柱上離子交換色譜法

A. 離子交換纖維素色譜法基本理論

離子交換纖維素色譜法是一種基於離子交換劑的層析技術。離子交換劑，如樹脂、纖維素、葡聚糖和醇脂糖等，其分子結構中含有可解離的基團，這些基團能在水溶液中與溶液中的其他陽離子或陰離子進行交換。盡管這種交換是平衡的，但在層析柱操作中，通過連續添加新的交換溶液，平衡偏向正向，直至所有離子被完全洗脫。同樣，當溶液通過交換柱時，離子被逐漸替換，直至吸附在樹脂上。

在混合物中，如果存在多種成分吸附在離子交換劑上，其洗脫能力取決於它們與離子交換劑的反應平衡常數。蛋白質的離子交換過程包括吸附和解吸附階段。通過調整pH值或增加離子強度，可以改變蛋白質的電荷狀態，使其與離子交換劑分離。不同蛋白質與離子交換劑的親和力不同，這使得通過選擇合適的洗脫條件，可以逐個分離純化混合物中的組分。

離子交換纖維素色譜法的優勢主要體現在以下幾個方面：首先，其開放性支持骨架允許大分子自由進入並快速擴散，因此吸附容量大。其次，由於其親水性，對大分子的吸附相對較弱，溫和的條件就能使吸附物洗脫，避免蛋白質變性或酶失活。最後，離子交換劑具有多孔性，表面積大，交換容量高，這提高了回收率，使其在分離和制備過程中表現出色。

Sober和Peterson於1956年首次將離子交換基團結合到纖維素上，製成了離子交換纖維素，成功地應用於蛋白質的分離。從此使生物大分子的分級分離方法取得了迅速的發展。離子交換基團不但可結合到纖維上，還可結合到交聯葡聚糖（S-ephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）上。近年來離子交換色譜技術已經廣泛應用於蛋白質、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體和多糖的分離和純化。

B. 以離子交換色譜法為例，簡述濕法裝柱的操作過程和注意事項

1.樣品處理：對被分離樣品有時要經過水解等化學處理，樣品溶液一般要兼顧到濃度與粘度兩方面。
+ B4 ^: J i3 _) \- T: R/ |" v2.離子交換柱的安裝：層析柱內徑必須粗細均勻，柱管大小可據實際需要選擇。柱下端膠塞中插入一放液管，膠塞上蓋以園形尼龍綢或發泡塑料片以防止交換樹脂流出。
+ H/ ?0 X, d' E2 P8 h& S- U3.裝柱：⑴裝柱質量是確保柱層析分離效果的技術關鍵之一，越是高技術層析(如使用毛細管層析柱的高級層析設備)裝柱的技術要求和難度越高，以至手工操作很難達到。⑵裝柱的質量要求，無論是手工、機械、自動化裝柱都是一樣的，要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無氣泡、無斷層、無結節，能保持正常的溶脹形態和結構；⑶裝入柱中樹脂的高度與直徑之比因分離對象和分離目的不同而相差很大，本教材推薦的肝素鈉洗脫柱裝柱高度是柱徑的4～6倍。⑷操作次序，以手工裝入溶脹的D254樹脂（濕法裝柱）為例，其操作程序可概括為：①查連接(柱與塞之間、上下塞與進出液管之間、梯度混合器與進液管之間、出液管與收集器之間等等的連接是否正確、緊密)，②試止漏（塞子、接頭、活塞開關處在長時間滿負荷下不泄漏），③加隔離緩沖墊（緊貼於柱子下端塞子的內平面），④加少許平衡液於空柱內，⑤趕氣泡（緩沖墊內和出水管中的氣泡），⑥開通放水開關，⑦與放水量保持相當的流速，向柱內勻速加完載體材料漿，⑧關閉放水開關，令樹脂自然下沉，⑨用洗滌液和清水洗滌樹脂，⑩最後用緩沖液過柱和平衡柱，使樹脂結構平衡穩定，⑾在樹脂表面蓋上一片尼龍或泡膜塑料，並與柱子內壁保持嚴密接觸，以防加樣時樹脂泛起。
( ?6 Y, g6 D5 S2 e- z% v b* m4.加樣：緩緩打開柱子下端的放液開關,使柱內液面剛好降至樹脂面時便立即將樣品溶液小心地加到尼龍或泡膜塑料片上，待樣品液面剛好進入樹脂層內便立即加入少許平衡緩沖液,以清洗粘附在覆蓋層中的樣品，並隨之進入樹脂層。當柱內液位接近樹脂表面時便立即添加洗滌液進行洗滌操作。$ o+ c9 M: n3 `% Q
5.洗滌：選用合適的洗滌液、恰當的總用量及洗滌流速，小心洗滌柱內樹脂，以除去不被離交樹脂吸附的雜質。: K0 s* j/ p; W4 d) o7 W6 _
6.洗脫：由洗脫曲線找出洗脫液的最佳濃度和適當的總量、操作壓及流速進行洗脫。
5 m- U F# X! m' M. O# g! |7.監測：用敏感快速的方法（參見下文「測定」）監測分離成分是否洗脫出來以及洗脫峰的軸向分布
9 v2 C$ h- _- \: S8.收集：一旦發現待分離成分洗脫出來便可進行一步或分步收集，並可根據各成分洗脫峰的軸向分布和濃度監測，決定產品收集濃度區段，棄去的洗脫液可循環用於相同成分的洗脫。
1 v7 I2 v8 H, m8 y3 ] M; J8 m9.沉澱/離心：用沉澱劑可將分離組分沉澱或離心下來脫水乾燥，沉澱劑回收再用。
" a3 @7 z0 a' t10.脫水乾燥：加入適當脫水劑為如無水乙醇、丙酮或乙醚脫水後進一步乾燥。5 _" H" J" X0 e% v" V
11.測定：對層析所得產品可稱重或測定活性計算其得量和收率。. ^7 ]4 x, e- `1 p# y- z. d7 g9 m5 `
【注意事項】4 G; U! }* `$ X7 C" b: b0 f
1.應根據被分離物質的理化性質、分子大小、分子形狀和分離的目的要求，選擇分離效果好、交換容量大而機械強度較高的分離載體材料。市售的分離載體有明確的規格型號、理化性質、功能作用、活化再生和保養存放等技術參數資料可供用戶選擇。
* K7 Q, U. T% x8 y5 R2.應根據分離純化的對象、規模選擇層析柱的長短、粗細、柱高與內徑之比，使達到最佳分離效果；此外，柱子材料的化學性質要穩定、透明，內徑要均一、光滑，死腔要愈小愈好，要有利於緊固、連接、裝柱與維護。
4 E& F! k7 Q. W3 [& s/ k( ?- P3.柱子安放要垂直、穩固，與之相連的各種線路、管道、設備、設施的布局和連接要緊奏，要方便操作、觀察與維護。4 F5 w( v8 w+ c4 C
4.要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無氣泡、無斷層、無結節，能保持正常的溶脹形態和結構。5 F n1 O% }8 d z+ T0 L# t2 |3 C
5.保持柱內樹脂層面平整、層序結構始終如一是確保柱層析分離效果的又一技術關鍵。為此，從裝柱到洗脫結束的過程中，尤其是加樣、洗滌、洗脫過程中要始終保持柱內液位不低於柱內樹脂的頂部平面，尤其要始終保持柱內樹脂的層序結構始終如一，不被打亂，特別要防止更換濃度不同的洗滌洗脫液時發生「翻缸」而攪亂樹脂層結構，「壓缸」而造成柱層斷裂和梗塞斷流。
7 z/ W" C+ E8 q: i& t g6.注意保持一定的操作壓，這對確保層析柱流速和分離效果十分重要。因為流速不僅與洗脫液加在柱上的壓力（因液面差造成）有關，也與裝柱材料的粒度、交聯度、機械強度有關。應針對具體情況建立一個操作壓、流速和分離效果的最佳平衡點。
; N( j K7 n0 T" {9 [$ S6.顯著標明各種洗滌、洗脫液的技術參數，嚴禁亂用和混用。) M) k" o* {2 g( F
7.製作洗脫曲線，確定洗脫液收集方案，設置洗脫監控點。2 N; I* F% \6 e9 I5 J% X1 V
8.注意剔除破損樹脂，及時補足流失、破損的循環樹脂量。
# S5 F F8 K3 V2 ]9 A1 E6 U+ o9.嚴格掌握新、舊樹脂的活化、再生條件，及時再生舊樹脂。$ h4 U9 m: L5 L7 g
樹脂的再生：每次洗脫結束，用清水將樹脂洗出柱體再用、再生，或用高濃度的NaCl溶液浸泡貯存。樹脂經過一段使用後樹脂上的活性基團因被交換而使交換容量大為降低，此時樹脂需要再生處理。( z# |! T+ @) z" O
大處理（酸—鹼—酸）：加入樹脂2倍量的2mol HCL溶液攪拌3小時，自來水沖洗至中性；又用2mol NaOH溶液照酸處理方式處理；再用2mol HCL處理。
5 F% O1 U$ W2 r小處理（鹼—酸）：濃度、方法同上。) o4 @' Y" x8 ]8 s2 {8 P6 i
連續用數次的樹脂進行小處理，用十次後的樹脂要進行大處理。
4 {, T2 J( F& L& C: a- C% E& g$ X9 v10．注意脫水乾燥條件。$ M) H0 {1 @& q' Y9 j" t7 n1 x

C. 以離子交換色譜法為例，簡述濕法裝柱的操作過程和注意事項

先裝部分液體嗎，然後倒入色譜填料（色譜調料配置成懸浮液），倒的時候注意液面在填料上面，防止產生氣泡。色譜柱可以適當放液，增加填料的沉積速度。

D. 離子交換色譜法的分離原理

離子交換色譜（ion exchange chromatography，IEC）以離子交換樹脂作為固定相，樹脂上具有固定離回子基團及可交換的答離子基團。當流動相帶著組分電離生成的離子通過固定相時，組分離子與樹脂上可交換的離子基團進行可逆變換。根據組分離子對樹脂親合力不同而得到分離。
陽離子交換:
陰離子交換:
式中"－－"表示在固定相上，Kxy和Kzm是交換反應的平衡常數，Z+和X-代表被分析的組分離子。M+和Y-表示樹脂上可交換的離子團。
離子交換反應的平衡常數分別為：
陽離子交換：
陰離子交換：
平衡常數K值越大，表示組分的離子與離子交換樹脂的相互作用越強。由於不同的物質在溶劑中離解後，對離子交換中心具有不同的親合力，因此具有不同的平衡常數。親合力大的，在柱中的停留時間長，具有高的保留值。

E. 離子交換色譜法的原理，裝置及應用

原理：
離子交換色譜（ion exchange chromatography，IEC）以離子交換樹脂作為固定相，樹脂上具有固定離子基團及可交換的離子基團。當流動相帶著組分電離生成的離子通過固定相時，組分離子與樹脂上可交換的離子基團進行可逆變換。根據組分離子對樹脂親合力不同而得到分離。

裝置：
（1）分離柱 裝有離子交換樹脂，如陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂或螯合離子交換樹脂。為了減小擴散阻力，提高色譜分離效率，要使用均勻粒度的小球形樹脂。最常用的陽離子交換樹脂是在有機聚合物分子（如苯乙烯－二乙烯基苯共聚物）上連接磺酸基官能團（─SO3─）。最常用的陰離子交換劑是在有機聚合物分子上連接季銨官能團(─NH4)。這些都是常規高交換容量的離子交換樹脂，由於它們的傳質速度低，使柱效和分離速度都低。C.霍瓦特描述了一種薄膜陰離子交換樹脂，它是在苯乙烯－二乙烯基苯共聚物核心上沉澱一薄層陰離子交換樹脂，就象雞蛋有一薄層外皮那樣，離子交換反應只在外皮上進行,因此縮短了擴散的路徑,所以離子交換速度高，傳質快，提高了柱效。同樣，在小顆粒多孔硅膠上塗一薄層離子交換材料也可得到相同類型的樹脂。螯合離子交換樹脂具有絡合某些金屬離子而同時排斥另一些金屬離子的能力，因此這種樹脂具有很高的選擇性。除了離子交換柱外，其他高效液相色譜柱也可用於分離離子。
（2）抑制柱和柱後衍生作用 常用的檢測器不僅能檢測樣品離子，而且也對移動相中的離子有響應，所以必須消除移動相離子的干擾。在離子色譜中，消除(抑制)移動相離子干擾的常用方法有兩種。
①抑制反應，用抑制反應來改變移動相，使移動相離子不被檢測器測出。離子色譜通常使用電導檢測器。在抑制反應中??綞匝衾胱佣?裕?把高電導率移動相的氫氧化物轉變成水,而樣品離子則轉變成它們相應的酸：
NaOH+H+─→Na++H2O
NaX+H+─→HX+Na+
在裝有強酸性陽離子交換樹脂的柱中進行抑制反應，使用一段時間後，這種樹脂就需要再生，很不方便。改用連接有磺酸基(─SO3H)的離子交換膜(陽離子交換膜)或用連接有銨基(─NH4)的離子交換膜(陰離子交換膜)，就可以連續進行抑制反應。例如，陽離子交換膜可使陽離子通過它擴散過去，而陰離子則不能擴散過去。
1981年，T.S.史蒂文斯和斯莫爾等報道了中空纖維抑製法。這種纖維是由陽離子交換膜材料拉制而成。用這種方法不僅不需要再生抑制柱而且減小了峰的加寬，提高了柱效。一種比較新的膜技術是加一電場以加速離子的傳遞，該法與中空纖維法比較，其優點是反應時間短、交換能力高，並且可以用於陽離子和陰離子兩者。
②柱後衍生作用，將從柱子流出的洗出液與對被測物有特效作用的試劑相混合，在一反應器中生成帶色的絡合物（見配位化合物）。對衍生試劑最重要的要求是它們與被測物能生成絡合物，但不與移動相生成絡合物。柱後衍生法能用於測定重金屬離子，所用的衍生試劑有茜素紅S等。
（3）檢測器 分為通用型和專用型。通用型檢測器對存在於檢測池中的所有離子都有響應。離子色譜中最常用的電導檢測器就是通用型的一種。紫外－可見分光光度計是專用型的檢測器，對離子具有選擇性響應。可變波長紫外檢測器與電導檢測器聯用,能幫助鑒定未知峰,分辨重疊峰和提供電導檢測器不能測定的陰離子，如硫化物及亞砷酸中的陰離子的檢測。
在離子色譜中，電導檢測法總是和抑制反應配合使用。這種檢測器對分子不響應，如水、乙醇或者不離解的弱酸分子等。對於電導檢測器，一個重要的條件是溫度要穩定，所以檢測池要放在恆溫箱中，1982年H.薩托設計一種雙示差電導檢測器，消除了溫度變化對檢測的影響，可測定10-9摩爾的陰離子。

應用：
離子色譜主要用於測定各種離子的含量，特別適於測定水溶液中低濃度的陰離子，例如飲用水水質分析，高純水的離子分析，礦泉水、雨水、各種廢水和電廠水的分析，紙漿和漂白液的分析，食品分析，生物體液(尿和血等)中的離子測定，以及鋼鐵工業、環境保護等方面的應用。離子色譜能測定下列類型的離子：有機陰離子、鹼金屬、鹼土金屬、重金屬、稀土離子和有機酸,以及胺和銨鹽等。