Ⅰ 離子交換層析中，為什麼用氯離子洗脫陰離子為什麼改變氯離子濃度就可以分離出帶電荷不同的陰離子
陰離子交來換柱的填料自是正電填料，在低鹽條件下可以通過電荷相互作用吸附樣品中的陰離子和負電荷物質（如DNA）。這些帶負電的物質由於其帶電量不同，分子大小不同，因而與正電填料之間的結合力也就不同。用梯度的氯離子（一般用氯化鈉梯度，例如從100mM氯化鈉線性梯度升高到1M氯化鈉）洗脫掛柱樣品時，氯離子會和結合上的物質競爭結合正電填料，伴隨著氯離子濃度的不斷升高，氯離子的競爭作用越來越強，與填料結合的物質會按照親和力從弱到強依次洗脫下來，形成獨立的洗脫峰，從而將這些物質分開。
陽離子交換柱與之正好相反，柱子填料為負電荷，用鈉離子洗脫結合的正電物質。
Ⅱ DEAE纖維素陰離子交換柱，看到很多地方講到流穿模式，什麼叫做流穿模式呢
流穿模式指的是樣品沒掛柱，都留下來了。
Ⅲ 用離子交換法純化蛋白如何選定緩沖液
也可以用AEC，主要以流穿模式做。sspxiaoji(站內聯系TA)用陽離子交換柱，可以考慮pH6.0-7.0的緩沖液，因內為容大部分蛋白質的等電點在這附近，帶電荷少，這樣容易穿透除去其他雜蛋白。而你的目的蛋白PI在11，掛柱應該比較牢固。但是有個問題需要注意，PH離你的目標蛋白PI太遠，有可能導致掛柱後難以洗脫。
Ⅳ 原核表達常見問題（三）蛋白純化後續的問題分析
1.目的蛋白純化濃縮之後，目的蛋白條帶周圍出現雜帶，據推測可能是插入目的基因後，外源基因的表達刺激大腸桿菌產生了宿主蛋白酶，對異源蛋白進行降解的產物。
樣品緩沖液有相同的 pH 和離子強度。
離子交換純化是利用離子交換劑上的可解離基團(活性基團)對各種離子的親和力不一樣達到分離目的的一種蛋白純化分離技術,離子強度越大，洗脫越好。具體的離子濃度范圍可以很大，0.01mol/l 到 1mol/l，甚至 3.0mol/l，PH值的范圍液很廣。主要根據你的蛋白質的等電點。
1. 蛋白與離子柱得結合太強，換弱陽的瓊脂糖凝膠介質，比如由 sp 的換成 CM
2. 減少離子柱與樣品的結合時間，防止蛋白沉在柱上。
3. 若洗不下來的是雜蛋白直接用 0.1M 氫氧化鈉洗。
1. 離子交換每個梯度都洗下來目標蛋白，最大可能性是上樣量過大，流速太大，建議增加清洗的體積數，減
少上樣量，降低上樣速度。
2. 上樣完洗脫前，清洗的不徹底。
3. 標簽沒有表達出來：1. 可能是因為折疊構象不正確導致標簽在重摺疊時沒有位於蛋白質分子的表面上無法與離子柱結合。2. 標簽在折疊時沒有位於蛋白質分子的表面上。
4. 填料有問題，換填料。
5. PH、離子強度是否合適，平衡緩沖液是否應與樣品緩沖液 pH、離子強度相同。
1. 蛋白質的折疊形態發生了改變隱藏了標簽，而使得蛋白質無法掛柱 。
1. 因臨近的空間的一個或多個氨基酸的空間位阻阻礙了標簽與離子柱形成共價鍵。
2. 環境影響：pH，離子強度，其他蛋白質分子，緩沖溶液類型，有關影響蛋白質分子表面的試劑等。增加所提的蛋白質樣品的溶解度或還可以加大離子型、非離子型或兩性離子表面活性劑的濃度或類型。
2. 柱子沒平衡好，平衡緩沖液沒加咪唑，平衡液 PH 不適合，緩沖液 pH 要與蛋白質 pI +/-1-2。
3. 有比鄰的組氨酸的污染蛋白質與離子柱結合，通過降低洗脫液 pH 值使得標簽質子化而使得污染蛋白質從
層析住上被洗脫。
4. 一些蛋白質或 DNA 與帶有標簽的目的蛋白發生了非特異性相互作用， 可以用低濃度的去污劑 （2%的 Triton
X-100 或濃度不大於 0.5%SDS)洗滌樣品 （上樣洗脫時） 或增加洗脫液的鹽濃度 （氯化鈉溶液低於 2mol/L） 。
5. 填料有問題，換填料。
6. 最後可以考慮一下試劑的問題。
1. 更換緩沖液，可能 pH 與蛋白質 pI 較接近。
2. 填料選擇不對，與蛋白結合力太弱，更換適合改純化蛋白質的填料。
3. 直接收取目的蛋白，再用其他純化方法進一步純化。
1. pH 發生變化，導致蛋白質沉澱。找准蛋白質的一個等電點，溶液環境的ph值不能在蛋白質等電點的附近，如果在等電點的附近的時候，這個時候蛋白非常容易沉澱。可根據軟體計算入VECTOR NTI計算其理論等電點，盡量純化的溶劑在遠離等電點。
2. 離子溶度過高，緩沖液的離子溶度降低。人為配製的溶液環境，不一定真正符合蛋白本身的「生存」的環境要求，所以要從離子濃度和pH去考慮，特別是鹽離子濃度；所謂的鹽濃度，就是鹽析效應。高濃度的鹽破壞蛋白的水化層，使得蛋白質聚集沉澱。常用的就是硫酸銨沉澱。鹽析沉澱通常對蛋白質的高級結構沒有破壞，再溶時活性可以完全恢復。常見的例子就是硫酸銨沉澱純化IgG。同樣，硫酸銨沉澱也常碰到不可逆的情況。例如大腸桿菌(Escherichia coli)表達的重組蛋白往往在硫酸銨沉澱後再溶困難。
3.在Ni純化的過程中，有一部分鎳離子會脫落，脫落的鎳離子屬於重金屬，會對蛋白的凝集和沉積起到一定的作用。
4.蛋白反復凍溶，過程中生成的一些小冰晶會對這個蛋白的結構造成一定的傷害，離子和緩沖液狀態發生較大變化；
5.如果長時間放在4度的情況之下蛋白質，容易滋生微生物，微生物的生長的可能造成蛋白的性質變化或者降解也容易產生一些聚集沉澱；
9.若發生不可逆沉澱，可以選擇離心，過濾等方式去除。
1. 倒入速度不要太快，以防產生泡沫和氣泡。
2. 裝柱的注意事項:
1. 裝柱時應注意液面不能低於樹脂表面。
2. 樹脂懸浮液的溫度要相對恆定或與室溫接近，否則柱床體內易產生氣泡而影響分離效果。
3. 裝好的柱體應該沒有「紋路」、節痕和氣泡，並且柱床體表面平整而均勻。否則需要重新裝柱。
4. 在裝柱的同時應該將其他儀器設備（如：恆流泵等）電源接通，並按實驗要求進行預熱和調試。需
將恆流泵流速調至 0.4ml/min。
3. 應將洗脫液放至液面與樹脂相切時再上樣，且樣品一旦加入就應該立即開始收集流出液。 （第一管，應在
4ml 處做一標記）。
4. 加樣時要沿柱內壁緩慢地加入柱中，以免沖壞樹脂表面，以及在柱內形成氣泡，影響分離效果。
Ⅳ His標簽蛋白純化那些事兒，你知道嗎
His標簽蛋白純化是一門技術活，需要細致的步驟和方法。是否熟悉His標簽純化的基本知識，決定著蛋白純化的效果。以下是一些常見的His標簽純化問題和解決策略，希望能幫助你提升純化效率。
在進行His標簽純化時，推薦的緩沖液條件是：Binding buffer為20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 20–40 mM imidazole, pH 7.4；而Elution buffer則為20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4。His標簽在中性或鹼性條件下與Ni2+結合力更強，所以推薦使用磷酸緩沖液。
鎳柱的蛋白結合載量為至少40mg (His) 6重組蛋白，可以根據填料的結合載量選擇預裝柱和填料的規格。如果目標蛋白中的咪唑需要去除，可以選擇適合的上機脫鹽柱或手動脫鹽柱。
HisTrap柱子應儲存在20%乙醇中，於4℃-30℃條件下，以確保其長期穩定。使用柱子後，正常用緩沖液沖洗即可再次使用。如果柱子出現堵塞、變色等問題，需進行脫鎳和掛鎳操作，推薦使用20 mM sodium phosphate， 0.5 M NaCl， 50 mM EDTA， pH 7.4的stripping buffer清洗柱子，然後用binding buffer和蒸餾水清洗。
如果裂解液粘性過高，可以使用連續超聲或加入5 μg/ml的DNase I、1 mM的Mg離子在冰上孵育來降低粘性。如果目的蛋白不掛柱，可能是His標簽沒有充分暴露或丟失，可通過加入尿素或鹽酸胍等變性劑檢查，或者調整His標簽的位置。緩沖液條件不合適、洗脫時間過短、樣品量過大等情況也可能導致此問題。在純化過程中，若蛋白掛柱後洗脫不下來，可能是洗脫條件太溫和或蛋白在柱子中沉澱，此時可調整咪唑濃度或pH值，使用添加劑或改變NaCl濃度，或嘗試在變性條件下洗脫。對於洗脫不純的蛋白，需要檢查是否被蛋白酶降解，是否存在高度親和鎳離子的污染物，或有相互作用的污染物，這時可以通過增加添加劑濃度或使用離子交換層析、分子篩進一步純化。
優化金屬離子和宿主蛋白中His標簽的結合能力，可以提高蛋白純度。若遇到純度問題，嘗試更換成結合能力較弱的Co2+，以減少宿主蛋白的雜質。
以上是一些His標簽純化過程中的常見問題及解決策略，希望能幫助你提升蛋白純化的成功率。如果你有任何疑問或需要進一步的幫助，歡迎咨詢優寧維代理的Ni Sepharose FF 填料。
Ⅵ 怎樣利用離子交換柱層析法分離不同的蛋白質
離子交換內的介質一般是樹脂，陽離子交換型的，使用前樹脂先用鹼處理成鈉型，將氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3時，氨基酸主要以陽離子形式存在，與樹脂上的鈉離子發生交換而被「掛」在樹脂上，再用洗脫劑洗脫。不同的氨基酸（帶的電荷不同）與樹脂的親和力不同，要將其分離洗脫下來，需要降低它們之間的親和力，方法是逐步提高洗脫劑的pH和鹽濃度，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來。