A. 超濾離心管怎麼使用
蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的、不同體積大小和超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定。可重復使用。
1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，通常應截留分子量不應大於目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。
2、新買來的超濾是乾燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鍾。然後將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為准。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。
3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機預冷至4度）。膜與轉軸的方向根據說明書調整（角轉離心機的情況是膜與軸垂直）。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。
4、當濃縮到剩下1ml時，【取50ul國產Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】，繼續加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉澱，導致堵管。若發生沉澱，要確定沉澱的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，後者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發生沉澱為止。
5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經0.22um超濾膜超濾），再濃縮至1ml左右，連續三次，最後一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定，一般不多於500ul，也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的。
6、取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然後吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最後一點濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最後加入MilliQ水到超濾管中，沒過超濾膜，防止膜失水變干。
7、以下是處理超濾管，重復利用超濾管的步驟。
8、倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉澱，可以先加入水，然後用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉澱懸起，然後倒掉，不可用自來水猛沖】然後加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內壁再用MilliQ水洗干凈。
9、取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml
離心管，排出部分水，然後蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來說，按照上述步驟和注意事項，每根管用三四年不會壞。
B. 【求助】超濾離心是怎麼回事
超濾離心機是使用帶超濾膜的離心管，這個膜有分子量的區別，可以截留大於回膜孔徑的答分子，一般的離心機就可以了，還要選好你的離心管體積，這樣才能和你離心機配套使用 情非所屬(站內聯系TA)一般一百左右一根，特殊的可能更貴，有50ml，10ml，一般的離心機都可以，只要管子能套上，同一種物質在膜完好不堵塞的情況下可以重復下，但是不能太多次數，兩三次就好了！
C. 常用感受態細胞制備方法有哪些
方法一：
細菌轉化的方法多以Mendel和Higa（1970）的發現為基礎，其基本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化。
用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用於成批制備感受態細菌。本法適用於大多數大腸桿菌菌株，且迅速、重復性好。操作過程簡述如下。
1．從37℃培養16～20h的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52），或1ml新鮮的16～20h過夜培養物，轉到一個含有100mlLB培養基的1L或500ml燒瓶中。於37℃劇烈振搖培養約2～3h（旋轉搖床200～300r/min），每隔20～30min測量OD600值≈0.4。 2．在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min。
3．於4℃用SorvallGS2轉頭（或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞。
4．倒數培養液，將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。 5．以10ml用冰預冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉澱，放於冰上。
6．於4℃用SorvallGS3轉頭（或與其相應的轉頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞。
7．倒出培養液，將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。
8．每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存備用。
9．用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應混合物（體積≤10μl，DNA≤50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min。
10．將離心管放到預加溫到40℃的循環水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動試管。
11．快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min。 12．每離心管加800μlSOC培養基，用水浴將培養基加溫到37℃，然後將管轉移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復甦，並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。 13．將適當體積（每個90mm平板可達200μl）已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol/l MgSO4和相應抗生素的SOB培養基上。 14．將平板置於室溫至液體被吸收。
15．倒置平皿，於37℃培養，12～16h後可出現菌落。
方法二：
CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 採用一種簡單便捷的方法處理大腸桿菌，使其成為感受態細胞，便於質粒DNA的轉化，可滿足一般實驗的要求。與CaCl2法相比具有多種優點：使用方便，只需一步即可完成感受態細胞的制備；轉化效率略高於CaCl2法，一般可達106-108cfu/μg，滿足一般實驗需要；感受態細胞製成後即可保存於-70℃,無須加入甘油，並且經長期保存活力無明顯下降。 准備工作：
1． 從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌，在LB平板上劃線，37度過夜至長 出單菌落。挑形態飽滿的單菌落2個，分別接種5ml LB培養基中，37℃，250rpm， 過夜培養。
2． 次日從5ml LB培養物吸取200μl轉入50ml LB培養基中（250ml 錐形瓶），37 ℃，250rpm培養2小時，此時OD600約0.4—0.5。 感受態細胞的制備：
3． 吸取1ml菌液到1.5ml離心管里，5000rpm離心5分鍾，棄去上清。 4． 加入100μl預冷的Solution A，懸浮菌體，冰浴30分鍾。 5． 此時感受態細胞已經製成可立即使用或-70℃保存。 細胞轉化：
6． 在感受態細胞中加入100pg-10ngDNA，混勻，冰浴30分鍾，然後42℃ 1分鍾熱 擊，再次冰浴2 分鍾。加入0.9ml LB 培養基，20μl Solution B，37℃，振盪 培養1小時。
7． 取適當菌液（100-200μl）塗布相應抗性的平板。 8． 過夜培養約16個小時，數菌落數，計算轉化率。 補充說明：
1． 所用器具一定要清潔；
2． 操作步驟2 中培養基的裝量也是很重要的，建議裝量不要高於此值：500ml 錐形 瓶裝100ml培養基，250ml錐形瓶裝50ml培養基；
3． 在收獲菌體前半小時還可以在培養基中加入20mM的MgCl2 ，效果會更好一些； 4． 為保證細胞處於對數生長期，培養後的菌體的OD值不要高於0.6； 5． 制備感受態細胞時所有操作盡量保證在冰上操作；
6． 細胞轉化操作步驟6中也可以不必進行熱擊，冰浴後直接加入新鮮LB，簡化操作 步驟，但轉化效率低於熱擊方法，適用於對轉化率要求不高的實驗。
方法三：
1、取1%大腸桿菌E.coli接種於含2ml LB培養基的試管中，37℃振盪培養過夜 2、取0.1ml過夜培養物轉種於含10ml LB培養基的三角瓶中，37℃振盪培養3h至OD600=0.3
ml離心管中，冰浴10min。 4、在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液
5、把菌體懸浮於15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min 6、然後再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液
7、將菌體懸浮於0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。
方法四：
（1）將1ml過夜培養的細菌（如DH52、TG1、TM101）接種於100ml2×YT培養於500ml
燒瓶。於37℃刷烈振盪，通常≥200rpm培養的細菌密度約OD550=0.2～0.5(5×107
cells/ml),需2～4h。
（2）將培養物放於冰上致冷10min，於4℃離心細菌培養物，10000rpm離心10min。 （3）棄除上清，將細菌懸浮於原始培養體積的一半（約50ml）的50mMCaCl2和10mm Tris·HCl（pH8.0）無菌冷凍液體中。
（4）將細菌懸浮放在冰上約5min，然後將懸浮物於4℃10000/rpm離心10min。
（5）棄上清，懸浮細菌於原始培養體積的1/15的50mMCaCl和10mMTris·HCl（pH8.0）無菌冷凍中。此時的細胞是感受態細胞，即可用於轉化。200μl分裝於無菌的1.5ml微量離心管中，貯存於-80℃冰箱中。
方法五：
TSB法（也是本人熱衷的方法） 1.葯品制備
1M Mg2+
(1M MgSO4 和 1M MgCl2等體積混合)，用0.22um濾膜超濾除菌。 TSB液（30mL/ 80mL菌液）（現配現用）： PEG3350 3g Tryptone 0.3g Yeast extract 0.15g NaCl 0.3g 2. 步驟： （1）活化菌株
（2）挑單菌落培養於5mL 的液笨培養基中
（3）取液體培養物50uL於80mL的液體培養基中進行擴大培養
（4）370
C培養3－4小時，OD600在0.4－0.6 （5）離心，去上清
（6）加入20mLTSB，重懸 （7）離心，去上清
（8）加入10mLTSB，再加入15－20%的甘油，分裝保存 注，整個操作過程均應在冰上進行。所用葯品均需滅菌。
轉化程序 （1）取出200μl感受態細胞慢慢使其溶化，並立即放於冰上，加入DNA或連接反應混合物，DNA量通常≤50mg。用手指彈打試管10次，使之混勻，然後放在冰上40～45min。 （2）將管放於42℃水浴中2min。
（3）然後每管直接加入1.0ml2×YT培養基，倒置混勻，並於37℃培養8～12h，干浴或水浴，不需振搖。此期間使細菌生長並開始表達抗菌素。
（4）每200μl轉化混合物分別於6個2×YT瓊脂培養板上補充相應抗生素，並含有X-gal（20mg/ml）、IPTG（200mg/ml）。
D. 超濾離心管怎麼使用
蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定。可重復使用。
1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，通常應截留分子量不應大於目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。
2、新買來的超濾是乾燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鍾。然後將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為准。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。
3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機預冷至4度）。膜與轉軸的方向根據說明書調整（角轉離心機的情況是膜與軸垂直）。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。
4、當濃縮到剩下1ml時，【取50ul國產Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】，繼續加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉澱，導致堵管。若發生沉澱，要確定沉澱的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，後者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發生沉澱為止。
5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經0.22um超濾膜超濾），再濃縮至1ml左右，連續三次，最後一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定，一般不多於500ul，也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的。
6、取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然後吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最後一點濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最後加入MilliQ水到超濾管中，沒過超濾膜，防止膜失水變干。
7、以下是處理超濾管，重復利用超濾管的步驟。
8、倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉澱，可以先加入水，然後用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉澱懸起，然後倒掉，不可用自來水猛沖】然後加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內壁再用MilliQ水洗干凈。
9、取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml
離心管，排出部分水，然後蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來說，按照上述步驟和注意事項，每根管用三四年不會壞。