lgg離子交換柱層析

⑴ 單克隆抗體的純化技術操作步驟

從培養液或腹腔積液獲得的單克隆抗體，不需要純化即可應用於日常診斷或定性研究。如果用於免疫標記測定，須分離和純化。可用半飽和、飽和硫酸銨進行沉澱，進行初步濃縮和純化；可用親和層析法進一步純化。

一、腹水型單抗的純化

在單抗純化之前，一般均需對腹水進行預處理，目的是為了進一步除去細胞及其殘渣、小顆粒物質、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者處理效果為佳，而且操作簡便。

1、二氧化硅吸附法

新鮮採集的腹水（或凍存的腹水），2000r/min 15分鍾，除去細胞成分（或凍存過程中形成的固體物質）等；取上層清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥緩沖鹽水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀釋；然後以每10ml稀釋腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鍾，不時搖動；2000g離心20分鍾，脂質等通過該法除去，即可得澄清的腹水。

2、過濾離心法

用微孔濾膜過濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用10000g 15分鍾高速離心（4℃）除去細胞殘渣及小顆粒物質。

3、混合法

即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附處理。

二、單抗的粗提

1、硫酸銨沉澱法

（1）飽和硫酸銨溶液的配製

500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過夜，析出的結晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/L NaOH調PH至7.8。

（2）鹽析

吸取10ml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5.0ml；繼續緩慢攪拌30分鍾；10000r/min離心15分鍾；棄去上清液，沉澱物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30分鍾，同法離心；重復前一步1-2次；沉澱物溶於1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl緩沖液中。

（3）脫鹽

常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過Sephadex G-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每分鍾1ml。第一個蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋於2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分鍾，用蒸餾水清洗透析袋內外表面，再用蒸餾水煮透析袋10分鍾，冷至室溫即可使用（並可於0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存備用）。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50-100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析（4℃）12-24小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑（碘化汞11.5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50ml，待溶解後，再加20% NaOH 50ml）檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。

（4）蛋白質含量的測定

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋倍數；或（Pr）=OD280×稀釋倍數/1.3

（5）分裝凍存備用

2、辛酸-硫酸銨沉澱法

該法簡單易行，適合於提純IgG1和IgG2b，但對IgG3和IgA的回收率及純化效果差。其主要步驟如下：取1份預處理過的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸緩沖液，用1mol/L HCl調PH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，於30分鍾內加完，4℃靜置2小時，取出15000g離心30分鍾，棄沉澱；上清經尼龍篩過濾（125um），加入1/10體積的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH調PH至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45%飽和度，作用30分鍾，靜置1小時；10000g離心30分鍾，棄上清；沉澱溶於適量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，對50-100倍體積的PBS透析，4℃過夜，其間換水3次以上；取出10000g離心30分鍾，除去不溶性沉渣，測定蛋白質含量後，分裝，凍存備用。

3、優球蛋白沉澱法

該法適用於IgG3和IgM型單抗的提取，所獲製品的抗體活性幾乎保持不變，對IgG3單抗的回收率高於90%，對IgM單抗的回收率為40-90%不等。其操作步驟如下：取一定量的預處理過的腹水，先後加入NaCl和CaCl2，使各自的濃度分別達0.2mol/L和25mmol/L，隨之可見纖維蛋白的產生；經濾紙過濾後，濾液對100倍體積的去離子水透析，4℃ 8-15小時（若是IgG3單抗，也可室溫2小時），其間換水1-2次；取出後22000g離心30分鍾，棄上清；將沉澱溶於PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重復上述的透析與離心；將沉澱的優球蛋白濃度調至5-10mg/ml，分裝凍存備用。

三、單抗純化的方法

單抗純化的方法有很多種，應根據具體單抗的特性和實驗條件選擇適宜的方法，常用的技術有DEAE離子交換層析柱、凝膠過濾法和親和層析法三種。

1、離子交換層析：

分離蛋白質是根據在一定pH 條件下，蛋白質所帶電荷不同而進行的分離方法。常用於蛋白質分離的離子交換劑有弱酸型的羧甲基纖維素(CM纖維素) 和弱鹼型的二乙基氨基乙基纖維素(DEAE纖維素)。前者為陽離子交換劑，後者為陰離子交換劑。

離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來

2、凝膠過濾法：

一定型號的凝膠網孔大小一定，只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內部，大分子則被排阻在外。洗脫時，大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小，小分子則在顆粒網狀結構中穿來穿去，歷程長，後洗脫下來，洗脫體積大。

缺點：從凝膠過濾的原理可知，蛋白質分子通過凝膠柱的速度(即洗脫體積的大小)並不直接取決於分子的質量，而是它的斯篤克半徑，利用凝膠過濾法測定蛋白質分子量時，標准蛋白質(已知分子量和斯篤克半徑)和待測蛋白質必須具有相同的分子形狀(接近球體)，否則不能得到比較准確的分子量。分子形狀為線形的或與凝膠能發生吸附作用的蛋白質，則不能用此方法測定分子量。而且柱子成本比較高，整個實驗過程耗時很長。

3、免疫親和層析法：

是利用生物體內存在的抗原、抗體之間高度特異性的親和力進行分離的方法。親和層析的應用主要是生物大分子的分離、純化。利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進行分離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結合於親和層析基質上，就可以從血清中分離其對應的抗體。在蛋白質工程菌發酵液中所需蛋白質的濃度通常較低。

用離子交換、凝膠過濾等方法都難於進行分離，而親和層析法則是一種非常有效的方法。將所需蛋白質作為抗原，經動物免疫後制備抗體，將抗體與適當基質偶聯形成親和吸附劑，就可以對發酵液中的所需蛋白質進行分離純化。

⑵ 層析為幾大類各自的特點和用途是什麼

親和層析介質
Ni-瓊脂糖凝膠 FF 主要用於分離組氨酸標記（His-Tag）的基因工程蛋白質的分離純化。

谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 FF 主要用於谷胱甘肽轉移酶標記蛋白（GST融合蛋白）、谷胱甘肽轉移酶和谷胱甘肽依賴蛋白的分離純化。
辛巴藍-瓊脂糖凝膠 FF 主要用於各種以NADH或NADPH做輔酶的酶類（如脫氫酶）、血清白蛋白、干擾素、凝血酶、凝血因子等蛋白質和多肽的分離純化。
肝素-瓊脂糖凝膠 FF 主要用於抗凝血酶Ⅲ、凝血因子、脂蛋白、脂酶和多糖的分離純化。
蛋白A-瓊脂糖凝膠 FF 主要用於各種抗體、單克隆抗體的親和分離純化。
刀豆蛋白A-瓊脂糖凝膠 FF 主要用於各種糖、糖蛋白、糖脂和帶甘露糖、葡萄糖殘基的IgM等的分離純化。
小麥凝集素-瓊脂糖凝膠 FF 主要用於各種糖、糖蛋白、糖脂、帶N-乙醯葡糖胺殘基的各種蛋白等的分離純化。
巰基乙醇-瓊脂糖凝膠 FF 主要用於抗體等具有親硫作用的蛋白質的分離純化。
IgG-瓊脂糖凝膠 FF 適用於純化蛋白A、蛋白G等和抗體結合的蛋白、蛋白A和蛋白G融合蛋白。
賴氨酸-瓊脂糖凝膠 FF 適用於纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白酶原激活劑及核糖蛋白體核酸的分離純化。
組氨酸-瓊脂糖凝膠 FF 適用於抗體等富含共軛氨基酸殘基的蛋白質、多肽的分離純化。
DNA-瓊脂糖凝膠 FF 適用於與DNA相結合的DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA酶、核酸外切酶等的分離純化。
去內毒素瓊脂糖凝膠 FF 適用於葯物劑型中細菌內毒素的去除。
Ni-陶瓷/瓊脂糖凝膠 主要用於分離組氨酸標記（His-Tag）的基因工程蛋白質的分離純化。
谷胱甘肽-陶瓷/瓊脂糖凝膠 主要用於谷胱甘肽轉移酶標記蛋白（GST融合蛋白）、谷胱甘肽轉移酶和谷胱甘肽依賴蛋白的分離純化。
辛巴藍-陶瓷/瓊脂糖凝膠 主要用於各種以NADH或NADPH做輔酶的酶類（如脫氫酶）、血清白蛋白、干擾素、凝血酶、凝血因子等蛋白質和多肽的分離純化。
肝素-陶瓷/瓊脂糖凝膠 主要用於抗凝血酶Ⅲ、凝血因子、脂蛋白、脂酶和多糖的分離純化。
蛋白A-陶瓷/瓊脂糖凝膠 主要用於各種抗體、單克隆抗體的親和分離純化。
刀豆蛋白A-陶瓷/瓊脂糖凝膠 主要用於各種糖、糖蛋白、糖脂和帶甘露糖、葡萄糖殘基的IgM等的分離純化。
小麥凝集素-陶瓷/瓊脂糖凝膠 主要用於各種糖、糖蛋白、糖脂、帶N-乙醯葡糖胺殘基的各種蛋白等的分離純化。
巰基乙醇-陶瓷/瓊脂糖凝膠 主要適用於抗體等具有親硫作用的蛋白質的分離純化。
IgG-陶瓷瓊脂糖凝膠 適用於純化蛋白A、蛋白G等和抗體結合的蛋白、蛋白A和蛋白G融合蛋白。
賴氨酸-陶瓷/瓊脂糖凝膠 適用於纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白酶原激活劑及核糖蛋白體核酸的分離純化。
組氨酸-陶瓷/瓊脂糖凝膠 適用於抗體等富含共軛氨基酸殘基的蛋白質、多肽的分離純化。
DNA-陶瓷/瓊脂糖凝膠 適用於與DNA相結合的DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA酶、核酸外切酶等的分離純化。
去內毒素陶瓷/瓊脂糖凝膠 適用於葯物劑型中細菌內毒素的去除。