pbs離子交換層析

『壹』 單克隆抗體的純化技術操作步驟

從培養液或腹腔積液獲得的單克隆抗體，不需要純化即可應用於日常診斷或定性研究。如果用於免疫標記測定，須分離和純化。可用半飽和、飽和硫酸銨進行沉澱，進行初步濃縮和純化；可用親和層析法進一步純化。

一、腹水型單抗的純化

在單抗純化之前，一般均需對腹水進行預處理，目的是為了進一步除去細胞及其殘渣、小顆粒物質、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者處理效果為佳，而且操作簡便。

1、二氧化硅吸附法

新鮮採集的腹水（或凍存的腹水），2000r/min 15分鍾，除去細胞成分（或凍存過程中形成的固體物質）等；取上層清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥緩沖鹽水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀釋；然後以每10ml稀釋腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鍾，不時搖動；2000g離心20分鍾，脂質等通過該法除去，即可得澄清的腹水。

2、過濾離心法

用微孔濾膜過濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用10000g 15分鍾高速離心（4℃）除去細胞殘渣及小顆粒物質。

3、混合法

即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附處理。

二、單抗的粗提

1、硫酸銨沉澱法

（1）飽和硫酸銨溶液的配製

500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過夜，析出的結晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/L NaOH調PH至7.8。

（2）鹽析

吸取10ml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5.0ml；繼續緩慢攪拌30分鍾；10000r/min離心15分鍾；棄去上清液，沉澱物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30分鍾，同法離心；重復前一步1-2次；沉澱物溶於1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl緩沖液中。

（3）脫鹽

常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過Sephadex G-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每分鍾1ml。第一個蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋於2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分鍾，用蒸餾水清洗透析袋內外表面，再用蒸餾水煮透析袋10分鍾，冷至室溫即可使用（並可於0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存備用）。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50-100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析（4℃）12-24小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑（碘化汞11.5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50ml，待溶解後，再加20% NaOH 50ml）檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。

（4）蛋白質含量的測定

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋倍數；或（Pr）=OD280×稀釋倍數/1.3

（5）分裝凍存備用

2、辛酸-硫酸銨沉澱法

該法簡單易行，適合於提純IgG1和IgG2b，但對IgG3和IgA的回收率及純化效果差。其主要步驟如下：取1份預處理過的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸緩沖液，用1mol/L HCl調PH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，於30分鍾內加完，4℃靜置2小時，取出15000g離心30分鍾，棄沉澱；上清經尼龍篩過濾（125um），加入1/10體積的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH調PH至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45%飽和度，作用30分鍾，靜置1小時；10000g離心30分鍾，棄上清；沉澱溶於適量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，對50-100倍體積的PBS透析，4℃過夜，其間換水3次以上；取出10000g離心30分鍾，除去不溶性沉渣，測定蛋白質含量後，分裝，凍存備用。

3、優球蛋白沉澱法

該法適用於IgG3和IgM型單抗的提取，所獲製品的抗體活性幾乎保持不變，對IgG3單抗的回收率高於90%，對IgM單抗的回收率為40-90%不等。其操作步驟如下：取一定量的預處理過的腹水，先後加入NaCl和CaCl2，使各自的濃度分別達0.2mol/L和25mmol/L，隨之可見纖維蛋白的產生；經濾紙過濾後，濾液對100倍體積的去離子水透析，4℃ 8-15小時（若是IgG3單抗，也可室溫2小時），其間換水1-2次；取出後22000g離心30分鍾，棄上清；將沉澱溶於PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重復上述的透析與離心；將沉澱的優球蛋白濃度調至5-10mg/ml，分裝凍存備用。

三、單抗純化的方法

單抗純化的方法有很多種，應根據具體單抗的特性和實驗條件選擇適宜的方法，常用的技術有DEAE離子交換層析柱、凝膠過濾法和親和層析法三種。

1、離子交換層析：

分離蛋白質是根據在一定pH 條件下，蛋白質所帶電荷不同而進行的分離方法。常用於蛋白質分離的離子交換劑有弱酸型的羧甲基纖維素(CM纖維素) 和弱鹼型的二乙基氨基乙基纖維素(DEAE纖維素)。前者為陽離子交換劑，後者為陰離子交換劑。

離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來

2、凝膠過濾法：

一定型號的凝膠網孔大小一定，只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內部，大分子則被排阻在外。洗脫時，大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小，小分子則在顆粒網狀結構中穿來穿去，歷程長，後洗脫下來，洗脫體積大。

缺點：從凝膠過濾的原理可知，蛋白質分子通過凝膠柱的速度(即洗脫體積的大小)並不直接取決於分子的質量，而是它的斯篤克半徑，利用凝膠過濾法測定蛋白質分子量時，標准蛋白質(已知分子量和斯篤克半徑)和待測蛋白質必須具有相同的分子形狀(接近球體)，否則不能得到比較准確的分子量。分子形狀為線形的或與凝膠能發生吸附作用的蛋白質，則不能用此方法測定分子量。而且柱子成本比較高，整個實驗過程耗時很長。

3、免疫親和層析法：

是利用生物體內存在的抗原、抗體之間高度特異性的親和力進行分離的方法。親和層析的應用主要是生物大分子的分離、純化。利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進行分離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結合於親和層析基質上，就可以從血清中分離其對應的抗體。在蛋白質工程菌發酵液中所需蛋白質的濃度通常較低。

用離子交換、凝膠過濾等方法都難於進行分離，而親和層析法則是一種非常有效的方法。將所需蛋白質作為抗原，經動物免疫後制備抗體，將抗體與適當基質偶聯形成親和吸附劑，就可以對發酵液中的所需蛋白質進行分離純化。

『貳』 酶的分離純化一般經過哪些步驟應注意哪些問題

酶是一種特殊的蛋白質，在分離純化過程中需要注意溫度以及PH值等的控制，注意在純化過程中所使用的緩沖溶液的離子強度的控制（常用PBS緩沖溶液），在實際純化過程中，一般要在低溫冰箱中進行，緩沖溶液中注意加入EDTA二鈉鹽（1-5mM）螯和重金屬離子一般避免酶失活。常用分離步驟包括分子篩層析、離子交換、疏水層析等步驟。

『叄』 有人知道金屬硫蛋白嗎

1957年Margoshes和Vallee在研究金屬生物學作用時，從動物器官分離出一種新的蛋白質，它含有豐富的巰基，能螯合大量的金屬離子，此物質稱為金屬硫蛋白（英文為Metallothionein，簡稱MT）。人體內、動物、植物以及微生物均含MT，而且其理化特性基本一致。MT分子呈橢圓形，分子量為6500道爾頓，直徑30-50A，分兩個結構域，每個分子含7-12個金屬原子，具有特殊的光吸收。MT構象較堅固，具有較強的耐熱性。

MT是科技界在動物體內發現的一種最重要、最奇異、生理功能最多的活性物質。它所具有的生物功能使科學家為之稱奇，由於MT分子中含有20個游離的巰基（-SH）基因以及由它們組成的多個巰基簇，從而使它生物體中同時具有六大功能：

一、清除體內自由基、防止基體衰老 ：MT是體內清除自由基能力最強的一種。清除羥自由基（.OH）的能力約為SOD和谷胱甘肽（GSH）的10,000倍，清除氧自由基（O）的能力約是GSH的25倍。

二、解除重金屬的毒性：MT的巰基基因（-SH）能強烈螯合有毒金屬汞、銀、鉛、鎘、砷、鉻、鎳等，其中螯合鉛的強度比鋅大200倍，而螯合鎘的強度又比鉛大10倍，並可將之排出體外，從而使它們無法毒害人體，同時對體內鋅等微量元素無影響。MT是目前臨床是最理想的生物解毒劑，其它無可代替。

三、參與體內微量元素的代謝：在體內，MT可根據體內微量元素的狀況對鋅、銅、錳、鐵、鉬、硒、鈷、碘的吸收、儲存、運輸和釋放等進行精細調節，使機體達到最佳生理狀態。

四、增強機體對各種不良狀態的適應能力：當機體處於各種不良狀態時（如遇各種炎症、燒傷、寒冷、飢餓、疲勞、輻射、金屬中毒等），體內MT含量增加，從而提高鋅、銅、錳、鐵、鉬、硒、鈷、碘等微量元素的濃度，以激活體內各種應激酶的活性，機體適應能力隨之增強。

五、鋅元素的貯存庫：每100毫克鋅金屬硫蛋白含6.9毫克鋅，肝、腎中的鋅元素主要是以金屬硫蛋白的形式貯存，根據機體對鋅元素的需求它便可迅速釋放鋅以滿足人體中200多種酶對鋅元素的需要，維持機體的正常代謝。

六、防止細胞癌變：MT可消除自由基、重金屬（砷、汞、鎘、鉻、鎳）、烷化劑、電離輻射以及紫外線對DNA、RNA、酶、蛋白質以及細胞膜的損傷，從而可以防止它們的致癌、致突變作用，以維持細胞的正常代謝和分裂；另外還可以激發機體的免疫功能，增強機體的防癌和抗癌能力。

自從MT被發現以來，它成為基礎科學研究的熱點之一。從1978年到1999年共舉行了四次國際專題研討會，我國將MT列入[863]重大攻關計劃，1995年列入國家級[火炬計劃]。同時各國科學家也在努力開發MT的新用途，大量的科學實驗和臨床結果表明：MT在抗電離輻射、紫外線照射、解除金屬毒素、治療消化道潰瘍、心肌梗塞、各種炎症、各種癌症、美容護膚、減輕吸煙及環境污染對人體的危害及抗過敏等方面均有顯著療效。

MT具有廣譜高效的保健效果和極高的醫療價值，其用途大致如下：

一、保健食品 用MT製成的口服液或膠囊具有清除人體的自由基的作用，根據人體的需要配製而成。不斷清除自由基是保持人體健康的最有效方法，從而增強人體的免疫功能、降低血脂、清潔血液達到延緩衰老的目的，提高生活質量。)

二、重金屬解毒素 有毒重金屬一般是指鉛、砷、汞等，一旦中毒是很難治癒的，MT可以與鉛、砷、汞等有毒金屬緊密結合，使它們無法毒害其它生物大分子，從而起到解除重金屬對人的毒性，這對保護大腦、肝、腎等人體重要器官具有極其重要意義。用MT製成的解毒劑主要用於重金屬中毒人員搶救治療，可用於礦工、冶煉工人和受重金屬污染地區人員的日常保健。

三、抗輻射劑 X-射線、紫外線及各種電離輻射對身體造成損傷的主要機理之一，就是產生大量自由基和具有高度的活性物質，這些產物可破壞生物大分子，如蛋白質、不飽和脂肪酸、DNA、酶及細胞膜，而使它們不能發揮正常的生理功能，久而久之，被輻射的人員出現早衰、壽命縮短、患皮炎、血液病、腫瘤、癌症。MT能有效消除各種自由基，所以它具有抗輻射能力，用MT製成的抗輻射劑適用於醫院X-光透放操作人員、同位素接觸人員、飛行員、空姐及放療病人。

四、護膚美容 MT不僅可以清除體內產生的自由基及調節人體代謝平衡，而且還可以有效抵抗各種有害氣體（如汽車尾氣、工業廢氣、煙霧等），它可以加速面容各種炎症（如青春痘）的康復，用MT製成的護膚美容品，其保健效果奇佳，各類人員均可使用。

五、腸胃潰瘍康復劑 將MT靜脈注射給大鼠動物實驗，結果證明MT能加強潰瘍屏蔽系統的形成，從而促進腸胃疾病的康復。

六、防癌抗腫瘤 在腫瘤預防和治療中，MT可保護細胞抵抗自由基、重金屬、烷化劑、輻射及紫外線致癌，所以MT具有廣泛的防止細胞癌變和抗腫瘤作用。

七、補鋅劑 嚴格地講，我們生產的MT應該稱為Zn-MT（即鋅金屬硫蛋白），是結合Zn的MT，所以有人把MT也稱為生物鋅，一個分子的MT能結合5-7個鋅原子。如5mg的MT中的含鋅量為5×1016個。鋅為人體必需的一種元素，俗稱「生命之光」。鋅的缺乏會引起多種機能障礙：如生長不良及生殖器官發育受損、兒童常見的多動症、傷口癒合不良、對味道的敏感減弱、性功能衰退等。實驗證明，口服鋅金屬硫蛋白半小時後，人體中鋅值明顯升高，一小時達到最高值，並能維持8小時以上。因此補充鋅能使生命充滿智慧、活力和激情。

由於MT的保健、醫療價值非凡，純生物製品是一種高附加值產品，提取技術難度大，國際報價達66.50美元/毫克，等於每公斤合人民幣5億元，可謂價值連城。可以預料，在21世紀中，MT這朵生物奇葩必將綻放更絢麗的光彩。