超濾純化dna

1. 如何純化pcr產物或粗提的dna

DNA純化的步驟是：

1.2-25倍100%的酒精冰箱中先預冷，降溫後再加入DNA中；

2.低溫，冰中反應5min至更長時間；

3.低溫，離心；

4.加70%乙醇清洗兩遍；

5.加TE溶解DNA.

2. 質粒DNA提取和細胞基因組DNA提取的異同

不同點

一、提取方法不同

DNA提取主要是CTAB方法，其他的方法還有物理方式如玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法。化學方式如異硫氰酸胍法、鹼裂解法。生物方式：酶法。

質粒抽提方法即去除RNA，將質粒與細菌基因組DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒。

二、提取原理不同

質粒DNA提取用到三種溶液以及硅酸纖維膜（超濾柱）。 溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA，pH 8.0；溶液Ⅱ：0.2 N NaOH / 1%SDS； 溶液Ⅲ：3 M 醋酸鉀/ 2 M 醋酸/75%酒精。

細胞基因組DNA提取

保證核酸一級結構的完整性；核酸樣品中不應存在對酶有抑製作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度；其他核酸分子，如RNA，也應盡量去除。

三、提取復雜程度不同

質粒DNA提取一般用沸水浴法和鹼裂解法，它主要是將細胞內的環狀質粒提取出來，一般需要用SDS裂解，RNA酶降解，然後過柱，再進行洗脫.過程比較簡單。

而基因組DNA提取則較為復雜，也需要用SDS裂解和RND酶降解，但降解時間較長，同時對有些革蘭氏陽性細菌還要進行溶菌酶處理，最後用氯仿-苯酚進行除蛋白，這一步重復進行多次，在用氯仿除去多餘的苯酚，用乙醇清洗烘乾後溶於TE緩沖液中。整個過程比提質粒更復雜，耗時也更長。

相同點

都是去除RNA、除蛋白質及其它雜質。

3. 分子生物學中應該知道的那些事兒（二）

主要內容：

一、硅基質離心柱制備DNA和RNA的工作原理

1. 裂解

裂解方法可能會根據需要DNA或RNA而有所不同，但其共同點是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。

雜化使氫鍵不穩定，范德華力和疏水相互作用。蛋白質不穩定，包括核酸酶，核酸與水的結合被破壞，為核酸與硅機制結合創造條件。

離液鹽包括鹽酸胍、異硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。

除了離液鹽，裂解緩沖液通常還含有洗滌劑，有助於蛋白質的溶解和裂解。

根據樣品類型，也可以使用酶進行裂解。蛋白酶k就是其中之一，實際上蛋白酶k在裂解緩沖液中起著非常好的作用；蛋白酶k的作用就越好，蛋白質變性越完全。然而，溶菌酶在裂解緩沖液的變性條件下不起作用，因此，通常在加入變性鹽之前進行溶菌酶處理。

對於質粒的制備，裂解方式與提取RNA或基因組DNA有很大不同，因為必須先從基因組DNA中分離出質粒。

如果加入離液鹽，將立即釋放胞內物質，並且無法從高分子量染色體中區分出小的環狀質粒。

因此，在質粒制備中，直到裂解後，才加入離液鹽，並用於結合硅基質。

2. 結合硅基質（Binding）

離液鹽對裂解和硅基質的結合至關重要。

為了增強核酸與硅基質的結合，在結合階段還加入了乙醇。通常是乙醇，但有時可能是異丙醇。

乙醇的濃度和體積對結合有很大影響，濃度或體積太多會帶來大量降解的核酸和小片段，進而影響UV260的讀數，使核酸濃度降低。濃度或體積太少，可能很難洗掉膜上的殘留鹽。

重要的一點是，乙醇會影響結合，並且添加的量對於任何試劑盒都是優化的。修改該步驟有助於獲得核酸提取的效果，因此如果遇到問題並希望排除原因，則可以進一步評估該步驟。

另一種問題的診斷方法，保留離心後過柱濾液，並進行沉澱操作，看是否有核酸。如果在裂解過程中使用SDS的表面活性劑，試著用NaCl作為沉澱劑，以避免污染DNA或RNA。

3. 洗滌步驟

裂解液通過硅膠膜離心，現在DNA或RNA與柱結合，雜質，蛋白質和多糖則通過。

但是，膜仍然會被殘留的蛋白質和鹽弄臟。如果樣本來自植物，膜上仍會殘留多糖，可能還有一些色素，或者如果樣本是血液，膜可能呈棕色或黃色。

清洗步驟有助於去除這些雜質。通常有兩種清洗方式，但因樣本類型而異。第一次洗滌通常會用少量的離液鹽來去除蛋白質和有色污染物。然後用乙醇清洗以除去鹽。如果樣本本身沒有太多蛋白質，如質粒准備或PCR產物純化，那麼只需要乙醇清洗即可。

4. 離心柱的乾燥

乙醇洗滌後，大多數操作步驟都有離心來乾燥離心柱。這是為了去除乙醇，是清潔洗脫的必要步驟。當10mM Tris緩沖液或水填充到膜上進行洗脫時，核酸會水合並從膜上釋放。如果柱上還有乙醇，那麼核酸就不能完全再水化。

跳過乾燥步驟會導致乙醇污染和核酸產量降低。

這個問題的主要跡象是當試圖把樣品載入到瓊脂糖凝膠上時，即使在存在染料的情況下，DNA不會下沉，而是漂浮在緩沖液中。乙醇污染的另一個跡象是，如果你把樣品放在-20攝氏度，它不會結冰。

5. 洗脫

最後一步是從硅基質中釋放出純DNA或RNA。對於DNA的處理，通常使用pH值在8-9之間的10 mM Tris。DNA在稍微鹼性的pH下更穩定，在緩沖液中溶解更快。即使是DNA顆粒也是如此。水往往趨向於低pH值，低至4-5，在短時間內洗脫時，高分子量DNA可能不完全水化。通過讓緩沖液在離心前在膜中停留幾分鍾，可以最大限度地洗脫DNA。

另一方面，RNA在弱酸性pH值下穩定，因此水是首選洗脫液。RNA很容易溶於水。

6. 離心柱操作時容易出問題的事兒

核酸回收率低：因素有很多，通常是裂解問題，或者是過柱結合時條件出現了問題。

確保使用新鮮的優質乙醇（100%）稀釋緩沖液或添加到過柱結合步驟。

質量差的乙醇或者長期儲存的乙醇可能吸水，導致乙醇濃度發生變化，如果洗脫緩沖液的配置出現問題，DNA或RNA就會被清洗時流失。

低純度：如果樣品被蛋白質污染（低260/280），那麼可能是因為樣品太多，蛋白質沒有完全去除或溶解。如果樣品的260/230比率很低，則問題通常是來自結合緩沖液或洗滌緩沖液中的鹽。確保使用最高質量的乙醇來制備洗滌緩沖液，如果問題仍然存在，則提取是增加洗滌次數。

與其他樣品相比，一些樣品含有更多的抑制劑。環境樣品特別容易出現純度問題，因為在提取過程中腐殖物質會被溶解。腐殖質類似於DNA，很難從硅膠柱中除去。對於這種類型的樣品，在過柱步驟之前需要使用去除蛋白質和腐殖質的專門技術。

降解： 主要是RNA，降解是由於樣品儲存不當或者裂解效率過低造成的，不過前提是用不含RNase的水洗脫，對於DNA預處理來說，降解並不是一個大問題，因為對於PCR來說，DNA有降解，擴增依舊可以良好進行。但如果不希望DNA剪切過於嚴重，那麼不要使用太強的裂解方法。  PCR純化注意事項： PCR純化是所有硅基質離心柱技術中最簡單的，因為它只需要添加高濃度的結合鹽（通常在每個PCR反應體系中添加3-5倍體積）並離心柱體。因此，當PCR純化試劑盒操作失敗時，可能會特別令人沮喪。所以純化前，最好在凝膠上檢測一下擴增結果。

PCR反應體系中太多物質可在UV260處有吸收峰： 核苷酸、洗滌劑、鹽和引物。PCR純化試劑盒操作失敗多數是因為沒有獲得擴增產物。

如果確定反應體系中，有PCR產物且濃度不低，可以保留過柱後的液體，如果DNA沒有發生結合，還可以進行挽救，重新進行純化。

二、DNA連接酶工作原理

DNA連接酶（EC 6.5.1.1）以共價方式將DNA的磷酸骨架與平末端或配對的粘性末端連接起來，其作用是修復DNA分子中斷裂的雙鏈。

在分子生物學中，它通常用於將限制性內切酶產生的DNA片段插入載體。商業連接酶提供含有ATP和Mg2+的反應緩沖液，這兩種物質對連接酶活性都是必不可少的。

由於反復的凍融可能會破壞ATP，所以最好將溶液進行分裝。

鏈接反應本身有兩個基本步驟。首先，DNA末端必須偶然碰撞，並保持在一起足夠長的時間，以便連接酶連接它們。

低溫反應更容易。所有的分子在更高的溫度下移動得更快，如果它們在低溫下輕輕地漂浮在溶液中，而不是像在更高的溫度下那樣呼嘯而過，那麼兩個DNA末端碰撞並保持在一起會更容易。對於粘性末端，較低的溫度穩定了互補核苷酸之間的氫鍵，有助於保持性對位置。

第二步是酶促反應：DNA連接酶通過兩步催化3′-OH與5′-磷酸基團連接。首先，與酶活性部位的賴氨酸殘基相連的AMP核苷酸被轉移到5′-磷酸。然後磷酸腺苷鍵被3′-OH攻擊，形成共價鍵並釋放腺苷酸。為了讓酶進行進一步的反應，酶活性部位的AMP必須由ATP補充。

DNA連接酶在25℃時具有最佳活性，因此連接反應在使DNA末端連接在一起的最佳溫度（1℃）和酶反應（25℃）之間的權衡溫度下進行。通常在16℃下1小時是可以的，但是由於將DNA末端連接在一起是反應中最不有效的部分，因此通過將溫度降低到4℃來促進這一點可以提供更高的效率。 然而，酶在這個溫度下工作非常緩慢，因此需要很長的（如過夜）反應時間。

三、比色分析的工作原理

1.對硝基苯基磷酸酯—分析機制

對硝基苯磷酸酯（pNPP）作為一種合成底物廣泛應用於各種磷酸酶的催化活性測定。pNPP的磷酸基團被酶裂解生成對硝基苯酚，由於對硝基苯酚在水中電子激發的最大波長為318nm，因此對硝基苯酚也是無色的。然而，在鹼性條件下，對硝基苯酚轉化為對硝基苯酚陰離子，導致向400nm左右的深色偏移（根據溶液條件將化合物的吸收峰改變為較長波長）。這是電磁光譜的藍色邊緣，但是由於我們看到反射光的顏色（與吸收光相反），溶液看起來是黃色的。

要記住的事情：

鉻酸鹽轉移是分析的關鍵因素。

舉例來說，如果酶的活性要求在酸性范圍內有一個最佳的pH值，那麼酸性磷酸酶的情況正好如此。

在這種情況下，為了獲得所需的黃色，必須在終點添加強鹼（例如氫氧化鈉或氫氧化鉀）。

2.孔雀綠—分析機制

對硝基苯磷酸測定是很好的，但是如果你最喜歡的磷酸酶不能有效地代謝pNPP呢？另一種市面上可買到的磷酸酶測定法是孔雀綠測定法。這種簡單的測定方法是基於孔雀綠、鉬酸銨和游離正磷酸鹽（又稱無機磷酸鹽，pi）在酸性條件下形成的絡合物。

正磷酸鹽被磷酸酶分解後從磷酸化底物中釋放出來，在硫酸溶液中與鉬酸銨形成絡合物。孔雀綠磷鉬酸鹽絡合物的形成，在620-650nm處測量，與游離正磷酸鹽濃度直接相關。因此，有可能量化蛋白質磷酸酶底物的磷酸化和磷酸釋放。

要記住的事情：

這種方法僅測量無機游離磷酸鹽；在測量之前，必須首先水解和中和有機磷酸鹽（脂質結合或蛋白質結合磷酸鹽）。了解不同種類的有機磷酸鹽及其各自不同的水解自由能有助於優化分析條件。高能有機磷酸酯（縮醛磷酸酯、酸酐等）具有不耐酸的磷酸基團，可在低pH下孵育釋放到溶液中。另一方面，低能有機磷酸鹽（磷酸酯）在酸性溶液中穩定，需要更苛刻的條件（如熱分解）才能用這種方法檢測。

在大量孔雀綠存在下，3:1離子締合物[(MG+)3(PMo12O40 3-)]容易在酸性水溶液中形成和沉澱。為了穩定水溶液中的1:1離子締合物，在溶液中加入聚乙烯醇。

在分析過程中要考慮的另一件事是任何可能幹擾分析的氧化還原反應的可能性。鉬是一種過渡金屬，因此存在於多種氧化狀態。在鉬酸鹽陰離子中，它具有+6的氧化狀態。通過有機化合物，如抗壞血酸和還原糖（即葡萄糖）或無機化合物（如SnCl2）還原酸化的Mo（VI）溶液，生成顏色為藍色的Mo（IV）物質。

四、實驗室級用水是如何純化的？

1.蒸餾：像山丘一樣古老的技術（或者至少像隱藏在山丘里的靜物一樣）。水被加熱到沸點，然後冷凝成液體。這樣可以除去許多雜質，但沸點等於或小於水的雜質也會被帶入蒸餾液中。

2.微濾：在這項技術中，利用壓力迫使水通過孔徑為1至0.1微米的過濾器，以去除顆粒物。直徑小於0.2微米的過濾器可去除細菌，即所謂的冷殺菌。

3. 超濾，使用更小的孔徑（小於0.003微米）。這些基本上都是分子篩，用來去除直徑大於孔徑的分子。它可以用來清除病毒、內毒素、核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶。

4.反滲透。反滲透過濾器的孔徑小於0.001微米，這使得它們能夠根據直徑篩選離子。這是用來脫鹽的水。

5.通過活性炭床過濾，有助於去除吸附在炭表面的氯離子和有機化合物等物質。

6.紫外線輻射。紫外線是一種很明顯的去除水中微生物的方法。它還可以通過將某些有機化合物分解成危害較小的產物用來凈化水。

7. 去離子/離子交換。將水通過含有陽離子和陰離子樹脂混合物的樹脂床來去除水中的離子。水中的正離子被陰離子樹脂顆粒所吸引，而負離子被陽離子樹脂所吸引。其結果是從樹脂床的另一端流出去離子水。

銷售純水水或凈水系統通常將使用這些技術的組合。水的純度越高，使用的技術就越多。

五、為什麼酶有最適溫度

每個生物學家都熟悉酶反應速率與溫度的關系，如圖所示。

我們知道來自大腸桿菌或溫血動物的酶在37℃左右有一個最佳溫度，而來自熱排氣細菌的酶有更高的最佳溫度。

為什麼酶有一個最佳溫度分布？化學家有一個經驗法則，溫度升高10℃會使反應速度加倍。這個規則是從Arrhenius方程推導出來的。

基本上，隨著溫度的升高，反應物的動能也隨之增加。這種動能的增加意味著反應物更容易與足夠的能量發生碰撞，從而使反應發生，因此溫度越高，反應速率越高。

溫度上升：反應速率曲線的第一部分，其中速率隨著溫度的升高而增加，遵循Arrhenius方程。如果這種酶即使在高溫下也完全穩定，反應速度也會隨著溫度的升高而繼續增加，直到發生其他事情，比如其中一種反應物變得受限。

平衡：反應速率開始趨於平穩，這是由於溫度接近該酶變性溫度（因此失去活性）。

溫度下降：在更高的溫度下，酶完全變性，失活。

變性發生的溫度取決於酶的結構，而這又與酶的進化起源有關。大腸桿菌的酶已經進化到可以應對37℃左右的溫度，而來自熱噴口細菌的酶則被迫進化到可以在更高溫度下保持穩定的程度。

因此，酶的最佳溫度是基於Arrhenius模式對溫度的依賴性（反應越熱，反應速度越快）和酶接近變性溫度時的不穩定性之間的權衡。

4. DNA的純化與分離

DNA純化是指將DNA從細胞中提取出來並消除雜質的過程。

純化DNA的第一步是 破碎細胞 。最簡單的方法是在樣本中加入像十二烷基硫酸鈉（SDS）之類的去垢劑。破碎後通過兩種方法能獲得純凈的DNA。

第一種方法涉及降解和去除DNA之外的所有細胞成分，通過添加化學試劑，配合離心，便可獲取。

第二種方法是選擇性地將DNA從細胞抽提物中移除，主要通過 離子交換層析 （ion-exchange chromatography）技術實現。該方法的基本思想是不同物質（帶負電）吸附在正電荷樹脂上的強度不同，而添加不同濃度的鹽溶液可打破物質與樹脂間的結合，通過層析便能分離DNA、RNA與蛋白質。

分離得細胞總DNA後，往往根據需要打碎DNA大分子，形成長短不一的百餘或數百鹼基的小片段。要想進一步利用這些小片段，如測序、克隆、挑選目的片段等，通常是利用 凝膠電泳 的方法。

凝膠電泳是分離不同長度DNA分子的標准方法。電泳常用的凝膠有兩種： 瓊脂糖（agarose）凝膠和聚丙烯醯胺（polyacrylamide）凝膠 。

如果要對各小片段做克隆，利用質粒載體並需轉化（transformation）回寄主，當要 回收重組子 時，必需去除雜質。此時，影響回收的主要干擾是寄主染色體DNA。為了得到重組子DNA，一種常用的方法利用了這樣一個事實。即雖然質粒和染色體都是由超螺旋DNA構成，但在裂解細菌細胞時不可避免地引起一定量的細菌染色體被打斷，從而引起超螺旋的喪失。因此細胞抽提物就包含了超螺旋的質粒DNA和非超螺旋的染色體DNA，然後通過一種利用不同構象區別DNA分子的方法就可以純化出質粒。一種方法是向細胞抽提物中加入氫氧化鈉直到抽提物的pH達到12.0-12.5，這會引起非超螺旋DNA上的鹼基對斷裂。所產生的單鏈DNA纏繞在一起形成不溶的網狀物，通過離心可以去掉，使超螺旋質粒留在上清中。

有時需要 逐條分離染色體 ，可以利用 流式細胞計數儀 （flow cytometry）實現這一目的。對獲取的全DNA染色，由於結合於染色體的染料量依賴於染色體長度，所以較大的染色體結合的染料更多，其產生的熒光比短的染色體強。稀釋染色體樣品後，將其通過小孔以形成液滴流，其中的每個液滴只含單條染色體。當液滴通過可檢測熒光量的檢測儀時，就可以確定哪一滴含有所需的某一條染色體。將含有所需染色體的液滴帶上電荷，使它們在電場中偏轉並與其他的液滴分開。如果兩個不同不同染色體長度相近時，此時若使用的染料不是非特異性結合DNA的，而是對AT或者GC豐富區有高親和力的染料，如Hoechst33258和染色素A3，就可以將二者分開。這是因為兩條大小相同的染色體很少具有相同的GC含量。

T. A. 布朗. 基因組3[M]. 第一版. 北京: 科學出版社, 2009.