運用離子交換法分離純化溶菌酶的優缺點

❶ 蛋白質的分離方法有哪些它們各依據蛋白質的什麼性質或特點

（一）水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1、pH值
蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH
范圍內。用稀酸或稀鹼提取時，應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液。
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。
（二）有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內（度為10%，40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用於動植物及微生物材料。
二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。
其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex
ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT
FACE="宋體"
LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity
chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。
細胞的破碎
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等。
2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物臟器組織。
3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震盪破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應採取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。
4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可採用溶菌酶處理效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於目的物質的提取。
濃縮、乾燥及保存
一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2、空氣流動蒸發濃縮
空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
3、冰凍法
生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
4、吸收法
通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
5、超濾法
超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo
超濾膜的分子量截留值：
膜名稱分子量截留值孔的大的平均直徑
XM－300300，000140
XM－200100，00055
XM－5050，00030
PM－30 30，00022
UM－2020，00018
PM－1010，00015
UM－21，00012
UM05500 10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。
二、乾燥
生物大分子制備得到產品，為防止變質，易於保存，常需要乾燥處理，最常用的方法是冷凍乾燥和真空乾燥。真空乾燥適用於不耐高溫，易於氧化物質的乾燥和保存，整個裝置包括乾燥器、冷凝器及真空乾燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時一般先將待乾燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然後在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干後的產品具有疏鬆、溶解度好、保持天然結構等優點，適用於各類生物大分子的乾燥保存。
三、貯存
生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系。乾燥的製品一般比較穩定，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將乾燥的樣品置於乾燥器內（內裝有乾燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態貯藏時應注意以下幾點。
1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。
2、一般需加入防腐劑和穩定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標准緩沖液中。
3、貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應視不同物質而定。

❷ 離子交換樹脂到底是什麼技術幹嘛用的 請詳解

離子交換樹脂是一種傳統的水處理工藝，其中水中的各種陰離子和陽離子被陰回離子交換樹脂和答陽離子交換樹脂所取代。
陰離子和陽離子交換樹脂可以分別或按不同比例形成離子交換正床系統、離子交換負床系統和離子交換混合床系統，並且通常使用混合床系統。
反滲透等水處理工藝是用來生產超純水、高純水的終端工藝，它是用來制備超純水的一種不可替代的手段。其出水電導率可低於0.2μS/cm以下，出水電阻率達到5MΩ.cm以上，根據不同的水質及使用要求，出水電阻率可控制在5~18MΩ.cm之間。
被廣泛應用在食品行業、醫葯行業、工業超純水、醫葯超純水、高純水等領域上。

❸ 生化葯物制備過程中需要注意哪幾個方面

國內在生化葯物的研究方面存在較多的問題，主要表現在以下幾個方面：1、對原材料沒有進行嚴格的控制;2、無病毒滅活的工藝步驟;3、質量研究內容不夠全面等。致使審評人員難以把握其質量，且產生了更多的安全性擔憂。
一、生化葯物的制備方法生化制葯就是將動物、植物或微生物機體內的生物活性物質在其結構和功能不遭破壞的前提下，採用多種生化分離的方法提取、純化的工藝過程。生化制葯的六個階段：1、原料的選擇和預處理;2、組織及細胞的破碎;3、從破碎的細胞中提取有效成分製成粗品;4、採用多種生化技術從粗品中將目的物精製出來;5、乾燥及保存;6、制劑。以上各階段在不同的生化葯物制備中，根據所選材料的不同，可靈活取捨選擇使用。
生化葯物的分離純化方法主要有五類：1、根據分子大小和形狀不同進行分離，如凝膠過濾法、透析和超濾法、密度梯度離心法等;2、根據分子的帶電性質進行分離，如離子交換層析法、電泳法、等電聚焦法;3、根據分子極性大小及溶解度不同進行分離，如等電點沉澱法、鹽析法、有機溶劑沉澱法、逆流分配法等;4、根據配體特異性進行分離，如親和層析法;5、根據物質吸附性質不同進行分離，如選擇性吸附和吸附層析法。
二、生化葯物質量控制研究要點生化葯物復雜多樣，在此僅針對臟器提取的多組分生化葯物進行討論，其它生化葯物可參考。
(一)、臟器生化葯物臟器生化葯是指從動物來源的生化葯物，即從動物的組織、器官、腺體、體液、分泌物以及胎盤、毛、皮、角和蹄甲等提取的葯物。臟器生化葯物中多數有效成分不明確，多屬高分子物質，現在多數還不能用合成的方法生產，有的物質還需要有同時存在的其它物質的協同作用才能發揮較好的生理功能。主要的臟器生化葯物1、
組織和器官來源大腦：膽固醇、腦磷脂、卵磷脂、P-物質和多種腦啡肽等;丘腦：生長激素釋放因子和生長激素抑制因子等;心臟和動脈管：細胞色素C、輔酶Q10和輔酶A等;肝臟：核糖核酸、肝注射液、肝提取物、肝水解物和輔酶A等;肺臟：抑肽酶等;脾臟：脾注射液、肝-脾提取物和脫氧核苷酸鈉注射液等;胃：胃膜素和胃蛋白酶等;腸及腸粘膜：P-物質、肝素和其它肝素(低分子肝素)等;眼：眼生素和眼寧等全眼提取物;骨：硫酸軟骨素、硫酸軟骨素A、骨肽注射液和蛋白腖等;皮：明膠和阿膠等;2、
腺體來源腦垂體：促皮質素、促卵泡激素、促黃體生成激素、生長激素、促乳激素、催產素、加壓素和垂體前葉激素等;胰腺：胰島素、胰高血糖素、胰蛋白酶、糜蛋白酶、結晶糜胰蛋白酶、胰酶、蛋白酶抑制劑、激肽釋放酶(血管舒緩素)、彈性酶(彈性蛋白酶)、膠原酶、胰類肝素等;唾液腺：唾液腺素等;頜下腺：激肽釋放酶等;腮腺：腮腺素等;甲狀腺：降鈣素、甲狀腺素和乾燥甲狀腺提取物等;胸腺：胸腺素(胸腺肽)、胸腺生成素Ⅰ、Ⅱ和胸腺體液因子等;腎上腺：腎上腺皮質激素等;甲狀旁腺：甲狀旁腺素等;卵巢：鬆弛肽和子宮鬆弛因子等;睾丸：透明質酸酶等;松果體：松果體激素等;3、
體液和分泌物來源血液：組氨酸、賴氨酸、精氨酸和水解蛋白等;膽汁：人工牛黃、去氫膽酸、鵝去氧膽酸、膽酸鈉、膽黃素等;尿：尿激酶和絨毛膜激素等;4、
其他來源胎盤：胎盤提取物、胎盤球蛋白和白蛋白等;毛：胱氨酸、半胱氨酸、賴氨酸和精氨酸等;角和蹄甲：羚羊角、犀角代用品和婦樂寧等;蛋：溶菌酶等。
(二)、臟器生化葯物的研究和質量控制要點因動物的來源復雜(包括動物的種屬、健康狀況、飼養環境、年齡、採集時間、採集方法等)，提取純化工藝簡單，其有效成分的含量和比例會產生較大的差異，因此，單靠質量標准不能全面控制產品的質量，而需要控制源頭和工藝過程，再結合質量標准才能較有效地控制產品的質量，確保臨床應用的安全性和有效性。換句話說，生化葯物的質量控制重點就是要保證生產產品與臨床研究樣品質量一致，這種質量的一致性單憑質量標准中的質量控制指標不能全面地反映出來(這一點不同於化學葯物)，必須通過嚴格地控制源頭和工藝過程來實現，這一點類似於生物製品。1、臟器生化葯物研究的一般過程研究臟器生化葯物首先要固定源頭(原材料)，包括動物的種屬、健康狀況、飼養環境(封閉飼養)、年齡、採集時間和採集方法等，並制訂原材料的質量標准。然後研究合適的提取純化方法，包括動物源性病毒的滅活和驗證，確定原液(或半成品)的生產工藝;研究原液(或半成品)中的主要成分、含量、主成分的比例，以及其它成分的控制方法等，制訂原液(或半成品)的質量標准。進行制劑的處方工藝研究，最後製成臨床應用的制劑(成品)，並進行相應的質量研究，制訂成品的質量標准。2、動物源性病毒的滅活工藝及驗證因組織來源動物的種類不同，其自然攜帶或者感染病毒的種類也會有所不同，再加上目前動物來源的原材料可控性較差，故必須要對動物源性病毒進行滅活或去除，並對滅活或去除工藝進行驗證。滅活或去除動物源性病毒，首先要了解選定動物的病毒情況，重點關注已確認對人類具有感染和致病能力的病毒(例如牛和豬的口蹄疫病毒，豬的乙型腦炎病毒等)及已有試驗提示與人類疾病具有關聯性的病毒(例如牛腹瀉病毒，豬的戊肝病毒等)，了解病毒的生物學和對理化因素敏感性等方面的特性。檢驗原材料中病毒的污染程度和負載量，為採取相應的處理工藝提供研究數據。如果已知原材料中污染了對人感染或者致病的病毒，或者檢出了內源性逆轉錄病毒、具有種屬特異性的其它污染病毒，則必須廢棄該原材料並妥善處理。(1)病毒的檢測方法病毒的檢測方法主要有體外法(採用不同種屬的多種敏感細胞系進行共培養檢測，在適宜的培養時間點取樣檢測感染性病毒，至少應盲傳3代)、體內法(在沒有可靠的體外試驗方法時，可採用適宜的動物進行接種盲傳試驗，採用敏感的方法檢測感染性病毒)、動物抗體產生試驗(對尚沒有合適的體內和體外試驗方法檢測的病毒，可採用不同動物觀察種特異病毒的抗體產生情況，抗體產生試驗特別有助於檢出嚙齒類動物病毒)、其他方法(電鏡、ELISA、PCR、RT方法等)。病毒的檢測方法應結合品種的特點和具體生產情況，綜合分析後進行設計和選擇，通常應有合理的依據和支持性資料。(2)病毒滅活/去除工藝盡量設計與實際生產工藝相關的及合理的病毒滅活/去除研究試驗方案，尤其是特定的生產工藝步驟，模擬的工藝在試驗參數及控制條件方面應與實際工藝嚴格保持一致。也就是說模擬的生產工藝應當盡可能代表實際生產工藝的情況;如果產生了不可避免的偏差，應對試驗結果可能產生的影響給予合理的解釋。有關病毒滅活/去除的技術方法，可參見《血液製品病毒去除/滅活病毒技術方法及驗證指導原則》。(3)病毒滅活/去除工藝驗證研究病毒滅活/去除工藝驗證研究的目的是要獲取充足的試驗研究數據，以證明生產工藝中包含有效的病毒滅活/去除工藝步驟。其基本原則是生產工藝必須包含有效的病毒滅活/去除工藝步驟，若生產工藝無有效的滅活/去除病毒的作用，應根據產品的不同，在生產工藝過程中增加特定的病毒滅活/去除步驟。對臟器生化葯物應包含兩種機制上能夠互補的有效工藝步驟。經過多年的實踐，已經獲得普遍認可的作法是將已知量的指示用活病毒，加入到模擬的原液或者不同生產工藝階段的中間產品中，然後定量測定經特定工藝步驟或技術方法處理後病毒滴度下降的幅度，據此評價工藝滅活/去除病毒的效果。一般驗證採用普通指示病毒，試驗結果用於說明工藝步驟對一般病毒的滅活/去除能力，在適宜的范圍內能夠代表對同類病毒相似的清除能力;特定驗證採用特定病毒(已發現的污染病毒)或者與特定病毒相似的病毒作為替代，試驗結果用於說明工藝步驟對特定病毒的滅活/去除能力，生產工藝必須具有足夠的清除該病毒的能力。因為特定病毒與一般病毒在理化因素敏感性、病毒結構特點、病毒顆粒大小及其它方面有差異，因此，普通指示病毒與特定病毒或特定病毒相似的病毒不具備可比性和一致性，難以互相替代。(4)指示病毒的選擇指示病毒選擇的原則：指示病毒應具有代表性和合理性，可用於正確評價生產工藝的病毒安全性。選擇指示病毒應考慮的幾個方面：1)根據生產過程中污染病毒的來源、污染環節和程度、致病性質和特點，以及其它應考慮的各種實際因素，同時結合能夠用於評價驗證效果的指示病毒的可獲得性與相關培養試驗條件，盡可能地選擇具有一般代表性和特定模擬意義的多種指示病毒。2)盡可能選擇可培養到高滴度的病毒;並應有可靠、有效的檢測方法。3)應當考慮指示病毒可能對操作人員形成的健康危害，並採取必要的防護措施;必須注意指示病毒本身的安全性，應遵守國家有關的管理規定，屬於烈性傳染病毒不能使用。4)在選擇普通指示病毒或/和特定指示病毒時，至少都應當包括RNA和DNA病毒、脂包膜和非脂包膜病毒。5)以生物組織原材料或組織原材料勻漿中可能出現的病毒為核心，綜合考慮生產工藝、污染病毒及滅活/去除技術方法本身等各方面的特點進行選擇。(5)病毒滅活/去除有效工藝步驟的評價首先要有病毒滅活/去除驗證的試驗資料，並證實在生產工藝過程中某特定步驟能夠有效地滅活/去除病毒。對於可能起作用的每個步驟都應進行必要的評價，明確是否具有確切的病毒滅活/去除作用，並確定有效的工藝步驟。在有效的病毒滅活/去除工藝步驟後，不得進行可能引入新污染(如添加動物來源的材料)的操作(除非證明該操作完全排除病毒污染的可能性)，嚴格防止再污染的發生。一般將病毒感染性滴度減少4log以上的處理步驟認可為有效的病毒滅活/去除工藝步驟。但如果檢測方法的最低檢測限為103TCID50，即使病毒起始滴度為106TCID50，經處理後未檢出病毒，也不宜算作特定的有效工藝步驟，因為處理後病毒的實際滴度有可能大於102TCID50，因此只能根據檢測方法的靈敏度表示為未檢出。病毒感染量的降低可以從病毒顆粒清除的量或病毒被滅活的情況兩方面來評價。可能的情況下，應明確病毒滴度的下降是物理清除還是直接滅活。(6)病毒安全性的追蹤觀察由於檢測方法、監測時間及靈敏性等各種因素的影響，臨床前研究中即使動物試驗，甚至是靈長類動物試驗結果為陰性，也難以完全排除人類感染潛在污染病毒的風險(如潛伏期長的病毒、致病過程緩慢的病毒、感染特異性檢測指標未知的病毒等)。因為不同階段，人們對病毒危害的認識深入程度和全面性等不同，可提供的試驗研究支持性資料及側重點也有所不同;所以對動物來源的生化葯物，不論是在臨床研究的過程中，還是上市後均應進行必要的病毒安全性追蹤觀察。具體方法：針對可能污染的病毒，注意觀察並設立病毒感染的評價指標。包括已知對原材料來源動物有致病性的病毒，在體內、體外試驗中能夠感染人類組織細胞的病毒，特別是隱性感染的病毒等;通過血清學或培養分離等臨床檢測，發現和驗證在生產過程中未能發現的新病毒及感染特徵。採用的檢測方法應能夠鑒別出人與動物病毒的區別，並經過驗證確保方法的敏感性和特異性。在臨床研究方案中應有對可疑致病病毒的檢測實施方案，包括：急性感染、慢性感染、常規篩查臨床隱性感染和血清陽轉情況，以及用葯前後檢測結果的對比。通過主動檢測和被動檢測及時發現無症狀隱性感染患者，避免在人群中可能發生的大規模播散。由於許多未知的和不確定因素的存在，最終確定污染病毒的致病性仍需要進行大量的基礎研究和臨床驗證工作，因此，使用動物來源產品的患者，應該知道：經過病毒安全性控制的產品，雖然已經將感染病毒的風險減小到極低的程度，但並不能完全排除這種風險。3、臟器生化葯物的質量控制要點根據臟器生化葯物研究的一般過程，其質量控制要點主要分以下三個方面：1)固定源頭(原材料)，包括動物的種屬、健康狀況、飼養環境(封閉飼養)、年齡、採集時間和採集方法等，並制訂原材料的質量標准。2)研究合適的提取純化方法，包括動物源性病毒的滅活和驗證，確定原液(或半成品)的生產工藝;研究原液(或半成品)中的主要成分、含量、主成分的比例，以及其它成分的控制方法等，制訂原液(或半成品)的質量標准。3)進行制劑的處方工藝研究，製成臨床應用的制劑(成品)，並進行相應的質量研究，制訂成品的質量標准。總之，臟器生化葯物質量控制的核心就是全程式控制制(從源頭到終產品，工藝過程式控制制和質量標准控制)。
三、生化葯物研究應注意的問題因生化葯物的來源復雜，不同的原材料和生產工藝得到的產品的質量會有差異，包括主要成分的含量、比例，以及其它成分的種類和/或含量等，而這些差異往往質量標准反映不出來，從嚴格意義上說，生化葯物沒有仿製。所以，在進行生化葯物研究時首先要基於「不可仿製」來考慮問題。1、注重原材料和工藝過程式控制制，結合質量標准，較全面地控制產品的質量。2、產品上市後不要輕易更換原材料、變更生產工藝、改換劑型(尤其是水針、粉針、大輸液互換)、延長有效期等。如果需要進行以上變更，應針對變更情況對產品的質量、安全性和有效性的影響(這種影響是指產品的真實質量，並不只是質量標准中的質量控制指標)進行相應的研究工作，包括葯學、葯理毒理和臨床研究。3、因為生化葯物的質量是靠全程式控制制來保證，其原液(或半成品)應不可以自由銷售，否則不僅增大了流通環節再次染菌的可能性，又不利於成品全程的質量控制。4、動物源性病毒的滅活工藝及驗證是一個需要研發者、審評人員，以及有關方面的專家共同研究和探討的課題。因為人們對動物源性病毒的認識，以及動物源性病毒與人類感染性疾病的關系的認識是在逐步地深入，對病毒的滅活和工藝驗證也會隨著人們認識的提高而不斷地趨於更科學和合理。以上簡要介紹了生化葯物的一般制備方法、工藝過程和質量研究，以及在研究過程中應注意的問題，目的是使研發者進一步了解生化葯物的特性和質量控制要點，在進行生化葯物研究時重視源頭控制和工藝過程式控制制，建立生化葯物全程式控制制的理念，尤其是在產品上市後，如果補充申請進行某些變更時，需要針對變更對產品的質量、安全性和有效性的影響進行相應的葯學、葯理毒理和臨床研究.

❹ 怎樣分離純化酶

這是一門很深的學問，除了需要高科技還需要科研專用設備，只是簡介，希望對你有幫助，不要上當受騙：

酶的分離純化方法簡介
生物細胞產生的酶有兩類：一類由細胞內產生後分泌到細胞外進行作用的酶，稱為細胞外酶。這類酶大都是水解酶，如酶法生產葡萄糖所用的兩種澱粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發酵過程中分泌的。這類酶一般含量較高，容易得到；另一類酶在細胞內產生後並不分泌到細胞外，而在細胞內起催化作用，稱為細胞內酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發酵生產所進行的一系列化學反應，就是在多種酶催化下在細胞內進行的，在類酶在細胞內往往與細胞結構結合，有一定的分布區域，催化的反應具有一定的順序性，使許多反應能有條不紊地進行。
酶的來源多為生物細胞。生物細胞內產生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別很大。
因此，在提取某一種酶時，首先應當根據需要，選擇含此酶最豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、澱粉酶和脂酶的好材料。由於從動物內臟或植物果實中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業上大多採用培養微生物的方法來獲得大量的酶制劑。從微生物中來生產酶制劑的優點有很多，既不受氣候地理條件限制，而且動植物體內酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產酶量又豐富，還可以通過選育菌種來提高產量，用廉價原料可以大量生產。
由於在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質以及其他雜質，因此為製取某酶制劑時，必須經過分純化的手續。
酶是具有催化活性的蛋白質，蛋白質很容易變性，所以在酶的提純過程中應避免用強酸強鹼，保持在較低的溫度下操作。在提純的過程中通過測定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在分離提純過程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標，在整個酶的分離純化過程中的每一步驟，始終要測定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經過某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取捨。

酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質，然後再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質，然後製成純化的酶制劑。下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹：
一、預處理及固液分離技術
1.細胞破碎（cell disruption）
高壓均質器法：此法可用於破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑麴黴菌。將細胞懸浮液在高壓下通入一個孔徑可調的排放孔中，菌體從高壓環境轉到低壓環境，細胞就容易破碎。菌懸液一次通過均質器的細胞破碎率在12%-67%。細胞破碎率與細胞的種類有關。要達到90%以上的細胞破碎率，起碼要將菌懸液通過均質器兩次。最好是提高操作壓力，減少操作次數。但有人報道，當操作壓力達到175Mpa時，破碎率可達100%。當壓力超過70Mpa時，細胞破碎率上升較為緩慢。高壓均質器的閥門是影響細胞破碎率的重要因素。絲狀菌會堵塞均質器的閥門，尤其高濃度菌體時更是如此。在豐富培養基上比在合成培養基上生長的大腸菌更難破碎。
容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價格便宜，常用來裂解細胞。具體做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置於0.5%的氯化鈉溶液中，使細胞濃度為5%（乾重），在35℃用0.68kg（乾重）的蛋清處理20min，得到的細胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機將細胞碎片和胞內蛋白質除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分數），可以得到純度為5%的過氧化氫酶1500g。
2.離心
離心分離過程可分為離心過濾、離心沉澱、離心分離3種類型，所使用的設備有過濾式離心機、沉降式離心機和離心機。過濾式離心機的轉鼓壁上開有小孔，壁上有過濾介質，一般可用於處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場合。沉降式離心機用於分離固體濃度較低的固液分離，如發酵液中的菌體，用鹽析法或有機溶劑處理過的蛋白質等。分離機用於分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。
在生物領域採用的離心機系統，除了應具備離心機的一般要求外，還應滿足生物生產的技術要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產品不受污染並不污染環境。現代哦離心機裝置包括以下三個步驟，並進行程序控制：離心、離心系統的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機產品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉筒主軸上下的碳化硅動環和固定環組成，密封由水連續冷卻和潤滑，可防止產品被污染，也可防止生產過程中排出的廢物對環境的污染。該離心機又如一個密閉的壓力容器，可在121℃溫度下進行蒸汽滅菌，該離心設備設有環繞離心機轉筒的冷卻夾套，對懸浮液和濃縮的固體都能進行充分的冷卻，並能有效地控制溫度，這對於生物製品是非常重要的。如BTPX205型離心機可用於細胞收集、培養液的凈化和細胞碎片的分離，可用於疫苗、酶制劑等的提取。該機的其他輔助系統及控制系統也較為完善，如設有壓力指示器、力量計、溫度感測器和液面感測器。
3.膜分離技術
在蛋白質純化過程中主要用到的膜分離技術多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過孔徑非常小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質透過薄膜，而大分子被截留於膜表面。大多數超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結合在一起而組成的。功能膜決定了膜的孔徑，而支撐膜提供機械強度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優點是：操作條件溫和，無相變化，對生物活性物質沒有破壞。
超濾系統主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過液收集罐組成，料液經泵打入超濾器，水及低分子量物質排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環。當料液濃縮至一定的倍數後即可作為進一步處理的濃縮料液。
超濾應用於蛋白質類物質的濃縮和脫鹽過程中時應注意以下問題：第一，在超濾循環過程中，由於泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的溫度會逐漸升高，會造成蛋白質分子的損失。因此，料液貯罐應加冷卻系統，並安裝自動測溫及控制系統。第二，某些酶的輔助因子散失為問題：一些酶含有輔助因子，其分子量小，超濾時易從透過液中排除掉，因而在超濾前或超濾後要添加一定濃度的的輔助因子。
還可將超濾與親和層析相結合以提高分離純度。其工作原理是：當溶液中欲被分離的蛋白質不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時，如果在膜的一側結合著親和配基，該蛋白質就會與配基結合因而結聚在膜的這一側。不與配基結合的其他物質就將穿過孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質洗脫下來，洗脫液用於進一步的分離純化。
4.泡沫分離
原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由於這些組分的表面活性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩定性取決於操作條件及溶液的生物學特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分離。
蛋白質較易吸附與氣液界面，這有利於其結構的穩定。泡沫分離過程是：蛋白質從主體溶液中擴散到氣液界面，該過程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發生重排，一般認為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會發生由多個分子聚集在一起的現象。在氣液界面形成的蛋白質膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類型取決於主體溶液及氣液界面上蛋白質的特性、結構和濃度。
泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質的濃度/最初溶液中蛋白質濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質的提取率/最初的蛋白質質量），或使多組分混合物中某一組分的分配系數最大。

二、抽提
沉澱
1. 鹽析
常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價格便宜。硫酸銨沉澱蛋白質的能力很強，其飽和溶液能使大多數的蛋白質沉澱下來。對酶沒有破壞作用。
pH的控制：應從酶的溶解度與穩定性兩個方面考慮，在酶等電點時其溶解度最小易沉澱，但有些酶再等電點時穩定性較差，因此要選擇最佳pH值.一般要求在酶最穩定的pH值的前提下再考慮最適宜酶沉澱的pH值。在操作中一旦確定最佳pH值後，在添加硫酸銨之前甲酸或鹼調節好酶液的pH值，要盡量避免溶液pH值的波動以免破壞酶的穩定性。在添加硫酸銨時要注意攪拌，並注意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細粉。
溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩定性能較好，可在常溫下進行鹽析操作，而對於大多數酶，盡可能在低溫下操作。
酶液的凈置：加完硫酸銨後，酶液要靜置一段時間，使酶蛋白完全沉澱下來，酶靜置後，就不要再加以攪拌。
2．有機溶劑沉澱
有機溶劑選擇：可用於酶蛋白沉澱的有機溶劑包括醇類物質等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。
有機溶劑沉澱操作：有機溶劑一般都使蛋白質變性，當溫度較高時變性蛋白質分子就會變成永久失活。因此用有機溶劑處理時最好在0℃以下進行。用有機溶劑沉澱得到的酶蛋白不要放置過久，要盡快加水溶解。
3.聚合物絮凝劑沉澱
聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭奪水分子，具有脫水作用使酶沉澱。聚乙二醇作為一種沉澱劑的優點是在水溶液中，其濃度可達到50%，濃度為6%-12%的蛋白質大都可以沉澱下來。這種試劑不需要低溫操作，而且對蛋白質的穩定還有一定的保護作用。聚乙二醇不會被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。
4．用金屬離子和絡合物沉澱
酶和其他蛋白質都會形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉澱的缺點是酶與金屬離子相互作用後，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結合的]金屬離子會催化酶變性而失活。
5．用特殊試劑沉澱法
用鏈黴素可選擇性去除核酸，從而使胞內酶沉澱出來。鏈黴素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質）對於選擇性沉澱核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活。
6．親和沉澱
將親和反應的高度選擇性、低處理量特性與沉澱操作的大處理量、地選擇性有機結合形成了親和沉澱技術。將配基與可溶性載體偶聯後形成載體-配基復合物，該復合物與生物分子結合後在一定條件下可以沉澱出來。
配基-載體復合物可以選擇性地與蛋白質結合，溶液中的pH值、離子強度及蛋白質濃度等條件對親和結合的影響力並不大，只有競爭性的配基會降低產物與原配基的親和結合力，甚至使親和結合發生逆轉。
引導產生沉澱的方法有：離子交聯；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷的疏水基團；改變pH值，誘導產生疏水沉澱；溫度誘導產生沉澱。
親和結合：將親和配基加入到含有目的物蛋白質的溶液中，調節好有關沉澱的條件，使之有利於親和結合。
洗滌：為經過處理的粗製液中發生親和沉澱可能會發生非特異性結合，尤其是使用帶電的聚合物，離子交換的效應將使其他蛋白質共同沉澱，因此在分離目的物之前要洗滌沉澱物。其做法是：加入適當的清洗劑重新溶解沉澱，再沉澱；或在專一性洗脫之前，徹底清洗沉澱。在上述過程中要始終保持目的蛋白質與配基處於親和結合狀態。
配基-載體復合物與目的蛋白質的分離：分離結束之後，要確保回收目的蛋白質和配基-載體復合物，目的蛋白質要達到一定的純度，回收率要高。

❺ 酶、細胞、原生質體固定化

酶的一些不足之處：
（1）酶的穩定性較差
（2）酶的一次性使用
（3）產物的分離純化較困難
◆改善方法之一就是固定化技術的應用:
(1)固定化酶是指固定在一定載體上並在一定的空間范圍內進行催化反應的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有增加穩定性，可反復或連續使用以及易於和反應產物分開等顯著優點。
(2)固定化細胞是指固定在載體上並在一定的空間范圍內進行生命活動的細胞。也稱為固定化活細胞或固定化增值細胞。通常只能用於胞外酶等胞外產物的生產。
(3) 固定化原生質體技術，有利於胞內物質的分泌。
1. 酶固定化
◆採用各種方法，將酶與水不溶性的載體結合，制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定在載體上並在一定的空間范圍內進行催化反應的酶稱為固定化酶。
◆固定在載體上的菌體或菌體碎片稱為固定化菌體，它是固定化酶的一種形式。
1.1酶的固定化方法
固定化的方法：吸附法、包埋法、結合法、交聯法和熱處理法等。
(1)吸附法：
◆利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法稱為物理吸附法，簡稱吸附法。
◆物理吸附法常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。
◆靠物理吸附作用，結合力較弱，酶與載體結合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。
(2)包埋法
◆將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。
◆包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯醯胺、光交聯樹脂、聚醯胺、火棉膠等。
◆包埋法制備固定化酶或固定化菌體時，根據載體材料和方法的不同，可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法兩大類。
◇凝膠包埋法：凝膠包埋法是將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內部的微孔中，製成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體。大多數為球狀或片狀，也可按需要製成其他形狀。
常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯醯胺凝膠、光交聯樹脂等合成凝膠。
◇半透膜包埋法：半透膜包埋法是將酶包埋在由各種高分子聚合物製成的小球內，製成固定化酶。
常用於制備固定化酶的半透膜有聚醯胺膜、火棉膠膜等。
(3)結合法
◆選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法稱為結合法。
◆根據酶與載體結合的化學鍵不同，結合法可分為離子鍵結合法和共價鍵結合法。
◇離子鍵結合法：通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法稱為離子鍵結合法。
離子鍵結合法所使用的載體是某些不溶於水的離子交換劑。常用的有DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。
◇共價鍵結合法：通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法稱為共價鍵結合法。
共價鍵結合法所採用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。
酶分子中可以形成共價鍵的基團主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。
◇要使載體與酶形成共價鍵，必須首先使載體活化，即藉助於某種方法，在載體上引進一活潑基團。然後此活潑基團再與酶分子上的某一基團反應，形成共價鍵。
◇使載體活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。
(4)交聯法
◆藉助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯作用，製成網狀結構的固定化酶的方法稱為交聯法。交聯法也可用於含酶菌體或菌體碎片的固定化。
◆常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應用最廣泛的是戊二醛。
(5)熱處理法
◆將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在菌體內，而制備得到固定化菌體。◆熱處理法只適用於那些熱穩定性較好的酶的固定化，在加熱處理時，要嚴格控制好加熱溫度和時間，以免引起酶的變性失活。
1.2固定化酶的特性
(1)穩定性:固定化酶的穩定性一般比游離酶的穩定性好。
(2)最適溫度: 固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。
(3)最適pH值: 酶經過固定化後，其作用的最適pH值往往會發生一些變化。
◆影響固定化酶最適pH值的因素主要有兩個，一個是載體的帶電性質，另一個是酶催化反應產物的性質。
(4)底物特異性: 固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關系。對於那些作用於低分子底物的酶，固定化前後的底物特異性沒有明顯變化。
◆固定化酶底物特異性的改變，是由於載體的空間位阻作用引起的。
1.3固定化酶的應用
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有如下顯著的優點：
（1）酶的穩定性增加，減少溫度、pH值、有機溶劑和其他外界因素對酶的活力的影響，可以較長期地保持較高的酶活力。
（2）固定化酶可反復使用或連續使用較長時間，提高酶的利用價值，降低生產成本。
（3）固定化酶易於和反應產物分開，有利於產物的分離純化，從而提高產品質量。
固定化酶已廣泛地應用於食品、輕工、醫葯、化工、分析、環保、能源和科學研究等領域。

2.細胞固定化
◆通過各種方法將細胞與水不溶性的載體結合，制備固定化細胞的過程稱為細胞固定化。(固定化活細胞或固定化增殖細胞)
◆微生物細胞、植物細胞和動物細胞都可以製成固定化細胞。
2.1細胞固定化的方法
◆主要可分為吸附法和包埋法兩大類方法。
(1)吸附法
◆利用各種固體吸附劑，將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法。
◆用於細胞固定化的吸附劑主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金屬絲網、微載體和中空纖維等。
(2) 包埋法
◆將細胞包埋在多孔載體內部而製成固定化細胞的方法稱為包埋法。
◆包埋法可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法。
◇以各種多孔凝膠為載體，將細胞包埋在凝膠的微孔內而使細胞固定化的方法稱為凝膠包埋法。
○凝膠包埋法是應用最廣泛的細胞固定化方法，適用於各種微生物、動物和植物細胞的固定化。
○凝膠包埋法所使用的載體主要有瓊脂、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠、聚丙烯醯胺凝膠和光交聯樹脂等。
2.2微生物細胞固定化
2.2.1固定化微生物細胞的特點：
①固定化微生物細胞保持了細胞的完整結構和天然狀態，穩定性好。
②固定化微生物細胞保持了細胞內原有的酶系、輔酶體系和代謝調控體系，可以按照原來的代謝途徑進行新陳代謝，並進行有效的代謝調節控制。
③發酵穩定性好，可以反復使用或者連續使用較長的一段時間。
④固定化微生物細胞密度提高，可以提高產率。
⑤提高工程菌的質粒穩定性，
2.2.2固定化微生物細胞的應用
◆主要用在兩個方面：
◇是利用固定化微生物細胞發酵生產各種胞外產物。
◇二是利用固定化微生物細胞與各種電極結合製成微生物電極。
(1)利用固定化微生物生產各種產物
(2)固定化微生物細胞製造微生物感測器
2.3植物細胞固定化
2.3.1固定化植物細胞的特點：
（1）植物細胞經固定化後，由於有載體的保護作用，可減輕剪切力和其他外界因素對植物細胞的影響，提高植物細胞的存活率和穩定性。
（2）細胞經固定化後，被束縛在一定的空間范圍內進行生命活動，不容易聚集成團。
（3）固定化植物細胞發酵可以簡便地在不同地培養階段更換不同的培養液，即首先在生長培養基中生長增殖，在達到一定的細胞密度後，改換成發酵培養基，以利於生產各種所需的次級代謝物。
（4）固定化植物細胞可反復使用或連續使用較長的一段時間，大大縮短生產周期，提高產率。
（5）固定化植物細胞易於與培養液分離，利於產品的分離純化，提高產品質量。
2.3.2 植物細胞固定化的方法：
◆植物細胞固定化的方法主要有吸附法和包埋法兩種。
◆吸附法是將植物細胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內，或者將植物細胞吸附在中空纖維的外壁上。
◆包埋法是將植物細胞包埋在瓊脂、角叉菜膠、海藻酸鈣凝膠、聚丙烯醯胺凝膠、明膠等多孔凝膠之中。包埋方法與微生物細胞包埋時基本相同。
2.3.3固定化植物細胞的應用：
◆固定化植物細胞的主要用途是製造人工種子，就有可能獲得大量具有相同遺傳特性的植株。對種質的保存具有重要意義。並可以節約種子的用量。
◆固定化植物細胞還可以用於生產各種色素、香精、葯物、酶等次級代謝物。
2.4動物細胞固定化
2.4.2固定化動物細胞的特點：
（1）提高細胞存活率：動物細胞經固定化後，由於有載體的保護作用，可以減輕或免受剪切力的影響，同時動物細胞可附著在載體表面生長，從而可顯著提高動物細胞的存活率。
（2）提高產率：動物細胞固定化後，可先在生長培養基中生長繁殖，使細胞在載體上形成最佳分布並達到一定的細胞密度。然後可簡便地改換成發酵培養基，控制發酵條件，使細胞從生長期轉變到生產期，以利於提高產率。
（3）固定化動物細胞可反復使用或連續使用較長的時間。例如，中國倉鼠卵巢細胞（CHO）生產人干擾素可以穩定地生產30天。
（4）固定化細胞易於與產物分開，利於產物分離純化，提高產品質量。
2.4.2動物細胞固定化方法：
◆動物細胞固定化地方法有吸附法和包埋法兩種。
(1)吸附法：
◆大多數動物細胞屬於附著細胞，它們在培養過程中，必須趨向於附著在固體表面。故此吸附法特別適合於動物細胞的固定化。
◆轉瓶是由玻璃或塑料製成，表面經過一定方法處理而帶上電荷。
◆微載體是指顆粒細小的固定化載體，直徑一般為100～200μm，相對密度接近1.0。是由帶有表面電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯或玻璃等材料製成。微載體已用於多種動物細胞的固定化；
◆中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物製成。
(2)包埋法
◆包埋固定化法一般適用於懸浮細胞。
◆根據載體和方法的不同，有凝膠包埋法、半透膜包埋法兩種。
①凝膠包埋法：利用各種多孔凝膠為載體將動物細胞固定化。細胞被固定在凝膠的微孔中生長繁殖和新陳代謝，由於有載體的保護，動物細胞有較好的穩定性，可顯著提高其存活率。
用於動物細胞固定化的凝膠載體主要有瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白等。
②半透膜包埋法：利用高分子聚合物形成的半透膜將動物細胞包埋，形成微囊型固定化動物細胞。
2.4.3固定化動物細胞的應用：
動物細胞中大部分為貼壁細胞，需要貼附在載體的表面才能正常生長。所以固定化動物細胞廣泛應用。特別是採用微載體對動物細胞進行吸附固定化。

3.原生質體固定化
◆固定化原生質體的制備主要包括原生質體的制備和原生質體固定化兩個階段。
3.1原生質體的制備
◆不同種類的細胞，由於各自細胞壁的組成、結構和性質不同，原生質體的制備方法也不一樣。
◆原生質體的制備過程是首先將對數生長期的細胞收集起來，懸浮在含有滲透壓穩定劑的高滲緩沖液中。然後加入適宜的細胞壁水解酶，在一定的條件下作用一段時間，使細胞壁破壞。分離除去細胞壁碎片、未作用的細胞以及細胞壁水解酶，而得到原生質體。
◆除去細胞壁所使用的酶應根據細胞壁的主要成分的不同而進行選擇。
◇細菌的細胞壁主要成分是肽多糖，所以細菌原生質體制備時主要採用從蛋清中得到的溶菌酶；
◇酵母細胞壁主要由β-葡聚糖構成，故採用β-1，3-葡聚糖酶；
◇黴菌的細胞壁組分比較復雜，除含有幾丁質外，還有其他多種組分，故要去除黴菌的細胞壁，則需有幾丁質酶與其他有關酶共同作用。
◇植物細胞壁由纖維素、半纖維素和果膠組成，故制備植物原生質體時主要應用纖維素酶和果膠酶。
◆為防止制備得到的原生質體破裂，應加入適當的滲透壓穩定劑。如：無機鹽、糖類、糖醇等化合物。
◆應選擇對數生長期的細胞制備原生質體，以獲得較高的原生質體形成率。
◆所加進的細胞壁溶解酶的種類和濃度、酶作用溫度，pH值以及作用時間等對原生質體的制備都有明顯影響，必須經過試驗確定其最佳條件。
3.2原生質體固定化
◆採用包埋法製成固定化原生質體。
◆原生質體固定化一般採用凝膠包埋法。常用的凝膠有：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠和光交聯樹脂等。
3.3固定化原生質體的特點：
(1)固定化原生質體由於解除了細胞壁這一擴散屏障，可增加細胞膜的通透性，有利於氧氣和營養物質的傳遞和吸收，也有利於胞內物質的分泌，可顯著提高產率。
(2)固定化原生質體由於有載體的保護作用，具有較好的操作穩定性和保存穩定性，可反復使用和連續使用較長的時間，利於連續化生產。在冰箱保存較長時間後仍能保持其生產能力。
(3)固定化原生質體易於和發酵產物分開，有利於產物的分離純化，提高產品質量。
(4)固定化原生質體發酵的培養基中需要添加滲透壓穩定劑，以保持原生質體的穩定性。這些滲透壓穩定劑在發酵結束後，可用層析或膜分離技術等方法與產物分離。
3.4固定化原生質體的應用
固定化原生質體一方面保持了細胞原有的新陳代謝特性，可以照常產生原來在細胞內產生的各種代謝產物，另一方面又去除了細胞壁這一擴散屏障，有利於胞內產物不斷地分泌到胞外，這樣就可以不經過細胞破碎和提取工藝而在發酵液中獲得所需的發酵產物，為胞內物質的工業化生產開辟了新途徑。
固定化原生質體可用於各種氨基酸、酶和生物鹼等物質的生產以及甾體轉化等。

❻ 有誰知道雞蛋提取溶菌酶的合作項目是真是假 多謝

一種用雞蛋提取溶菌酶的新工藝技術
本發明公開了一種用雞蛋提取溶菌酶的新工藝。該工藝是在現有工藝中的沉澱步驟中加入氧化鋅參與溶菌酶的沉澱，這樣就可解決多年來人們單純使用硫酸銨沉澱溶菌時，沉澱速度慢及沉澱不完全的問題，同時可提高溶菌酶的活性，通過該工藝可使溶菌酶的沉澱速度提高6－12倍。
一種分離溶菌酶的方法
本發明分離溶菌酶的方法，以雞蛋清為原料，加水適當稀釋後，攪拌均勻，加酸調pH值至4．0－5．0，靜置、過濾除去沉澱，將濾液升溫至75－80℃，冷卻至室溫，靜置不少於10小時，過濾得上清液，加鹼調pH值為7．5－8．0，加乙醇至產生白色沉澱，過濾，沖洗，乾燥即得產品；本方法工藝步驟簡、生產周期短、溶菌酶得率高；所製得的溶菌酶可用作防腐用的食品添加劑。
一種生產基因工程重組人溶菌酶的方法
一種生產基因工程重組人溶菌酶的方法，是運用分子生物學技術和基因工程技術，將人溶菌酶基因克隆入酵母菌體內進行表達，然後通過提取、純化制出人溶菌酶。本發明由於利用基因工程重組技術，發酵生產人溶菌酶，能夠較大批量生產人溶菌酶，又避免了從組織中提取易受病源污染的問題，其產品具有穩定、純凈的特點。
溶菌酶親和層析凝膠介質的制備方法
溶菌酶親和層析介質的制備方法。將殼聚糖溶於醋酸或鹽酸溶液中，再加入3－6倍體積的甲醇，過濾，於濾液中加入脂肪酸酐讓其醯化成凝膠狀，搗碎凝膠並用水將其洗至中性，用5－10％的NaOH或KOH溶液處理以脫去非N－位的脂肪醯化，再用水洗至中性，在酸性條件下用亞硝酸鹽氧化除去凝膠內未醯化的游離氨基，而後用鹼調至中性，用水洗去酸和鹽類等殘留物抽干即得所需的介質。
蘿卜溶菌酶及其制備方法
本發明是以蘿卜的根葉為原料，經勻漿浸提過濾，濾液經親和吸附，裝柱洗滌和親和洗脫、收集酶液、透析、濃縮和凍干成酶制劑。酶活力高達4－7萬U／mg。蛋白，酶的活性中心含有Trp、His、Glu和Asp殘基，殺菌譜廣，不僅對G↑〔＋〕菌有殺滅作用，對G↑〔－〕菌同樣有殺滅作用。蘿卜溶菌酶的成功提取，將為食品業、農作物的病蟲害防治上和葯醫治療上開拓了新途徑。
從鹹蛋清中提取溶菌酶方法
鹹蛋黃被廣泛應用於食品加工中，而鹹蛋（鴨蛋或雞蛋）取黃後留下的鹹蛋清因含有極高濃度的食鹽和異味限制了應用而常被廢棄。本發明經普查表明鹹蛋清中尚含有豐富的溶菌酶含量，可以作為生產溶菌酶的原料；進而採用脫氨醯化殼聚糖凝膠親和吸附法，直接從鹹蛋清中僅經一步便純化得溶菌酶，所得純化酶的比活力大於70000U／mg蛋白，回收率可達70％。
一種以溶菌酶為主要成分的外用凝膠劑及其制備方法
本發明是一種以溶菌酶為主要成分的外用凝膠劑及制備方法。該凝膠劑可以是水性凝膠，也可以是油性凝膠。根據需要配方中可以加入少量抗菌劑、抗病毒劑、抗滴蟲劑、消毒防腐劑、潤滑劑、清涼劑和芳香劑等輔助劑。適用於陰部感染的女性，更年期婦女及已婚婦女日常衛生保健，還可用於旅館、居家的浴缸、浴盆等潔具的消毒，防止性病傳播和預防交叉感染。本發明用於消炎殺菌、清潔陰道、消除瘙癢、清除異味，總有效率達81．58％。動物實驗結果表明該產品無毒、無刺激性和致敏性，對使用者衛生、安全、無害。具有預防保健效果好、使用方便、作用維持時間長、副作用小，適用范圍廣等特點，是一種安全、衛生的新型陰部保健品。
溶菌酶在奶製品中的應用
本發明提供了溶菌酶的一種新的應用領域，即溶菌酶在奶製品中的應用技術，其作法是：在溶菌酶中加入保護劑，混合均勻後成溶菌酶集合物，按常規生產工藝製作奶製品，在生產進行到最後一步－分裝工序之前，加入溶菌酶集合物，混勻後再分裝出廠，成品奶製品中溶菌酶的活性在60℃－80℃時不失活，且含量可達到人乳的水平，採用本發明應用技術生產的奶製品，其營養成份豐富，具有很好的免疫功能，可取代現有的牛乳製品喂養嬰幼兒，增強嬰幼兒的免疫、抗病能力。
一種溶菌酶蛋白生產工藝及其應用
本發明涉及一種人溶菌酶蛋白生產工藝。目前市場上的溶菌酶蛋白都來源於其他種屬動物機體，對人體而言是異種蛋白，有很強的抗原性，副作用大。本發明的生產的溶菌酶蛋白具有人源的天然氨基酸序列，解決了異源性溶菌酶用於人體內的抗原性問題。更重要的是，人體中的溶菌酶活性最高，本發明提供的蛋白生產工藝與傳統工藝相比，分離純化步驟簡單易行，能得到較高的蛋白投入產出比，為人溶菌酶蛋白的工業化生產提供了一個高效的生產工藝。本發明還涉及上述方法及其產物的應用。
人核糖核酸酶U和人溶菌酶的兩種進化酶
本發明涉及兩種人源酶的分子進化酶。本發明的進化酶分別是以人核糖核酸酶U和人溶菌酶為原料，經過基因釣取，定向進化，表達篩選等步驟，最後製得。本品具有制備工藝簡單、生產成本低、酶活力較高、穩定性好、應用價值大等優點，可獨自或聯合廣泛地應用於抗菌葯物、抗病毒葯物、抗炎症葯物、治療齲齒葯物、治療愛滋病葯物等醫葯工業各領域。
高表達、高純度、高活性基因重組人溶菌酶的生產及用途
本發明涉及一種高表達、高純度、高活性基因重組人溶菌酶的生產方法及其新用途。提供了利用提取純化的基因工程技術表達的人溶菌酶的溶菌活性，用於臨床上細菌和真菌的感染，特別是耐葯性細菌感染的治療方法，以及革蘭陰性菌感染治療後內毒素引發的後遺症的治療方法。提供了用於各種治療用途的抗生素和人溶菌酶的葯用組合物。
從雞蛋及鳥類蛋提取溶菌酶的方法
本發明的名稱是：從雞蛋及鳥類蛋提取溶菌酶的方法。屬於提取生物活性物質技術領域。本發明的目的在於：提供一種溶菌酶的提取方法，簡單、易操作。本發明採用下述步驟：獲取蛋清，加入氯化鈉溶液並攪拌；加入鹽酸溶液，水域加溫至40℃；自然冷卻至常溫，加入乙酸溶液，水域加溫至80℃；離心後過濾，在濾清夜中加入氯化鈉攪拌後再次加溫至60℃；加入丙酮，濾取白色絮狀物，自然乾燥後，碾粉並包裝。
制備溶菌酶的方法
本發明提供一種制備溶菌酶的有效方法，其特徵為使用硅藻土、高嶺土、沸石或其混合物選擇性地吸附蛋白中的溶菌酶，及隨後以離子溶液進行洗提。上述硅藻土、高嶺土及沸石對溶菌酶具有優異的選擇性吸附能力，可提高溶菌酶的純化倍數。
一種人溶菌酶系列化妝品及其制備方法
本發明涉及一種化妝品及其制備方法，特別是涉及一種人溶菌酶Humanlysozyme系列化妝品及其制備方法。人溶菌酶系列化妝品的主要成分是人溶菌酶Humanlysozyme（HLZ），其工藝過程如下：首先將人溶菌酶制備後備用，先將原料進行攪拌，均質乳化後冷卻到45度，將制備好的人溶菌酶到入，經真空脫氣攪拌至一定溫度即可。積極效果在於原料易得，工藝簡單，效果顯著，並且易於推廣應用。

家用長效除臭劑

本劑是以沸石、氯化鎂、氧化鎂和安息香酸配製成的家用長效除臭劑。一、特點：（1）除臭力強是。由於沸石和氯化鎂、氧化鎂相混合，沸石微孔結構中吸附的大氣中的水分，能被氧化鎂和氯化鎂吸附，因而使沸石微孔結構的孔隙得到再生，使沸石的除臭能力牧師以充分發揮；再加氯化鎂和氧化鎂也都有除臭功能，故作為整體，除臭力強是。（2）有效除臭期長。沸石與氯化鎂、氧化鎂相配合，使氧化鎂包覆於氯化鎂的外部表面，從而使氯化鎂的吸濕能力得到適當抑制，使氯化鎂不致因為吸濕過多而潮解。因此，三者得以長期發揮作用，使有效除臭期大幅度延長。（3）除臭性能穩定。本劑中加有安息香酸，可以防止除臭劑因吸附臭氣和水分而受到損害。可保持性能穩定、長期使用效果好。（4）原料價廉易得。二、用途：可用於廁所、居室、病房、鞋箱等除臭。編號35189

L—抗壞血酸—硫酸亞鐵多效除臭劑

除臭劑種類雖多。但各有不足。例如，覆蓋型除臭劑，只能將臭覆蓋掩蔽，不能除去，因而往往要殘留異臭；吸附型除臭劑，因吸附容量所限，屆時吸附能力必然降低或喪失；酸鹼中和型除臭劑，除臭范圍只限於能夠同酸鹼相結合的物質；含枸櫞酸和順丁烯二酸類的除臭劑，不能除去硫醇類臭氣等。本劑是以L-抗壞血酸和硫酸亞鐵為有效成分配製而成，不存在上述缺點，是能夠除去各種惡臭的多效除臭劑。一、特點：（1）原料易得，價格低廉，製造容易，使用方便。（2）本劑中含有的L-抗壞血酸，可使硫酸亞鐵經常維持活性狀態，使之與氨、胺臭中的胺形成絡合物，與含硫惡臭中的硫生成（鐵-硫）鍵，故對於氨類惡臭和含硫惡臭均能有效除去，除臭范圍廣的。（3）性能穩定，即使長期暴露於空氣中或潮濕條件下，除臭效果也無變化。（4）原料都是公認的可食性物質，即使同食品接觸，也可以確保安全。（5）可以製成各種形態。使用於各個領域。二、用途：用於廁所、垃圾箱、冷庫、冰箱等的除臭，均有良好效果。特別是用於除去氨類、硫醇類的惡臭，效果尤佳。用本劑的液體除臭劑浸漬紙、布等，製成除臭片或除臭紙，直接包裹魚、肉等食品，貯放於冰箱、冷庫、防止其臭味向其他食品轉移和串味，或用於去除冰箱、冷庫的異味，也有良好效果。編號35191

人體消臭劑

為消除來自人體的惡臭--腋臭、汗臭、腳臭、頭發臭、生理臭等，使用的消臭劑，大多是由作為抑汗劑使用的具有收斂作用的羥基氯化鋁、殺菌劑六氯酚，或各種季銨化合物及掩蔽劑丁子香酚等，單獨或經任意組配製成。然而，這些消臭劑的使用效果並不能完全令人滿意。例如，抑汗劑，從生理學看，並不能完全抑制發汗；殺菌劑，因安全性問題，並不能以有效的足夠的濃度添加；掩蔽劑同汗臭摻合在一起，又會產生惡臭等等。因而不能得到滿意結果。本劑是以合成樹脂和金屬氧化物製成的復合粉體為消臭活性物質，再根據需要加入各種添加劑配製而成，用於消除人體惡臭，取得了比較滿意的結果。一、特點：（1）消除人體惡臭，效果好。（2）使用安全，對人體無害。（3）可以製成各種劑型，例如氣溶膠、粉劑、膏劑、棒狀等劑型，使用方便。二、用途：適用於消除來自人體的腋臭、汗臭、腳臭、頭發臭、生理臭等各種惡臭。編號35198

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❽ 酶的分離和純化方法是什麼

酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結晶或制劑。

首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質，然後再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質，然後製成純化的酶制劑。

酶分離純化的最終目的是獲得單一純凈的酶，因此，容許在不破壞「目的酶」的限度內，使用各種手段;酶與底物和抑制劑的結合常使其理化性質和穩定性發生改變，這種特性已被用於酶的分離純化。

由於酶及其來源的多樣性及與之共存的高分子物質的復雜性，目前還很難找到一種通用的方法以適用於一切酶的純化。為了使一種酶達到高度純化，往往需要多種方法協同作用，通過酶活性的跟蹤檢測確定最佳流程。

(8)運用離子交換法分離純化溶菌酶的優缺點擴展閱讀：

酶的本性是蛋白質，凡可用於蛋白質分離純化的方法都同樣適用於酶，但酶易失活，故分離純化需在低溫(4℃)、溫和pH(4<pH>10)等條件下進行。

與蛋白質類似，酶易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，因此操作中應盡量減少泡沫形成，此外重金屬易使酶失效，有機溶劑能使酶變性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞。

在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過程稱是分離純化。

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