蛋白濃縮超濾管用pbs嗎

1. 牛血清白蛋白的提取和鑒定方法(設計性實驗報告)

牛血清白蛋白的提取操作步驟：

1、鹽析取離心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）稀釋血清，搖勻後，逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨溶液2mL，邊加邊搖，充分混勻，然後靜止放臵10分鍾，再離心（2000r/min）10min，將上清液傾入試管中。

2、取干凈的比色板，在各孔內滴加一滴納氏試劑 

3、取玻璃紙一張，折成袋形，將離心後的上清液倒入袋內，用線扎緊上口（注意要留有空隙），用玻璃棒懸在盛有半杯蒸餾水的100mL燒杯內，使透析袋下半部侵入水中，對蛋白液進行透析，常用玻璃棒攪拌袋外（燒杯中）液體，以縮短透析時間。

4、每隔2分鍾檢查一次，更換蒸餾水多次，用納氏試劑檢查袋外液體的NH4+，觀察顏色變化並記錄，直至袋內鹽分透析完畢。

5、將袋內液體傾入試管，即得牛血清白蛋白溶液。

牛血清白蛋白的鑒定方法：

1、點樣取一張膜條，將薄膜無光澤面向下，放入培養皿中的巴比妥緩沖液中使膜條充分浸透，取出，用干凈濾紙吸去多餘的緩沖液，以薄膜的無光澤面距一端1.5㎝處做點樣線，將牛血清樣品與待測的牛血清白蛋白溶液分別用點樣器在同一張薄膜的點樣線處不同位置點樣。標准液點一次，待測液點三次。

2、電泳將點樣後的膜條致於電泳槽架上，放置時膜條無光澤面向下，點樣端致於陰極，待平衡5min後，打開電源，調節電源，調節電泳儀的電壓為160伏，通電60min，關閉電源後用鑷子將模條取出。

3、 染色將膜條直接浸於盛有氨基黑10B的染色液中，染2分鍾後取出，立即浸於漂洗液中，分別在漂洗液1、2、3中各漂洗5min，直至背景漂洗干凈為止，用濾紙吸干薄膜。

4、鑒定比較樣品和待測液中白蛋白在薄膜上的電泳結果，看位置是否一致。

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牛血清白蛋白

牛血清中的簡單蛋白，是血液的主要成分（38g/1000ml），分子量68kD。等電點4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。僅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581個氨基酸殘基組成，其中35個半胱氨酸組成17個二硫鍵，在肽鏈的第34位有一自由巰基。白蛋白可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質結合。

血液中的白蛋白主要起維持滲透壓作用、PH緩沖作用、載體作用和營養作用。在動物細胞無血清培養中，添加白蛋白可起到生理和機械保護作用和載體作用。牛血清白蛋白（BSA），又稱第五組分，是牛血清中的一種球蛋白，包含583個氨基酸殘基，分子量為66.430 Da，等電點為4.7。牛血清白蛋白在生化實驗中有廣泛的應用，例如在western blot中作為Blocking agent。

2. 外泌體相關研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（十九）

分享一篇發表在J Extracell Vesicles（2020年IF=25.83）上的文章，標題為《Active cargo loading into extracellular vesicles: Highlights the heterogeneous encapsulation behaviour》。細胞外囊泡(EVs)是生物納米顆粒，來源於大多數細胞類型，用於調節細胞間通信。它們作為天然分泌的納米囊泡，在葯物傳遞領域展現出巨大潛力，因其固有的生物相容性、合適的尺寸和固有的細胞靶向能力。

盡管EV治療具有獨特優勢，但封裝大量治療分子以穩定使用作為輸送載體仍是一個挑戰。研究主要分為兩類載葯方法：預裝載和後裝載。預裝載涉及將小分子葯物與親本細胞共孵育或轉染葯物編碼DNA到親本細胞，然後分離自然攜帶治療分子的EV。然而，這種方法僅限於培養細胞來源的EV，難以應用於血漿或食物來源的EV。後裝載方法則在被動或主動刺激下，如孵育、超聲、凍融和電穿孔，將葯物載入純化的EV。盡管如此，所有方法都遇到了裝載能力較差的問題，特別是對於親水分子的封裝。

為了提高裝載效率並促進治療葯物封裝，研究提出了一種高效載葯方法，名為「超聲和擠壓輔助主動負載」(SEAL)。該方法通過在硫酸銨中重懸並超聲mEVs，暫時滲透膜以建立主動載入所需的跨膜銨梯度。擠壓操作縮小mEVs，使顆粒尺寸均一，從而重塑不利於載葯和遞送的非球形或多層囊泡。然後用PBS透析散裝溶液，並用阿黴素孵育進行活性負荷。

通過TritonX-100裂解mEVs樣品，檢測熒光信號以確定SEAL的效率。與被動孵育相比，由於葯物封裝更有效，熒光強度增加了10.5倍。顯著的熒光猝滅進一步證實了更多葯物在SEAL制備的mEVs腔內累積。在脂質體模型中也獲得了一致的結果。Western blot檢測顯示超聲和擠壓處理沒有顯著影響mEVs的蛋白含量。

為了優化SEAL的技術參數以改善載葯量，研究發現2-4分鍾的超聲處理和0.5-1M硫酸銨溶液條件效率最佳。延長超聲處理時間或使用更濃縮的溶液都不能在不影響結構完整性的情況下提高封裝效率。擠壓操作結果顯示，超聲處理後的3個擠壓循環足以減小mEVs的尺寸，提高封裝效率。通過多參數分析，揭示了mEVs的封裝異質性與成分方差之間的相關性，進一步指導了純化過程中去除不需要的組分，提高純度。

為了徹底揭示異質性，研究應用nFCM系統對SEAL制備的Dox-mEVs進行單顆粒分析。這提供了更定量的方法來表徵載葯能力，包括活性載率和活性載入效率。研究發現未/低負載顆粒的共存是顯著的，因此採用超濾(UF)、尺寸排除色譜(SEC)和胰蛋白酶處理三種EV純化方法進行了研究，發現SEC和胰蛋白酶處理能夠增加活性負載率，而UF純化導致樣品損失。

研究還分析了封裝異質性與脂質包涵體的相關性，證明只有具有脂質包涵體的顆粒是可主動載入的。脂質探針介導的磁分離技術(LPMIT)用於選擇性去除非脂質封閉顆粒，提高Dox-mEVs樣品的純度。純化的Dox-mEVs樣品的活性負載率進一步提高到63.2%。

牛乳中含有大量酪蛋白，使mEVs的純化和應用更加復雜。因此，研究引入了免疫磁性分離技術(IMIT)以去除所觀察到的酪蛋白成分，並進一步提高活性負載率到83.6%。

研究最後進行了細胞毒性分析和細胞內化行為分析，證明由SEAL制備的裝載mEVs的治療潛力以及樣品純度對整體治療性能的影響。細胞毒性分析顯示空白mEVs的細胞毒性可以忽略不計，而Dox-mEVs表現出強大的細胞毒性反應。細胞內化行為分析則表明轉鐵蛋白偶聯後Dox-mEVs增強了細胞毒性，進一步證實了配體促進的內化。

文章的目的是分享在提高EV葯物封裝效率和改善治療性能方面的最新研究成果。通過引入高效載葯方法和優化純化過程，研究揭示了葯物封裝異質性對治療結果的潛在影響，並證明了SEAL制備的mEVs制劑具有優越的治療性能。有興趣的讀者可以自行查找原文進行更深入的了解和研究。

3. 抗體透析時夾透析袋的夾子開了，抗體進入了5mM PBS透析液中怎麼辦如何從透析液中提取抗體呢

這個基本沒有辦來法。
你透析源液多在體積？如果體積小一點的話。你先把透析液分裝一下。－20凍起來.留下一小部分用於你的實驗看一看。如果行的話就這樣用。如果濃度太低，那就沒辦法。
當然，你也可以試著用A蛋白純化柱或者G蛋白純化柱試著回收，但一個這種柱子太貴，另一個，能否回收得到還是個問題。

4. 純化的單克隆抗體，超濾濃縮的時候會把磷酸鹽離心掉導致抗體的緩沖環境變成水嗎

不會的。。。
超濾濃縮對於緩沖液成分不會有任何改變的，因為PBS中的磷酸根離子回也好答，氯離子也好，鈉離子也好都是很小的離子，可以在溶液中自由擴散，不會因為超濾離心就被甩到下層濾液中去。
你可以做個簡單的實驗，取一定體積PBS溶液測一下pH值和電導率值，之後用超濾管去離心。取出上層未被濾完的溶液再測一下pH值和電導率值，會發現pH值和電導率值和之前測的是一樣的。即可證明未被濾完的溶液還是PBS溶液，而不是水。

5. 蛋白質提取分離純化鑒定的實驗方案

一.血清ǐ-球蛋白的初步提取
1. 血細胞與血清分離：
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm離心20min .棄沉澱,留上清備用(沉澱為血細胞，上部為血清).
2. 乳糜粒分離：4000rpm 10°C離心10分鍾,採用密度梯度離心
梯度液配置：離心管下部3/4容積加血漿，上部1/4容積加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮，將乳糜粒吸出,留其餘液體備用。
3. 血清蛋白分離：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白質。
5000rpm 10°C離心1h,密度梯度離心
梯度.液配置：管容量1/3為血清，2/3為1。31g/ml,NaCl+NaBr,攪拌後終密度為1。21g/ml .管上部1/6容積為血清脂蛋白，下部5/6為其它蛋白。
4.取2ml下部5/6血清於小試管中,加0.9％氯化鈉溶液2.0ml，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙4.0ml，加入PBS洗脫液2ml,混勻後於室溫中放置10min，此步驟可重復1～2次
3000rpm 離心5min.沉澱物即是ǐ-球蛋白.
二.凝膠層析提純血清ǐ-球蛋白(1)裝柱：海綿墊裝入玻璃柱底端,作為柱底支持物,裝入定量的蒸餾水(約為柱體積的1/5),以避免膠粒直接沖擊柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.將密實洗凈的層析柱保持垂直位置，關閉出口，柱內留下約2.0ml洗脫液。邊攪拌凝膠,邊向柱內緩慢,連續,均勻地加入凝膠,(打開柱底端的螺旋夾)不要中斷,使膠粒均勻沉降,以免膠面一次性將疑膠從塑料介面加入層析柱內，打開柱底部出口，調節流速0.3ml/min。凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部傾斜和發生斷層;檢查裝好的凝膠柱用眼觀察有無凝膠分層.溝流和氣泡現象.最後使凝膠床達20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面並防止層析床內出現「紋路」。用緩沖液平衡凝膠柱,流速控制在3-5s/滴.(2)上樣與洗脫：小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關緊下端出口，用長滴管吸取鹽析法制備的球蛋白混合樣品，將裝有上樣液的滴管頭插入床面以上1-2cm處,小心緩慢地貼壁加到凝膠床表面。柱上樣量控制在柱體積的2%-5%.打開下端出口，將流速控制在0.25ml/min使樣品進入凝膠床內。關閉出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁。打開下端出口，待緩沖液進入凝膠床後再加少量緩沖液。如此重復三次，以洗凈內壁上的樣品溶液。然後可加入適量緩沖液開始洗脫。加樣開始應立即收集洗脫液。洗脫時接通蠕動泵，流速為0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。(3)洗脫液中NH4+與蛋白質的檢查：取比色板兩個(其中一個為黑色背底)，按洗脫液的順序每管取一滴，分別滴入比色板中，前者加雙縮脲2滴，出現藍色混濁即示有蛋白質析出，由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度；於另一比色板中，加人奈氏試劑l滴，以觀察NH4+出現的情況。 合並球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其餘用DEAE纖維素陰離子交換柱進一步純化。三．純化――DEAE纖維素陰離子交換層析用DEAE纖維素裝柱約8-10cm高度，並用0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然後將脫鹽後的球蛋白溶液緩慢加於DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20％磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況。(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質檢查等操作步驟同凝膠層析)。四．濃縮經DEAE纖維素陰離於交換柱純化的γ－球蛋白液往往濃度較低。為便於鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干膠，搖動2～3min， 3000r／min 離心5min。上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液。五. 乙酸纖維素薄膜電泳鑒定ǐ-球蛋白(一)儀器與薄膜的准備1.醋酸纖維素薄膜的潤洗與選擇用竹夾子取一片薄膜，小心地平放在盛有緩沖液的平皿中，若漂浮於液面的薄膜在15—30s內迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用於電泳；若薄膜潤濕緩慢，色澤深淺不一或有條紋及斑點等，則表示薄膜厚薄不均勻應棄去，以免影響電泳結果。將選好的薄膜用竹子輕壓，使其完全浸泡於緩沖液中約30min後，方可用於電泳。
2.電泳槽的准備根據電泳槽膜支架的寬度，剪裁尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒入等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩個膜支架上，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電極緩沖液內。當濾紙條全部潤濕後，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯系醋酸纖維素薄膜的橋梁，因而稱為濾紙橋。
3.電極槽的平衡用平衡裝置(或自製平衡管)連接兩個電泳槽，使兩個電極槽內的緩沖液彼此處於同一水平狀態，一般需平衡15——20min。注意，取出平衡裝置時應將活塞關緊。
(二)點樣
1.制備點樣模板取一張干凈濾紙(10×10cm)，在距紙邊1.5cm處用鉛筆劃一平行線，此線為點樣標志區。
2.點樣用竹夾子取出浸透的薄膜，夾在兩層濾紙間以吸去多餘的緩沖液。無光澤面向上平放在點樣模板上，使其底邊與模板底邊對齊。點樣區距陰極端1.5cm處。點樣時，先用玻璃棒或血色素吸管取2—3�0�8L血清，均勻塗在加樣器上，再將點樣器輕輕印在點樣區內，使血清完全滲透至薄膜內，形成一定寬度、粗細均勻的直線。此步是實驗的關鍵，點樣前應在濾紙上反復練習，掌握點樣技術後再正式點樣。
(三).電泳用竹夾子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上(點樣面朝下)，另一端平貼在陽極端支架上，要求薄膜緊貼濾紙橋並綳直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時安放幾張薄膜，則薄膜之間應相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。用導線將電泳槽的正、負極與電泳儀的正、負極分別連接，注意不要接錯。在室溫下電泳，打開電源開關，用電泳儀上細調節旋扭調到每厘米膜寬電流強度為0.3mA(8片薄膜則為4.8mA)。通電10—15min後，將電流調節到每厘米膜寬電流強度為0.5mA(8片共8 mA)，電泳時間約50—80min。電泳後調節旋扭使電流為零，關閉電泳儀切斷電源。
(四).染色與漂洗
1.血清蛋白染色與漂洗脫色用解剖鑷子取出電泳後的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培養皿中，浸染5min，取出後再用漂洗液浸洗脫色，每隔10min 換漂洗液一次，連續數次，直至背景藍色脫盡。取出薄膜放在濾紙上，用吹風機的冷風將薄膜吹乾。
(五)透明將脫色吹乾後的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出後立即緊貼於干凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡，約2—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少許在薄膜表面淋洗一次，垂直放置待其自然乾燥，或用吹風機冷風吹乾且無酸味。再將玻璃板放在流動的自來水下沖洗，當薄膜完全潤濕後用單面刀片撬開薄膜的一角，用手輕輕將透明的薄膜取下，用濾紙吸干所有的水分，最後將薄膜置液體石蠟中浸泡3min，再用濾紙吸干液體石蠟，壓平。此薄膜透明，區帶著色清晰，可用於光吸收計掃描。長期保存不褪色。
(六)結果判斷與定量血清蛋白電泳經蛋白染色後，可顯示出區帶，未經透明處理的電泳圖譜可直接用於定量測定。可採用洗脫法或光吸收掃描法，測定各蛋白組分相對百分含

6. Western Blot實驗技術全攻略之二（蛋白樣品制備操作）

懸浮細胞的蛋白樣品制備：直接離心收集細胞，用 PBS 等洗滌去除血清和雜質，隨後裂解。操作簡便，只需注意充分裂解，如有必要，可使用冰浴超聲以確保裂解充分。裂解後，離心取上清進行後續蛋白濃度測定和上樣前的預處理。

貼壁細胞的蛋白樣品制備：吸凈培養液，加入裂解液裂解。若條件允許，推薦直接裂解，以便細胞充分接觸裂解液，提高裂解效率。在裂解不充分時，可考慮使用冰浴超聲輔助。同樣，裂解後離心取上清，進行後續步驟。

組織蛋白樣品制備：首先，清洗去除血液和脂肪等非目標組織，使用 PBS 或生理鹽水洗滌。對於富含血液的組織如脾臟、心臟和胎盤，需特別注意清洗血液以避免干擾。獲取組織後，使用勻漿法或研磨法進行破碎，以確保充分裂解。裂解後離心取上清，進行後續處理。

操作過程中的注意事項：

• 防止降解：使用蛋白酶抑制劑、低溫操作、控制樣品處理量等方法減少蛋白降解風險。




• 避免雜質干擾：使用清潔器具，減少器材污染；處理核酸和脂類，使用超聲處理或特定方法減少干擾。

蛋白濃度測定：使用 BCA 法或 Bradford 法測定樣品濃度，確保上樣量穩定可控。通過電泳、考馬斯亮藍法染膠或麗春紅染色等方法，檢查上樣量、蛋白裂解情況及是否存在降解。

調整上樣量：根據實驗需求，將高濃度樣品稀釋或使用超濾法濃縮樣品，確保每個泳道的上樣量一致，提高實驗結果的可靠性。