件下培養至孢子量符合生產需要，必要時可用大茄子瓶在固體培養基上擴大培養。

種子制備的目的是使孢子發芽、繁殖，以獲得足夠數量的菌絲，並接種到發酵罐中。種子制備可用搖瓶培養後再接入種子罐進行逐級擴大培養；或直接將孢子接入種子罐後就、逐級放大培養。種子擴大培養級數的多少，決定於菌種的性質、生產規模的大小和生產工藝的特點。擴大培養級數通常為二級。

發酵過程的目的是使微生物大量分泌抗生素。發酵接種量一般為10%或10%以上，發酵周期視抗生素品種和發酵工藝而定。發酵期間，每隔一定時間應取樣進行生化分析、鏡檢和無菌檢驗。分析或控制的參數有菌絲形態和濃度、殘糖量、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、pH、通氣量、攪拌轉速和液面控制等。

發酵液的過濾和預處理的目的不僅在於分離菌絲，還需將一些雜質除去。盡管對多數抗生素品種在生產過程中，當發酵結束時，抗生素存在於發酵液中，但也有個別品種當發酵結束時抗生素大量存在於菌絲之中，在此情況下，發酵液預處理目的包括使抗生素從菌絲中析出轉入發酵液或使菌絲體與發酵液分離。
抗生素成品。在發酵液中抗生素濃度很低，而雜質的濃度相對較高。雜質中含有無機鹽、殘糖、脂肪、各種蛋白質及其降解物、色素、熱源質或有毒性物質等。此外還可能有一些雜質，其性質和抗生素很相似，這就增加了提取和精製的困難。

由於多數抗生素不很穩定，且發酵液易被污染，故整個提取過程要求：時間短、溫度低、pH宜選擇對抗生素較穩定的范圍、勤清洗消毒。

目前常用的抗生素提取方法有溶媒萃取法、離子交換法和沉澱法等。

精製是抗生素生產的最後步驟，對產品精製、烘乾和包裝的階段要符合「葯品生產管理規范」（即GMP）的規定。抗生素精製可選用的步驟有：脫色和去熱源質、結晶和重結晶、共沸蒸餾法、柱層析法、鹽析法、中間鹽轉移法和分子篩等。

B. 鏈黴素的生產過程

分為兩大步驟：①菌種發酵，將冷干管或沙土管保存的鏈黴菌孢子接種到斜面培養基上，於27℃下培養7天。待斜面長滿孢子後，製成懸浮液接入裝有培養基的搖瓶中，於27℃下培養45～48小時待菌絲生長旺盛後，取若干個搖瓶，合並其中的培養液將其接種於種子罐內已滅菌的培養基中，通入無菌空氣攪拌，在罐溫27℃下培養62～63小時，然後接入發酵罐內已滅菌的培養基中，通入無菌空氣，攪拌培養，在罐溫為27℃下，發酵約7～8天。②提取精製，發酵液經酸化、過濾，除去菌絲及固體物，然後中和，通過弱酸型陽離子交換樹脂進行離子交換，再用稀硫酸洗脫，收集高濃度洗脫液──鏈黴素硫酸鹽溶液。洗脫液再經磺酸型離子交換樹脂脫鹽，此時溶液呈酸性，用陰離子樹脂中和後，再經活性炭脫色得到精製液（見彩圖）。精製液經薄膜濃縮成濃縮液，再經噴霧乾燥得到無菌粉狀產品，或者將濃縮液直接做成水針劑。

C. 求鏈黴素詳細生產工藝流程

鏈黴素（Streptomycin）是1944年從灰色鏈黴菌（Streptomyces,griseus）培養液中分離出來的一種鹼性抗生素，我國於1958年以來大量生產，目前已形成了相當大的生產規模與能力。

傳統工藝

鏈黴素早期的提取方法採用活性炭吸附法、帶溶法、沉澱法、離子交換法。目前國內外多採用離子交換法提取鏈黴素，其工藝流程如Fig.1.7.

Fig.1.7鏈黴素傳統工藝流程

然而鏈黴素發酵液中絕大部分是菌絲體和未用完的培養基，以及各種各樣的代謝產物，如：蛋白質、多肽、色素和Ca2＋、Mg2＋離子等等，鏈黴素濃度遠較各種雜質的低，僅為5000單位/毫升左右。大量蛋白、多肽和高價離子(Ca2＋、Mg2＋)的存在對離子交換吸附影響很大。在離子交換處理前，一般採用蒸汽加熱（70～75℃）方法使蛋白質凝固變性。添加磷酸或一些絡合劑如三聚磷酸等使高價離子草酸、磷酸生成不溶性沉澱物，然後通過板框過濾或離心分離將這些沉澱物除去。這一預處理將導致10％以上的鏈黴素所添加的草酸、磷酸或絡合劑，既增加了鏈黴素提煉成本，又會降低產品純度、污染環境。同時所得的發酵濾液中仍存在許多蛋白、多肽和其它各種雜質，將會減少樹脂的吸附容量或污染樹脂，造成樹脂的沉降和堵塞，進而縮短樹脂的壽命，增加 抗生素提煉的成本。

此外採用離子交換法提煉鏈黴素，總收率不高，只達72％。同時需大量解吸液。解吸液中鏈黴素濃度低，各種雜質如色素、金屬離子等含量較高，造成下游工藝處理困難 ，產品純度不高。

三達新工藝

膜法工藝取代鏈黴素生產中的薄膜蒸發工藝，使這一問題得到了很好的解決。膜分離是一種無相變的純物理手段，能在任何膜能承受的溫度下對料液進行分子水平的分離。清潔，環保，佔地少，另外它的一大優勢是運行成本低，去除一噸水的成本比普通的三效蒸發器低，有效地控制產品，提高了產品的質量。

Ultra－flo 超濾技術替代傳統的板框壓濾/鼓式真空過濾方法。其最大的特點是在不需要加入助濾劑、絮凝沉澱劑及其他任何化學試劑的情況下，不僅可把菌絲體及其他固體雜質完全分離，而且可以把99％以上的蛋白(包括溶解性的蛋白) 與菌絲體一起剔除。

Ultra－flo 超濾技術實質是把傳統工藝中剔除蛋白(絮凝沉澱)、菌絲分離（板框壓濾/鼓式真空過濾），去除乳化(破乳劑的使用)等多種傳統的提煉與純化工藝用Ultra－flo 超濾技術加以替代，既減少了設備的投資，及原輔材料(如助濾劑、絮凝劑、破乳劑等) 的消耗，還大大提高了鏈黴素預處理的收率，使得傳統意義上板框壓濾/鼓式真空過濾工藝中10～15％的鏈黴素損失下降到1％的水平。
Ultra－flo 超濾組件適於處理高粘度的流體並達到較高的濃縮倍數，使含菌絲/蛋白及其他大分子物質的濃縮液呈漿糊狀，其固體充填密度可達到95％以上。且幾乎不含任何鏈黴素組分，從而使鏈黴素預處理的收率達到99％的水平。而且濃縮液中的菌絲/蛋白由於未受助濾及絮凝劑的污染而可直接用作動物飼料，既增加了收入，又減少了污物處置的費用，因此，受到環保當局的特別推崇。
經Ultra－flo 超濾技術處理的發酵濾液，清轍透明，不含蛋白，可用專利性的Nano －flo 納濾技術進一步濃縮到所需的濃度。Nano－flo 納濾技術與傳統意義上的反滲透 技術亦有很大區別。它既可以使鏈黴素完全截流，又允許無機鹽透析，減少滲透壓，從而有利於濃縮過程的進行，並使鏈黴素濃度達到相當高的水平，進而減少了後續工藝中有機溶媒的用量，在節省成本、增加收率的同時，減少了產品在母液及其他廢液中的損失，有利環境保護。

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