鈣型陽離子交換色譜法

❶ 離子色譜法測定氟化物、氯化物、硝酸鹽和硫酸鹽

方法提要

水樣中待測陰離子隨碳酸鹽-重碳酸鹽淋洗液進入離子交換柱系統(由保護柱和分離柱組成)，根據分離柱對各陰離子的不同的親和度進行分離，已分離的陰離子流經陽離子交換柱或抑制器系統轉換成具高電導度的強酸，淋洗液則轉變為弱電導度的碳酸。由電導檢測器測量各陰離子組分的電導率，以相對保留時間和峰高或面積定性和定量。

本法適用於水源水中可溶性氟化物、氯化物、硝酸鹽和硫酸鹽的測定。

本法最低檢測質量濃度決定於不同進樣量和檢測器靈敏度。一般情況下，進樣50μL，電導檢測器量程為10μs時適宜的檢測范圍為:0.1～1.5mg/L(以F^-計)，0.15～2.5mg/L(以Cl^-和NO^-₃-N計)，0.75～12mg/L(以SO^2-₄計)。

儀器和裝置

離子色譜儀包括進樣系統，分離柱及保護柱，抑制器(交換柱抑制器、膜抑制器或自動電解抑制器)等。

過濾器及濾膜0.2μm。

陽離子交換柱(圖81.3)裝入磺化聚苯乙烯強酸性陽離子交換樹脂。

試劑

圖81.3 離子交換柱

純水(去離子或蒸餾水)待測陰離子含量應低於儀器的檢測限，並經0.2μm濾膜過濾。

淋洗液［碳酸氫鈉(1.7mmol/L)-碳酸鈉(1.8mmol/L)溶液］稱取0.5712g碳酸氫鈉(NaHCO₃)和0.7632g碳酸鈉(Na₂CO₃)溶於純水中，稀釋至4000mL。

再生液Ⅰ(適用於非連續式再生的抑制器)0.5mol/LH₂SO₄介質。

再生液Ⅱ(適用於連續式再生的抑制器)25mmol/LH₂SO₄介質。

氟化物(F^-)標准儲備溶液ρ(F^-)=1mg/mL見81.14.1。

圖81.4 離子色譜圖

氯化物(Cl^-)標准儲備溶液ρ(Cl^-)=1mg/mL稱取1.6485g經105℃乾燥至恆量的氯化鈉(NaCl)溶於純水中，稀釋至1000mL。

硝酸鹽(NO^-₃)標准儲備溶液ρ(NO^-₃)=1mg/mL稱取7.218g經105℃乾燥至恆量的硝酸鉀(KNO₃)溶於純水中，稀釋至1000mL。

硫酸鹽(SO²₄^-)標准儲備溶液ρ(SO²₄^-)=1mg/mL稱取1.814g經105℃乾燥至恆量的硫酸鉀(K₂SO₄)溶於純水中，稀釋至1000mL。

混合陰離子標准溶液(含F^-5mg/L，Cl^-8mg/L，NO^-₃-N8mg/L，SO^2-₄40mg/L)分別吸取5.00mL、8.00mL、40.0mL上述單離子標准儲備溶液於1000mL容量瓶中，加純水至刻度，混勻。此溶液適合進樣50μL，檢測器為30μS量程圖81.4)。

分析步驟

開啟離子色譜儀，調節淋洗液及再生液流速，使儀器達到平衡，並指示穩定的基線。

根據所用的量程，將混合陰離子標准溶液及兩次等比稀釋的3種不同濃度標准溶液，依次注入進樣系統。將峰值或者峰面積繪制校準曲線。

將水樣經0.2μm濾膜過濾除去渾濁物質。對硬度高的水樣，必要時可先經過陽離子交換樹脂柱，然後再經0.2μm濾膜過濾。對含有機物水樣可先經過C₁₈柱過濾除去。

將預處理後的水樣注入色譜儀進樣系統，記錄峰高或峰面積，直接在校準曲線上查得各種陰離子的質量濃度(mg/L)。

注意事項

1)水樣中存在較高濃度的低相對分子質量有機酸時，由於其保留時間與被測組分相似而干擾測定，用加標後測量可以幫助鑒別此類干擾。水樣中某一陰離子含量過高時，影響其他被測離子的分析，稀釋可以減弱此類干擾。

2)由於進樣量很少，操作中必須嚴格防止純水、器皿以及水樣預處理過程中的污染，以確保分析的准確性。

3)為了防止保護柱和分離柱系統堵塞，水樣必須經過0.2μm濾膜過濾。為了防止高濃度鈣、鎂離子在碳酸鹽淋洗液中沉澱，可將水樣先經過強酸性陽離子交換樹脂柱。

4)不同濃度離子同時分析時的相互干擾，或存在其他組分干擾時可採取水樣預濃縮、梯度淋洗或將流出液分部收集後再進樣的方法消除干擾，但必須對所採取的方法的精密度及准確性進行確認。

❷ 離子交換色譜法結合酸鹼滴定法測定枸櫞酸鈉的原理是什麼

含有鈣離子或鎂離子造成水硬度的主為成分。離子交換色譜法掌握用離子交換法測定溶度積，結合酸滴鹼定法測定枸櫞酸鈉加深對鈉離子交換基本理論的理解，原理是含有鈣離子或鎂離子是造成水硬度的主為成分。

❸ 請問HPLC是做什麼的原理操作方法

HPLC是高效液相色譜，英文全稱是High Performance Liquid Chromatography。該方法在化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中被用來做重要的分離分析技術。

用途：高效液相色譜更適宜於分離、分析高沸點、熱穩定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質，因而廣泛應用於核酸、肽類、內酯、稠環芳烴、高聚物、葯物、人體代謝產物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除莠劑的分析等物質的分析。

原理：高效液相色譜以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析和分離。

操作方法：如下圖所示，溶劑貯器中的流動相被泵吸入，經梯度控制器按一定的梯度進行混合然後輸出，經測其壓力和流量，導入進樣閥（器）經保護柱、分離柱後到檢測器檢測，由數據處理設備處理數據或記錄儀記錄色譜圖，餾分收集器收集餾分，廢液瓶收集廢液。

(3)鈣型陽離子交換色譜法擴展閱讀：

液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，於60年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。

HPLC根據固定相和流動相的成分分為正相色譜和反向色譜。

正相色譜法

採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

反相色譜法

一般用非極性固定相（如C18、C8)；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用於分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。

參考資料：網路-高效液相色譜

❹ 跪求實驗方案急。關於植物小分子多肽的提取分離和分析 最好用到高效液相提取 分析的

多肽類化合物廣泛存在於自然界中，其中對具有一定生物活性的多肽的研究，一直是葯物開發的一個主要方向。生物體內已知的活性多肽主要是從內分泌腺組織器官、分泌細胞和體液中產生或獲得的，生命活動中的細胞分化、神經激素遞質調節、腫瘤病變、免疫調節等均與活性多肽密切相關。隨著現代科技的飛速發展，從天然產物中獲得肽類物質的手段也不斷得到提高。一些新方法、新思路的應用。不斷有新的肽類物質被發現應用於防病治病之中。本文介紹了近幾年肽類物質分離、分析的主要方法研究進展。
1 分離方法
採取何種分離純化方法要由所提取的組織材料、所要提取物質的性質決定。對蛋白質、多肽提取分離常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉澱法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化，同時上述這些方法也是蛋白、多肽類物質分析中常用的手段，如層析、叫泳等。
1.1 高效液相色譜（HPLC）
HPLC的出現為肽類物質的分離提供了有利的方法手段，因為蛋白質、多肽的HPLC應用與其它化合物相比，在適宜的色譜條件下不僅可以在短時間內完成分離目的，更重要的是HPLC能在制備規模上生產具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質分離制備的最佳條件上，不少學者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測定都是目前研究的內容。
1．1．1 反相高效液相色譜（RP-HPLC）
結果與保留值之間的關系：利用RP-HPLC分離多肽首先得確定不同結構的多肽在柱上的保留情況。為了獲得一系列的保留系數，Wilce等利用多線性回歸方法對2106種肽的保留性質與結構進行分析，得出了不同氨基酸組成對保留系數影響的關系，其中極性氨基酸殘基在2～20氨基酸組成的肽中，可減少在柱上的保留時間；在10～60氨基酸組成的肽中，非極性氨基酸較多也可減少在柱上的保留時間，而含5～25個氨基酸的小肽中，非極性氨基酸增加可延長在柱上的保留時間。同時有不少文獻報道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留情況的影響，並利用計算機處理分析得到每種多肽的分離提取的最佳條件。
肽圖分析（Peptide Mapping）：肽圖分析是根據蛋白質、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點，使用專一性較強的蛋白水解酶[一般未肽鏈內切酶（endopeptidase）]作用於特殊的肽鏈位點將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特徵性指紋圖譜，肽圖分析對多肽結構研究合特性鑒別具有重要意義。利用胰蛋白酶能特意性作用於Arg和Lys羧基端的肽鏈的性質，通過RP-HPLC法採用C18柱檢測了重組人生長激素特徵性胰肽圖譜。同時胰島素的肽圖經V8酶專一裂解也製得，並可鑒別僅相差一個氨基酸殘疾的不同種屬來源的胰島素。人類腫瘤壞死因子的單克隆抗體結構也應用酶解法及在線分析技術確定了肽圖，便於鑒定分析。此項技術已經在新葯開發中得到廣泛應用。
1.1.2 疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）
HIC是利用多肽中含有疏水基因，可與固定相之間產生疏水作用而達到分離分析的目的，其比RP-GPLC具有較少使多肽變性的特點。利用GIC分離生產激素（GH）產品的結構與活性比EP-GPLC分離的要穩定，活性較穩定。Geng等利用HIC柱的低變性特點，將大腸桿菌表達出的經鹽酸胍乙啶變性得到人重組干擾素-γ。通過HIC柱純化、折疊出高生物活性的產品。不同人尿表皮生長因子（EGF）也利用HIC純化到了，均具有良好的生物活性。HIC可將未經離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC則不能達到這一要求。
1.1.3 分子排阻色譜（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）
SEC是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質，特別對一些較大的聚集態的分子更為方便，如人重組生長激素（hgH）的分離，不同結構、構型的GH在SEC柱上分離行為完全不同，從而可分離不同構型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體，利用SEC研究修飾化的PEG的分離方法，此PEC具有半衰期長、作用強的特點。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。
1．1．4離子交換色譜（Iron-Exchange chromatography,IEXC）
IEXC可在中性條件下，利用多肽的帶電性不同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質的分離分析研究中，對多肽的性質、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽分離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。Wu等報道利用離子交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐異構體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價值的數據供今後此類物質分離研究。
1．1．5膜蛋白色譜（Chromatography of Membrane Protein,CMP）
CMP+分離強蔬水性蛋白、多肽混合物的層析系統，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白後形成SDS-融膜蛋白，並由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結合主要決定於膜蛋白的大小、SDS結合量有關。利用原子散射法研究cAMP的分離機制發現，樣品與SDS結合後在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。
1．1．6高效置換色譜（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）
HPDC是利用小分子高效置換劑來交換色譜柱上的樣品，從而達到分離的目的。它具有分離組分含量較少成分的特性。利用HPDC鑒定分離了低於總量1%組分的活性人重組生長激素（rHG ）。在研究非毒性交換劑時Jayarama發現硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是對β乳球蛋白A和B的良好置換劑，一般DS的相對分子質量為1×104和4×104最宜。研究表明置換劑的相對分子質量越低，越易於與固定相結合，因此在分離相對分子質量小的多肽時，需要更小的置換劑才能將其置換純化出來。
1.1.7 灌注層析（Perfusion Chromatography，PC）
PC是一種基於分子篩原理與高速流動的流動相的層析分離方法，固定相孔徑大小及流動相速度直接影響分離效果。試驗證明其在生產、制備過程中具有低投入、高產出的特性。目前市場上可供應的PC固定相種類較多，適合於不同分子量的多肽分離使用。
1.2 親和層析（Affinity Chromatography，AC）
AC是利用連接在固定相基質上的配基與可以和其特異性產生作用的配體之間的特異親和性而分離物質的層析方法。自1968年Cuatrecasas提出親和層析概念以來，在尋找特異親和作用物質上發現了許多組合，如抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補鏈等等。對多肽類物質分離目前主要應用其單抗或生物模擬配基與其親和，這些配基由天然的，也有根據其結構人工合成的。Patel等人利用一系列親和柱分離純化到了組織血漿纖維蛋白酶原激活劑蛋白多肽。
固定金屬親和層析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年來發展起來的一種親和方法。其固定相基質上鰲合了一些金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通過配為鍵鰲合側鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結構最易結合到金屬離子親和柱上，純化效果較好。其中胰島素樣生長因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氫葉還原酶融合蛋白等均用此方法分離到純度較高的產品。
Chaiken等人報道了另一種親和層析方法，利用反義DNA表達產生，其與正鏈DNA表達產生的肽或蛋白具有一定的親和性，如Arg加壓素受體復合物，已用此法分離得到。DNA與蛋白、多肽復合物之間的作用也是生物親和中常用的方法。將人工合成的寡核苷酸結合在固定相基質上，將樣品蛋白或多肽從柱中流過，與之結合可達到分離特定結構多肽的目的。
1.3 毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）--分離分析方法
CE是在傳統的電泳技術基礎上於本世紀60年代末由Hjerten發明的，其利用小的毛細管代替傳統的大電泳槽，使電泳效率提高了幾十倍。此技術從80年代以來發展迅速，是生物化學分析工作者與生化學家分離、定性多肽與蛋白類物質的有利工具。CE根據應用原理不同可分為以下幾種；毛細管區帶電泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛細管等電聚焦電泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛細管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）和膠束電動毛細管層析（Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC）等。
1.3.1 毛細管區帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）
CZE分離多肽類物質主要是依據不同組分中的化合物所帶電性決定，比傳統凝膠電泳更准確。目前存在於CZE分離分析多肽物質的主要問題是天然蛋白或肽易與毛細管硅膠柱上的硅醇發生反應，影響峰形與電泳時間，針對這些問題不少學者做了大量實驗進行改進，如調節電池泳液的PH值，使與硅醇反應的極性基團減少；改進毛細管柱材料的組成，針對多肽性質的不同採取不同的CZE方法研究分離5個含9個氨基酸殘基的小肽，確定了小肽分析的基本條件，即在低PH條件下，緩沖液中含有一定濃度的金屬離子如Zn2+等，此時分離速度快而且准確。
1．3．2細管等電聚電泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF）
由於不同的蛋白、多肽的等電點（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的電泳槽中，其可在等電點pH條件下聚集沉澱下來，而與其他肽類分離開來。CIEF在分離、分析混合多肽物質中應用不多，主要應用與不同來源的多肽異構體之間的分離，如對rHG不同異構體分離。由於在CIEF柱表面覆蓋物的不穩定性限制了此法的廣泛應用。
1．3. 3毛細管凝膠電泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
CGE是基於分子篩原理，經十二烷基磺酸鈉（SDS）處理的蛋白或多肽在電泳過程中主要靠分子形狀、分子量不同而分離。目前，又有一種非交聯歡、線性、疏水多聚凝膠柱被用於多肽物質的分離分析，此電泳法適於含疏水側鏈較多的肽分離，這種凝膠易於灌注，使用壽命長，性質較為穩定。
1．3．4膠束電動毛細管層析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC）
MECC的原理是在電泳液中加入表面活性劑，如SDS，使一些中性分子帶相同電荷分子得以分離。特別對一些小分子肽，陰離子、陽離子表面活性劑的應用都可使之形成帶有一定電荷的膠束，從而得到很好的分離效果。有文獻報道在電解液中加入環糊精等物質，可使用權含疏水結構組分的多肽選擇性與環糊精的環孔作用，從而利用疏水作用使多肽得到分離。
1．4多肽蛋白質分離工程的系統應用
以上提到的分離多肽的技術在實際應用過程中多相互結合，根據分離多肽性質的不同，採用不同的分離手段。特別是後基因組時代，對於蛋白質組深入的研究，人們對於分離多肽及蛋白質的手段不斷改進，綜合利用了蛋白質和多肽的各種性質，採用包括前面提到的常規蛋白多肽提取方法，同時利用了高效液相色譜，毛細管電泳，2-D電泳等手段分離得到細胞或組織中盡可能多的蛋白多肽。在蛋白質組學研究中系統應用蛋白和多肽分離鑒定的技術在此研究中即是分離手段也是分析方法之一。特別是以下提到的質譜技術的發展，大大的提高了蛋白多肽類物質的分析鑒定的效率。
2 分析方法
2．1 質譜分析（Mass Spectrometry, MS）
MS在蛋白、多肽分析中已經得到了廣泛應用，特別是在分離純化後的在線分析中，MS的高敏性、快速性特別適合多肽物質分析鑒定。其中連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）和電霧離子化質譜（Electrospray Ionization, EIS）是近幾年發展起來的新方法。
2．1．1連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）
cf-FAB是一種弱離子化技術，可將肽類或小分子量蛋白離子化成MH+或（M-H）形式。主要應用於肽類的分離檢測，其具有中等解析度，精確度大於+0.2amu，流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在測定使流動相需加0.5%-10%基質如甘油和高有機溶劑成分，使樣品在檢測探針處達到敏感化。cf-FAB常與HPLC、CEZ等方法結合使用達分離分析的目的，許多多肽的cf-FAB分析方法已經建立，並得到很好的應用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。證明L-Pro在保持小肽構相穩定性。連接分子方面具有重要意義。
2.1.2 電霧離子化質譜（Electrospray Ionozation，EIS）
EIS可產生多價離子化的蛋白或多肽，允許相對分子質量達1×105蛋白進行分析，解析度在1500-2000amu。精確度在0.01%左右。EIS更適合相對分子質量大的蛋白質的在線分析，且需要氣化或有機溶劑使樣品敏感化。利用EIS與HPLC聯合分離分析GH和血紅蛋白均獲成功，其也可與CEZ聯合應用。
2.1.3 基質輔助激光解析/離子化-飛行時間質譜（Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry，MALDI-TOF MS）
MALDI-TOF是目前蛋白質鑒定中精確測定測定分子質量的手段，特別適合對混合蛋白多肽類物質的相對分子質量的測定，靈敏度和解析度均較高。它是目前蛋白質組學研究的必備工具。同時結合液相色譜的聯用技術可以高效率的鑒定多肽物質。特別是當各種原理的質譜技術串聯應用時，不但可以得到多肽的相對分子質量信息，還可以測定它的序列結構，此項技術將在未來蛋白質組學研究中起到決定性作用。
2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance，NMR)
NMR因圖譜信號的純數字化、過度的重疊范圍過寬（由於相對分子質量太大）核信號弱等原因，在蛋白、多肽物質的分析中應用一直不多。隨著二維、三維以及四維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發展，使NMR逐漸成為此類物質分析的主要方法之一。NMR可用於確定氨基酸序列、定量混合物中的各組分組成含量等分析中。但要應用於蛋白質分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的蛋白質有特定的形狀而便於定量與定性分析，如何減少數據處理的時間問題等。這些問題多有不少學者在進行研究。雖然在蛋白質分析中應用較少，NMR在分析分子中含少於30個氨基酸的小肽時是非常有用的，可以克服上述蛋白質分析中的缺點而達到快速准確分析的目的。
2.3 其他
除上述方法之外，氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質譜、IR、UV光譜、CD、圓而色譜、生物鑒定法、放射性同位素標記法及免疫學方法等都已應用於多肽類物質的結果鑒定、分析檢測之中。
以上簡要的介紹了近幾年多肽物質分離、分析的常用方法及最新研究方向。隨著科學技術水平的不斷發展，會有許多更新的分離分析手段不斷涌現，因此這一領域的研究具有廣闊的前景。 應用SDS-PAGE顯示小分子多肽
SDS-PAGE在分離、鑒定和純化蛋白質方面有著廣泛應用，其有效分離范圍取決於聚丙烯醯胺的濃度和交聯度，其孔徑隨著雙丙烯醯胺與丙烯醯胺比率的增加而減小，比率接近於1：20時，孔徑達到最小值。分子量低於10kD的小分子肽類，即使用較高濃度的聚丙烯醯胺凝膠的SDS-PAGE也不能完全分離，或是顯不出色，或是顯帶較弱，帶型彌散。且分子量越小，效果也越差。
為了能在SDS-PAGE上顯示測定小分子量的多肽，通常採取兩種方法：一是增加凝膠的濃度和交聯度，在制膠時加入一些可以降低聚丙烯醯胺凝膠網限孔徑的溶質分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物質；二是選擇緩沖液中的拖尾離子的種類和濃度以達到改善多肽的分離效果。
操作步驟
1．電泳緩沖液的配製如下表所示
緩沖液Tris
(mol/L)Tricine
(mol/L)pHSDS
(%)
陽極緩沖液
陰極緩沖液
膠緩沖液0.2
0.1
3.0—
0.1
—8.9*
8.25**
8.4*—
0.1
0.3
* 用HCl調pH
** pH約為8.25

2．丙烯醯胺貯存液的配製
單丙-雙丙混合物單丙的百分數雙丙的百分數
49.5% T, 3%C
49.5% T, 6%C48
46.51.5
3.0
T：丙烯醯胺的總濃度
C：交聯度

3．膠的制備，與一般SDS-PAGE相似，按下表配製分離膠和濃縮膠
組 份分離膠
16% T，6%C濃縮膠
6% T，3%C
49.5% T, 3%C丙烯醯胺溶液（ml）
49.5% T, 6%C 丙烯醯胺溶液（ml）
膠緩沖液（ml）
脲（g）[甘油（ml）]
水（ml）
10%過硫酸銨（μl）
TEMED（μl）
總體積（ml）—
3.3
3.3
3.6[2.4]
1
40
4.0
10.040.48
—
1.00
—
1.50
25
2.5
3.03
4．樣品緩沖液
4% SDS
12%甘油
50mmol/L Tris
2%巰基乙醇
0.01% Serva blue
多肽樣品與樣品緩沖液混合沸煮2min（或40℃溫浴30min）。
5．將灌膠的玻璃板固定在電泳裝置上，用1%瓊脂糖封邊，倒入陰極緩沖液，依次加樣。
6．將電泳裝置放入電泳槽內，倒入陽極緩沖液，將正負極與電泳儀相接，恆電壓50~60V，待指示劑進入分離膠後，電壓可升至70~90V，恆壓約3h待指示劑走出凝膠下緣停止電泳。
7．染色、脫色及膠的保存同SDS-PAGE。

❺ 吸附薄層層析與分配，離子交換薄層層分析的區別

離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤鹼性物質交換過程中發現離子交換現象。本世紀40年代，出現了具有穩定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進入生物化學領域，應用於氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學領域中常用的一種層析方法，廣泛的應用於各種生化物質如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹脂 。
離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將
吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。
⒈離子交換劑預處理和裝柱對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。
⒉加樣與洗脫加樣：層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。
洗脫：已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6.兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1＝A2時為線性梯度，當A1＞A2時為凹形梯度，A1＞A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求：①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不致於太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
⒊洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。
⒋離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產品建立用0.02％疊氮鈉。
⒌離子交換層析的應用離子交換層析技術已廣泛用於各學科領域。在生物化學及臨床生化檢驗中主要用於分離氨基酸、多肽及蛋白質，也可用於分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。

概念
層析是「色層分析」的簡稱。利用各組分物理性質的不同，將多組分混合物進行分離及測定的方法。有吸附層析、分配層析兩種。一般用於有機化合物、金屬離子、氨基酸等的分析。
層析（chromatography）利用物質在固定相與流動相之間不同的分配比例，達到分離目的的技術。層析對生物大分子如蛋白質和核酸等復雜的有機物的混合物的分離分析有極高的分辨力。
[編輯本段]語源學
chrome意為「色彩」，graphy源自希臘文，意為「寫」。色譜為層析的同義語，都是從英語chromatography譯來的。
層析（色譜） chromatograpby
在把微細分散的固體或是附著於固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動相的系統中，使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態邊移動，利用各成分對固定相親和力不同所引起的移動速度差，將它們彼此分離開的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。根據移動相種類的不同，分為液體層析、氣體層析二種。用作固定相的有矽膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當的液體，也可使用其他物質。將作為固定相的微細粉末狀物質裝入細長形圓筒中進行的層析稱為柱層析（column chromatogra-phy），在玻璃板上塗上一層薄而均的物質作為固定相的稱為薄層層析（thin-layer chromatography），後者可與用濾紙作為固定相的紙上層析進行同樣的分析，即在固定相的一端，點上微量試料，在密閉容器中，使移動相（液體）從此端滲入，移動接近另一端。通過這種展開操作，各成分呈斑點狀移動到各自的位置上，再根據Rf值的測定進行鑒定。當斑點不易為肉眼觀察時，可利用適當的顯色劑，或通過紫外燈下產生熒光的方法進行觀察。也可採用在第一種移動相展開後再用另一移動相進行展開（這時的展開方向應與原方向垂直），使各成分分離完全的雙相層析（two-dimensional chromatography）。分離後，將斑點位置的固定相切取下來，把其中含有來自試料的物質提取進行定量分析。但為制備與定量，柱層析則更為適宜。在柱層析中，移動相從加入試料的一端展開到達另一端後，繼續展開使各成分和移動相一起向柱外分別溶出，這就是廣泛使用的所謂洗提層析（elution chromatography）。層析根據固定相與溶質（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型（離子交換層析）等三種類型。但這並不是很嚴格的，有時常見到其中間類型。此外，近來也應用親和層析，即將與基質類似的化合物（通常為共價鍵）結合到固定相上，再利用其特異的親和性沉澱與其對應的特定的酶或蛋白質。
[編輯本段]類別
◆按層析的機理劃分：
吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。
分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數不同，使之分離。
離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。
凝膠層析：利用某些凝膠對於不同分子大小的組分阻滯作用的不同。
◆按流動相與固定相的不同劃分：
氣相層析、液相層析。這兩大類層析是以流動相不同來劃分的。如同時區分流動相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析等。
◆按操作形式劃分：
柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等。
柱層析：將固定相裝於柱內，使樣品沿一個方向移動而達到分離。
紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣後，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。
薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。
以上劃分無嚴格界限，有些名稱相互交叉，如親和層析應屬於一種特殊的吸附層析，紙層析是一種分配層析，柱層析可做各種層析。
[編輯本段]基本原理
層析須在兩相系統間進行。一相是固定相，需支持物，是固體或液體。另一相為流動相，是液體或氣體。當流動相流經固定相時，被分離物質在兩相間的分配，由平衡狀態到失去平衡到又恢復平衡，即不斷經歷吸附和解吸的過程。隨著流動相不斷向前流動，被分離物質間出現向前移動的速率差異，由開始的單一區帶逐漸分離出許多區帶，這個過程叫展層。
系數K是物質在兩相中的濃度比。K值大，則在固定相中吸附牢，K值小吸附差。各物質間的K值差別大，則易被分離。不同類型層析的K值含義不同，可視為吸附平衡常數，分配常數或離子交換常數等。
研究層析現象而發展的塔板理論，與有機化學實驗中的分餾法原理有些相似。被分餾的有機溶劑在分餾柱內的填充物上形成許多熱交換層，從而把低沸點溶劑先分餾出來，達到純化的目的。在層析時用理論塔板數n來衡量層析效能。
tR為物質在層析柱上的保留時間，W為洗脫下來的物質峰形的寬度。n值愈大表示層析柱的效能愈高。如用理論塔板高度H表示，則包含了層析柱長度的因子。
式中L為層析柱的柱長。H值越大，則柱效越低。
此外影響層析分離效果的還有渦流擴散、縱向擴散和傳質阻抗等因素。因此選擇層析固定相支持物的粒度、均勻度等物理性能，流動相的層析系統和溫度等都是做好層析的關鍵。
[編輯本段]幾種常用的層析
◆吸附層析
吸附劑的吸附力強弱，是由能否有效地接受或供給電子，或提供和接受活潑氫來決定。被吸附物的化學結構如與吸附劑有相似的電子特性，吸附就更牢固。常用吸附劑的吸附力的強弱順序為：活性炭、氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、石膏、纖維素、澱粉和糖等。以活性炭的吸附力最強。吸附劑在使用前須先用加熱脫水等方法活化。大多數吸附劑遇水即鈍化，因此吸附層析大多用於能溶於有機溶劑的有機化合物的分離，較少用於無機化合物。洗脫溶劑的解析能力的強弱順序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。為了能得到較好的分離效果，常用兩種或數種不同強度的溶劑按一定比例混合，得到合適洗脫能力的溶劑系統，以獲得最佳分離效果。
◆分配層析
在支持物上形成部分互溶的兩相系統。一般是水相和有機溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和澱粉等，這些親水物質能儲留相當量的水。被分離物質在兩相中都能溶解，但分配比率不同，展層時就會形成以不同速度向前移動的區帶。
◆離子交換層析
支持物是人工交聯的帶有能解離基團的有機高分子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。帶陽離子基團的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等為陽離子交換劑。帶陰離子基團的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四級胺乙基）等為陰離子交換劑。離子交換層析只適用於能在水中解離的化合物，包括有機物和無機物。對於蛋白質、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團在水溶液中解離後，能吸引水中被分離物的離子，各種物質在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態，各種離子有不同的交換常數，K值愈高，被吸附愈牢。洗脫時，增加溶液的離子強度，如改變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。洗脫過程中，按K值不同，分成不同的區帶。
◆凝膠過濾層析
支持物是人工合成的交聯高聚物，在水中膨脹後成為凝膠。凝膠內為內水層，凝膠周圍的水為外水層。控制交聯度以形成不同孔徑的網狀結構。交聯度小的孔徑大，交聯度大的孔徑小。凝膠只允許被分離物質中小於孔徑的分子進入，大於孔徑的分子被排斥在外水層，最先被洗脫下來。而進入孔徑的分子也按分子量大小大致分離成不同的區帶。選擇不同規格的凝膠，可把一個混合物按分子量的差異分成不同的組分。這種方法曾被稱為分子篩。目前常用的凝膠商品有：葡聚糖凝膠（sephadex）、聚丙烯醯胺凝膠（bio-gel）、瓊脂糖凝膠（sepharose）和聚苯乙烯凝膠（styragel）等。
◆親和層析
在一對有專一的相互作用的物質中，把其中之一聯結在支持物上，用於純化相對的另一物質。常見的親和對如：酶和抑制劑，抗原和抗體，激素和受體等。支持物為瓊脂糖或纖維素等。
◆氣相層析
屬於分配層析或吸附層析，僅適用於分析分離揮發性和低揮發性物質。固定相是在惰性支持物（如磨細的耐火磚）上覆蓋一層高沸點液體，如硅油、高沸點石蠟和油脂、環氧類聚合物。外塗層約為支持物重量的20％。分析時操作溫度范圍，一般從室溫到200℃。特殊的層析柱能達到500℃。流動相常用氦、氬或氮為展層氣體。氣相層析分離的區帶十分清晰，是由於揮發性物質在兩相間能很快達到平衡，所需分析時間大為縮短，一般為數分鍾至10餘分鍾。檢測記錄系統繪出的各峰是測定流出氣體電阻變化的結果，因而測定樣品量可到微克和毫微克水平。具有快速、靈敏和微量的優點。氣相層析也能用於分離制備樣品，但需增加將流出氣體通過冷凍將分離物回收的裝置。
◆紙層析
以濾紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質，能形成水相和展層溶劑的兩相系統，被分離物質在兩相中的分配保持平衡關系。紙層析用於分析簡單的混合物時可做單向層析。對於復雜的混合物，可做雙向層析。1944年A．J．P．馬丁第一次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果，開創了近代層析的發展和應用的新局面。70年代以後，紙層析已逐漸為其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如離子交換層析、薄層層析、高效液相層析等所代替。
◆薄層層析
在玻璃片、金屬箔或塑料片上鋪上一層約1～2毫米的支持物，如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚醯胺等，根據需要做不同類型的層析。聚醯胺薄膜是一種特異的薄層，將尼龍溶解於濃甲酸中，塗在滌綸片基上，當甲酸揮發後，在滌綸片基上形成一層多孔的薄膜，其分辨力超過了用尼龍粉鋪成的薄層。薄層層析較紙層析優越在於分辨高，展層時間短。例如用紙層析做氨基酸分析，往往需要兩天時間，而且對層析條件要求嚴格，不易得到滿意的分離效果。如用薄層層析做，一般約需半小時，分離效果更好。薄層層析一般用於定性分析。也能用於定量分析和制備樣品。
◆高效液相層析（又名高壓液相色譜）
70年代新發展的層析法。其特點是：用高壓輸液泵，壓強最高可達5000psi（相當於34個標准大氣壓）。用直徑約3～10微米的超細支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上塗一層1～2微米的二氧化硅，經硫醯氯反應生成Si—Cl，進一步連接疏水的烷基，如Si—C18H37，或陽離子交換基團—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或陰離子交換基團—Si（CH2）nNH2。這種支持物能承受很高的壓力，化學性能穩定。用不同類型支持物的HPLC，可做吸附層析、離子交換層析和凝膠過濾層析。其分析微量化可達10-10克水平。但用於制備，可以純化上克的樣品。展層時間短，一般需幾分鍾到10餘分鍾。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適於分析分離不揮發和極性物質。而氣相層析只適用於揮發性物質，兩者互為補充，都是目前最為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀，數據處理的積分儀和記錄儀等電子系統，成為一種先進的分析儀器，在生物化學、化學、醫葯學和環境科學的研究中發揮了重要作用。
◆反相層析
在吸附層析中，高極性物質在層析柱上吸附較牢，洗脫時發生拖尾現象和保留時間長的問題。如果在支持物上塗上一層高碳原子的疏水性強的烷烴類，洗脫液用極性強的溶劑，如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強的物質不被吸附，最先洗下來，得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反，故稱為反相層析。目前用HPLC做反相層析常用的ODS柱，即在支持物的表面上連接了C18H37Si—基團。
◆同系層析
在核酸分析中，將樣品經核酸酶部分裂解成不同長度的核苷酸片段，用同位素標記後，在DEAE纖維素薄層上分離，用含有未標記的相同的核苷酸片段作展層溶劑，這樣，未標記的核苷酸把標記過的核苷酸推進，使按分子量大小不同把標記核苷酸片段，按由小到大的次序排列，達到分離的目的。於是把這種層析法稱為同系層析。同系層析和電泳相結合曾用於寡核苷酸的順序分析。
紙層析是層析法的一種,要了解紙層法還得從層析法開始.層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），是一種基於被分離物質的物理、化學及生物學特性的不同，使它們在某種基質中移動速度不同而進行分離和分析的方法。例如：我們利用物質在溶解度、吸附能力、立體化學特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學反應等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數（或稱分配常數）不同，達到彼此分離的目的。
層析法的最大特點是分離效率高，它能分離各種性質極相類似的物質。而且它既可以用於少量物質的分析鑒定，又可用於大量物質的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應用於科學研究與工業生產上。現在，它在石油、化工、醫葯衛生、生物科學、環境科學、農業科學等領域都發揮著十分重要的作用。
層析根據固定相基質的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。其中紙層析是指以濾紙作為基質的層析。

❻ 易解石、黑稀金礦物和褐釔鈮礦分析

易解石(Ce、Ca、Th、Fe、…)(Ti、Nb)₂O₆、黑稀金礦(La、U、Y、…)(Ti、Ta、Nb)₂O₆、褐釔鈮礦(RE、U、Th)(Nb、Ta)O₄均是稀土元素與鈾、釷的鈮鉭鈦酸鹽礦物，成分和含量復雜多變，主要的伴生元素有W、Pb、Fe、Ca、Mg和F等。

稀土元素、鈾和釷，以及鈮和鉭等分析難度很大的元素均共生於這類礦物中。試樣用氫氟酸-硫酸或氟化氫鉀分解，然後用萃取或離子交換分離方法進行多次分離，最後進行各個組分的測定。

70.4.5.1 萃取分離-微量分析法

5mg試樣用氫氟酸-硫酸分解，製成鹽酸-草酸溶液，移取部分溶液測定Fe、Ti和W，另取部分溶液通過萃取-反萃取，測定Nb、Ta、Th、U、REEs、Al、Ca、Mg、Mn和Pb等，其分析流程見圖70.18。

圖70.18 黑稀金礦、易解石和褐釔鈮礦單礦物萃取分離-微量分析法分析流程

試劑

苯甲醯苯胲溶液1g苯甲醯苯胲溶於100mL丁醇，加200mL三氯甲烷，混合後使用，如渾濁可過濾。

分析步驟

(1)試樣溶液的制備

稱取5mg(精確至0.001mg)試樣，置於10mL鉑坩堝中，以少許水潤濕，加入5～6滴(1+1)H₂SO₄和5～6滴HF，在控溫電爐上分解試樣。溫度由低升高，蒸發冒硫酸煙，中間再加少許(1+1)H₂SO₄，最後保留少許H₂SO₄，使呈濕鹽狀。取下坩堝放入100mL燒杯中，加入10mL8mol/LHCl-20g/L草酸溶液，溫熱浸取(如遇有不純雜質可加少許焦硫酸鉀，濃硫酸1～2滴，在噴燈上熔融後再浸取。含銻、錫試樣，可先經碘化銨處理後，酸溶)。用同樣溶液洗凈坩堝，轉移溶液至50mL容量瓶中並稀釋到刻度，為溶液(A)。

移取20.0mL溶液(A)，放入50mL分液漏斗中，加入10mL苯甲醯苯胲溶液，在震盪機上萃取10min，放置分層後，有機相轉入50mL容量瓶中。水相再加入5mL苯甲醯苯胲溶液萃取一次，分層後與有機相合並，用三氯甲烷稀釋至刻度(稱有機相)，水相放入50mL鉑皿中(稱水相)。

分取有機相20.0mL放入50mL分液漏斗中，加入15mL3mol/LH₂SO₄，在震盪機上反萃取10min，分層後有機相進入鉑坩堝中。水相用5mL苯甲醯苯胲溶液萃洗3min，放置分層後，有機相合並於鉑坩堝中。用紅外燈蒸發除去有機溶劑後，放入低溫灰化爐中由低溫升至600℃，灼燒5min，取出，放冷。以少許水洗堝壁，加1mLHF、0.5mL(1+1)HClO₄蒸發冒煙至剩下約0.1mL溶液，取下坩堝再加入10滴(1+1)H₂SO₄，繼續蒸發至剩下約0.1mL溶液。加入10mL100g/L酒石酸溶液，加蓋加熱溶解。冷卻後轉入25mL容量瓶中，用9mL60g/L酒石酸溶液洗坩堝數次，用水稀釋至刻度，搖勻。此溶液為60g/L酒石酸溶液(B)。

(2)鈮的測定

移取部分溶液(B)，使五氧化二鈮量不大於70μg，放於50mL容量瓶中，不足5mL時，用60g/L酒石酸溶液補足。加入1滴對硝基酚，用50g/LNaOH溶液滴至黃色，再用(1+2)HCl調至黃色褪去，加入0.5mL0.025mol/LEDTA、12.5mL4mol/LHCl、2mL1g/LPAR溶液，用水稀釋至刻度，搖勻。1h後，用1cm比色皿，於波長540nm處測量吸光度。

校準曲線0～70μgNb₂O₅。

(3)鉭的測定

移取部分溶液(B)使五氧化二鉭量在20μg以下，放於25mL無硼比色管中，不足5mL時，用60g/L酒石酸溶液補足，加入9mL含25g/L草酸銨的(1+1)H₂SO₄溶液，冷卻後加入2mL1g/L丁基羅丹明B溶液，搖勻。加5mL苯，用塑料吸管加入2mL60g/LKF溶液，在震盪機上搖動30s，放置5min後，立即吸取苯層，放入預先准確加入1mL乙醇的乾燥的10mL比色管中，控制體積在5mL。混勻後，用0.5cm比色皿，於波長570nm處測量吸光度。

校準曲線0～20μgTa₂O₅。

將BPHA的三氯甲烷溶液萃取鈮、鉭、鋯、鈦、鐵、鎢之後的水相，置於50mL鉑皿中，在紅外燈下蒸發至干。再放入高溫爐中由低溫逐漸升至550℃灼燒10min。殘渣用5mL(1+1)HCl溫熱溶解(必要時可加入1～2滴過氧化氫)。溶液轉入50mL容量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻。此溶液為(5+95)HCl溶液(C)。

(4)釷的測定

分取5.0mL溶液(C)，置於50mL分液漏斗中，放入1滴1g/L2，4-間硝基苯酚指示劑，用(1+1)氨水調至黃色。加入2.8mL(1+1)HCl，用水稀釋至10mL，加入10mL0.1mol/LPMBP-苯，在震盪機上萃取5min，放置分層後，水相放入另一分液漏斗，再用5mL0.1mol/LPMBP-苯萃取一次。水相保留，有機相合並。有機相中加入2mL1mol/LHCl萃洗一次，萃洗液與水相合並。

含有釷的有機相加入10mL6mol/LHCl，在震盪機上反萃取5min，放置分層後，水相放入50mL燒杯中。有機相再用5mL6mol/LHCl反萃取一次，水相合並後，在電熱板上蒸發至近干，加入2mLHNO₃、1mLHClO₄，破壞有機物。殘渣溶於水中，用(1+1)氨水中和到對硝基酚指示劑變色後，加入10mL(1+1)HCl，轉入25mL比色管中。加入1mL1g/L偶氮胂Ⅲ溶液，用水稀釋至刻度，搖勻。用1cm比色皿，於波長665nm處測量吸光度。

校準曲線0～30μgThO₂。

(5)稀土元素總量的測定

在萃取釷以後的水相中，加入2mL200g/L磺基水楊酸溶液、2mL20g/L抗壞血酸溶液，用(1+1)氨水調節到溴甲酚綠指示劑變為藍綠色，加入3mL緩沖溶液(pH5.5)，用15mL0.01mol/LPMBP-苯在震盪機上萃取3min。放置分層後，水相放入另一分液漏斗中，用5mL0.01mol/LPMBP-苯再萃取一次。有機相合並，加入2mL緩沖溶液(pH5.5)萃洗1min，棄去水相。

含有稀土元素和鈾的有機相，加入0.3mL乙醯丙酮溶液(穩定鈾)，搖勻。用15mL!(CHOOH)=0.4%(pH2.6)在振盪機上反萃取2min。放置分層後，水相放入50mL容量瓶中(低量稀土元素可直接放入比色管)。有機相再加入0.2mL乙醯丙酮溶液，再用5mL!(CHOOH)=0.4%反萃取一次。水相合並，用!(CHOOH)=0.4%稀釋至刻度。分取部分溶液(含稀土元素氧化物不超過30μg)，置於25mL比色管中，加入1mL1g/L偶氮胂Ⅲ溶液，用!(CHOOH)=0.4%稀釋到刻度，搖勻。用1cm比色皿，於波長650nm處測量吸光度。

校準曲線0～30μgRE₂O₃(根據單礦物中稀土元素類似組成比例配製)。

(6)鈾的測定

甲酸(pH2.6)反萃取稀土元素以後的有機相加入10mL1mol/LHCl溶液。在震盪機上反萃取2min。放置分層後，水相放入25mL容量瓶(低量鈾可直接放入25mL比色管)中。有機相用5mL1mol/LHCl再反萃取一次。水相合並，並以1mol/LHCl稀釋至刻度，搖勻。分取部分溶液，含鈾量不超過30μg，放入25mL比色管中，用1mol/LHCl補足15mL，加入0.5mL1g/L偶氮氯膦Ⅲ溶液，用水稀釋至刻度，搖勻。用1cm比色皿，於波長655nm處測量吸光度。

校準曲線0～30μgU。

(7)鈣、鎂、錳的測定

移取10.0mL溶液(C)置於10mL乾燥比色管中，准確加入2mL氯化鍶溶液，搖勻，此溶液酸度約為!(HCl)=4%，分別在波長422.7nm、285.2nm、279.5nm處，用空氣-乙炔火焰原子吸收光譜法測定鈣、鎂、錳。

(8)鋁的測定

移取5.0mL溶液(C)置於25mL比色管中，加1滴1g/L對硝基酚，用80g/LNaOH溶液調至黃色，立即用(1+9)HCl調至無色，加2mL3mol/L乙酸(掩蔽釷、稀土元素和鈾的影響)，用水稀釋到10mL，搖勻。加1mL10g/L抗壞血酸溶液，搖勻。沿比色管壁准確加入0.5mL1g/L鉻天青S溶液，小心搖勻。加入5mL0.5mol/L六次甲基四胺，用水稀釋至刻度，搖勻。放置10min，用1cm比色皿，於波長568nm處測量吸光度。

校準曲線0～12μgAl₂O₃。

(9)鉛的測定

在溶液(C)中，直接用原子吸收光譜法在波長283.3nm處，空氣-乙炔火焰測定。

校準曲線0～6μgPb。

(10)鈦的測定

移取2.0mL溶液(A)(含二氧化鈦不大於50μg，含有草酸可掩蔽鈮、鉭、鎢)置於50mL容量瓶中，加5mL50g/L抗壞血酸、2滴80g/LCuCl₂、5mL(1+1)HCl，加水至約35mL。加10mL25g/L二安替比林甲烷溶液，水稀釋至刻度，搖勻。放置40min後，用2cm比色皿，於波長420nm處測量吸光度。

校準曲線0～50μgTiO₂。

(11)全鐵的測定

移取5.0mL溶液(A)置於50mL容量瓶中，水稀釋至20mL左右。加4mL8mol/LNaOH溶液、3mL100g/L檸檬酸銨、1滴對硝基酚指示劑，用(1+1)HCl調至無色，加2mL100g/L鹽酸羥銨，2mL2g/L1，10-鄰二氮菲溶液，5mL3mol/L六次甲基四胺溶液，水稀釋至刻度，搖勻。1h後，用3cm比色皿，於波長510nm處測量吸光度。

校準曲線0～35μgFe₂O₃。

(12)鎢的測定

移取5.0mL溶液(A)於25mL比色管中，加入5mL混合液、1.5mL硫氰酸鉀溶液，用20g/LSnCl₂-(1+3)HCl溶液稀釋至刻度，搖勻。待硫氰酸鐵的顏色消失，加1滴三氯化鈦溶液，15min後，用3cm比色皿，在波長405nm處測量吸光度。

校準曲線0～20μgWO₃。

(13)亞鐵的測定

稱取1～5mg(精確至0.01mg)試樣，放入50mL聚乙烯瓶中，加1～2滴水潤濕，蓋好內層蓋，卡緊外層帽，使內外層蓋的小孔重合。將接氮氣管的塑料尖嘴插入小孔中，送氣2～3min，排盡瓶內空氣。從另一小孔中加入1mLH₂SO₄，1mLHF。當見到酸蒸汽外溢時，拉開塑料尖嘴。迅速旋轉外層帽，錯開內外層蓋的小孔，使成封閉狀態。將瓶傾斜放入沸水中，不時加以搖動。經25～30min後取出，在冷水中強冷0.5min，旋轉外層帽使內外層蓋小孔重合，迅即加入10mL混合溶液(50mL50g/L硼酸溶液、30mL100g/L檸檬酸銨溶液、20mL2g/L1，10-鄰二氮菲溶液，混合均勻)，搖勻，加入20mL3mol/L六次甲基四胺溶液。轉移溶液到50mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。用1cm比色皿，以水為參比，於波長510nm處測量吸光度。

校準曲線0～300μgFeO。

(14)氟的測定

稱取2mg(精確至0.01mg)試樣於銀坩堝中，Na₂O₂熔融。於pH8～9與氫氧化物分離後在二苯胍存在下萃取氟-鑭-茜素配位劑三元配合物後用光度法測定。

校準曲線0.1～4μgF。

(15)硅、鋇的測定

稱取5mg(精確至0.01mg)試樣，在石墨坩堝中，用Na₂O₂-NaOH熔融。硅鉬藍光度法測定硅、無火焰原子吸收光譜法測定鋇。

校準曲線5～60μgSiO₂;0.05～0.4μgBa。

(16)二氧化碳、結晶水

稱取2mg(精確至0.01mg)試樣，氣相色譜法或電量法測定。

70.4.5.2 離子交換分離-微量分析法

2～3mg試樣用氟化氫鉀熔融，然後分別用陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂進行分離富集後測定鈮、鉭等9個組分。其分析流程見圖70.19。

圖70.19 黑稀金礦、易解石和褐釔鈮礦單礦物離子交換分離-微量分析法分析流程圖

試劑

陽離子交換樹脂柱強酸1×18，H⁺型，100～200目，0.8cm×10cm，流速4～5滴/min。每次使用前，均用25mL40g/L草酸銨溶液及20mL3.0mol/LHCl再生，最後用10mL1.0mol/LHCl平衡。

陰離子交換樹脂柱強鹼201×8，F^-型，100～200目，0.8cm×10cm，流速4～5滴/min。每次使用前，均用25mL2.0mol/LNH₄Cl-1.0mol/LNH₄F溶液及20mL1.0mol/LHF再生。交換柱用有機玻棒加工製成，上端裝塑料漏斗。

分析步驟

稱取2～3mg(精確至0.001mg)試樣放入小的鉑坩堝中，加入0.1gKHF₂，於750～850℃熔5～10min，取出，冷卻。加入3mLHF，低溫加熱蒸至近干。加入1mLHF，低溫加熱片刻，加入3mL水，保溫30min，放置1h以上，用預先以(1+2)HCl和!(HF)=15%溶液洗滌過的緻密定量濾紙過濾。用!(HF)=15%洗滌鉑坩堝及沉澱，總體積約40mL。濾液及洗液用塑料杯承接;沉澱連同濾紙移入原鉑坩堝中，置於高溫爐中，慢慢升溫至550℃並保持30min，使濾紙灰化完全，取出，冷卻。沿壁滴加1mLHClO₄，加熱至冒白煙。用水沖洗內壁，繼續加熱至冒白煙，取下，加入2mL1.25mol/LHCl、1滴H₂O₂，溫熱片刻，取下冷卻。傾入陽離子樹脂交換柱中，水洗鉑坩堝壁。然後依次用120mL1.25mol/LHCl淋洗鈣;30mL3.0mol/LHCl淋洗稀土;45mL40g/L草酸銨溶液淋洗釷。

氟化物沉澱過濾後所得溶液，移入鉑皿中，低溫加熱蒸發至近干，取下，沿壁加入0.5mLHF、10mL水，溫熱片刻，取下，冷卻。溶液傾入陰離子樹脂交換柱，用少量1.0mol/LHF洗鉑皿。然後用45mL1.0mol/LHF淋洗鐵和錳;50mL8.0mol/LHCl-0.002mol/LHF淋洗鈦;45mL6.0mol/LHCl-0.06mol/LHF淋洗鈮;30mL0.1mol/LHCl-0.06mol/LHF淋洗鈾。最後用5mL2.0mol/LNH₄Cl-1.0mol/LNH₄F溶液淋洗鉭。

(1)鈣的測定

將1.25mol/LHCl流出液置於電熱板上，低溫加熱蒸發至小體積，用原子吸收光譜法測定。

(2)稀土總量的測定

將3.0mol/LHCl流出液置於電熱板上，低溫加熱蒸發至小體積，移入25mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，分取部分溶液，用偶氮胂Ⅲ光度法測定。

(3)釷的測定

將40g/L草酸銨流出液移入50mL容量瓶中，用水稀釋至刻度。分取部分溶液，用偶氮胂Ⅲ光度法測定。

(4)鐵和錳的測定

將1.0mol/LHF流出液移入鉑皿中，加入1mL(1+1)H₂SO₄，加熱至冒白煙，冷卻，用水洗皿壁，再加熱至白煙冒完，轉換成!(HCl)=2%的介質，用原子吸收光譜法測定。

(5)鈦的測定

將8.0mol/LHCl-0.002mol/LHF流出液移入鉑皿中，加1mL(1+1)H₂SO₄，加熱至冒白煙，取下，冷卻，用水洗皿壁，再加熱至冒白煙，用二安替比林甲烷或過氧化氫光度法測定。

(6)鈮的測定

將6.0mol/LHCl-0.06mol/LHF流出液移入50mL容量瓶中並以該溶液稀釋至刻度。分取部分溶液用PAR或硫氰酸鹽萃取光度法測定。

(7)鈾的測定

將1.0mol/LHCl-0.06mol/LHF流出液移入50mL容量瓶中，用水稀釋至刻度。分取部分溶液用偶氮胂Ⅲ-二苯胍萃取光度法測定。

(8)鉭的測定

將2.0mol/LNH₄Cl-1.0mol/LNH₄F流出液移入50mL容量瓶中，用上述溶液稀釋至刻度。分取部分溶液，用蘇木色精-溴化十六烷基吡啶光度法測定。

注意事項

1.25mol/LHCl和3.0mol/LHCl均應標定。

❼ 生物鹼常用的提取方法

摘要：利用生物鹼鹽能夠交換到強酸型陽離子交換樹脂柱上，一般要採用強酸型陽離子交換樹脂從氫氧化鈉溶液中提取，再用鹽酸洗下來。同時強酸型陽離子交換樹脂也得到再生。

生物鹼的提取：
由於各種生物鹼的結構不同，性質各異，提取分離方法也不盡相同，主要是根據生物鹼的溶解度而定。生物鹼大都能溶於氯仿、甲醇、乙醇等有機溶劑，除季銨鹼和一些分子量較低或含極性基團較多的生物鹼外，一般均不溶或難溶於水，而生物鹼與酸結合成鹽時則易溶於水和醇。基於這種特性，可用不同的溶劑將生物鹼從中葯中提出，常用的提取溶劑有下列3種：
（1） 非極性溶劑：樣品先用10%氫氧化銨溶液濕潤，使中草葯中與酸結合成鹽的生物鹼呈游離狀態，然後用氯仿或乙醚等提取，一些與酸結合比較穩定的生物鹼鹽類和鞣酸鹽或鹼性較強的生物鹼鹽等，氫氧化銨不能將其完全分解，可用碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈣或氧化鎂，甚至氫氧化鈉鹼化，這個方法的缺點是不能提出水溶性生物鹼。
（2） 極性溶劑：極性較大的生物鹼可用中性甲醇、乙醇、酸性甲醇、乙醇、酸水（常用0.1%～1%鹽酸、硫酸、乙酸、酒石酸等）以及緩沖液等進行提取，該方法較簡便，但提出的雜質較多，需進一步凈化。
（3） 混合溶劑：用不同極性的溶劑按不同比例混合，可以較好地進行提取，如麥角用氯仿：甲醇：氫氧化銨（90:9:1），百部、粉防已用乙醚：氯仿：乙醇：10%氫氧化銨溶液（25:8:25:1）等。
水溶性生物鹼還可採用與生物鹼沉澱試劑如雷氏鹽（硫氰化鉻銨）、磷鎢酸等生成不溶的復鹽而從水溶液中析出。生物鹼與雷氏鹽生成的沉澱可溶於丙酮，再通過陽離子交換樹脂，用氫氧化銨洗脫即得游離的生物鹼，生物鹼與磷鎢酸生成的沉澱可與固體碳酸鉀研磨使乾燥，再用無水乙醇熱提。
實際上，每種分析法的建立都要對上述三類溶劑作比較，以優選出最佳提取溶劑。
生物鹼的提取方法，常用的有冷浸、滲漉、超聲波、索氏提取、熱迴流提取，由於中葯分析所涉及到的大部分內容是有機化合物微量分析，故需要的樣品量很少，因此，實際上是少量樣品與大量提取溶劑，加上樣品又經粉碎過篩，常常冷浸提取液中被測組分濃度與提取液中粉碎的樣品內所含被測組分相當，即能提取完全。為了使提取更完全，也常常對上述方法進行組合如冷浸-滲漉，冷浸-超聲波，冷浸-索氏提取，冷浸-熱迴流提取，因冷浸、冷浸-超聲波提取操作簡便，故使用較多，必要時，要對上述方法作比較，以優選出最佳提取方法。
分離：
1.凈化
上述方法得到的總生物鹼中常含有大量雜質，在分離之前一般需凈化。凈化的方法常依據提取方法及含有的雜質而定。
·水或酸水提取液的凈化
1. 離子交換樹脂法
提取液
│
│通過強酸型（氫型）陽離子交換樹脂
┌——————┴———————————┐
↓ ↓
流出液 樹脂柱
（非鹼性物質） ┌——————┴———————————┐
│方法一 │方法二
│氨液鹼化樹脂 │鹼液洗脫
│晾乾後，親脂性有機溶劑提取 │
↓ ↓
親脂性總生物鹼 親水性總生物鹼
2. 有機溶劑萃取法
提取液
│
│鹼化，親脂性有機溶劑萃取
┌——————┴———————————┐
↓ ↓
有機溶劑層 鹼水層
│
│濃縮
↓
總生物鹼

·醇類溶劑提取液的凈化
醇提取液
│
↓濃縮
浸膏
│
│酸水溶解
┌——————┴———————————┐
↓ ↓
不溶物 酸水液
（非鹼性脂溶性雜質） │
│鹼化，親脂性有機溶劑萃取
┌———┴———┐
↓ ↓
有機溶劑層 水層
│
│濃縮
↓
總生物鹼
2.將生物鹼粗分為弱鹼性生物鹼、中強鹼性和強鹼性生物鹼、水溶性生物鹼三部分，再根據結構中是否有酸性基團（主要指酚羥基），分為酚性和非酚性兩類。
3.生物鹼單體的分離
·利用生物鹼鹼性的差異進行分離
即在不同PH條件下進行分離——pH梯度法，有兩種操作：
1. 方法1
總生物鹼 / 酸水溶解
│
│用鹼調節PH由低到高
│每調一次用氯仿萃取一次
┌————┬———┴———┬—————┐
↓ ↓ ↓ ↓
氯仿液 氯仿液 氯仿液 氯仿液

PH值： 低 —————————————————→ 高

得到的生物鹼鹼度： 弱 —————————————————→ 強

2. 方法2
總生物鹼 / 氯仿溶解
│
│用不同pH緩沖酸溶液依次萃取
┌————┬———┴———┬—————┐
↓ ↓ ↓ ↓
緩沖液 緩沖液 緩沖液 緩沖液

PH值： 高 —————————————————→ 低

得到的生物鹼鹼度： 強 —————————————————→ 弱
得到的緩沖液加鹼鹼化，用有機溶劑萃取，回收溶劑，即得到不同鹼度的生物鹼。採用pH梯度法分離前，通常先用多緩沖紙色譜法對總鹼中各生物鹼的鹼度強弱作初步了解，據此調節pH值。
·利用生物鹼或生物鹼鹽溶解度的差異進行分離
生物鹼以及生物鹼鹽在不同溶液的溶解度可能存在明顯的差異，可用於分離。
如：氧化苦參鹼是苦參鹼的氮氧化物，極性稍大，不溶於乙醚。而苦參鹼溶於乙醚，於兩者的氯仿液中加入乙醚，氧化苦參鹼即可析出。
如：麻黃鹼草酸鹽在水中的溶解度比偽麻黃鹼草酸鹽的溶解度小，可以自水溶液中先行析出。
· 利用生物鹼特殊功能基不同進行分離
┌ 有無酚羥基——利用酚羥基可溶於NaOH溶液，用NaOH溶液處理與無酚羥基者分離。
│
例如 ┤ 有無內酯或內醯胺結構——利用內酯、內醯胺在苛性鹼溶液中加熱可開環生成溶於水
│ 的羧酸鹽，與無內酯、內醯胺結構的生物鹼分離。
│
└ 制備功能基衍生物——利用仲胺可與亞硝酸生成亞硝基衍生物，或與氯乙醯或氯甲酸
乙酯生成相應的酯等，與叔胺分離。
· 利用色譜法進行分離
利用色譜法可以得到生物鹼單體純品。
┌ 吸附色譜法 ┌ 氧化鋁
│ │
多用 ┤ 反相色譜法 吸附劑 ┤ 硅膠
│ │
└ 分配色譜法 └ 纖維素

┌吸附色譜法可用苯、氯仿、乙醚等有機溶劑。
洗脫劑┤
└分配色譜法可用緩沖液飽和的有機液。