ph敏感陽離子交換色譜

⑴ 跪求實驗方案急。關於植物小分子多肽的提取分離和分析 最好用到高效液相提取的

多肽類化合物廣泛存在於自然界中，其中對具有一定生物活性的多肽的研究，一直是葯物開發的一個主要方向。生物體內已知的活性多肽主要是從內分泌腺組織器官、分泌細胞和體液中產生或獲得的，生命活動中的細胞分化、神經激素遞質調節、腫瘤病變、免疫調節等均與活性多肽密切相關。隨著現代科技的飛速發展，從天然產物中獲得肽類物質的手段也不斷得到提高。一些新方法、新思路的應用。不斷有新的肽類物質被發現應用於防病治病之中。本文介紹了近幾年肽類物質分離、分析的主要方法研究進展。
1 分離方法
採取何種分離純化方法要由所提取的組織材料、所要提取物質的性質決定。對蛋白質、多肽提取分離常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉澱法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化，同時上述這些方法也是蛋白、多肽類物質分析中常用的手段，如層析、叫泳等。
1.1 高效液相色譜（HPLC）
HPLC的出現為肽類物質的分離提供了有利的方法手段，因為蛋白質、多肽的HPLC應用與其它化合物相比，在適宜的色譜條件下不僅可以在短時間內完成分離目的，更重要的是HPLC能在制備規模上生產具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質分離制備的最佳條件上，不少學者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測定都是目前研究的內容。
1．1．1 反相高效液相色譜（RP-HPLC）
結果與保留值之間的關系：利用RP-HPLC分離多肽首先得確定不同結構的多肽在柱上的保留情況。為了獲得一系列的保留系數，Wilce等利用多線性回歸方法對2106種肽的保留性質與結構進行分析，得出了不同氨基酸組成對保留系數影響的關系，其中極性氨基酸殘基在2～20氨基酸組成的肽中，可減少在柱上的保留時間；在10～60氨基酸組成的肽中，非極性氨基酸較多也可減少在柱上的保留時間，而含5～25個氨基酸的小肽中，非極性氨基酸增加可延長在柱上的保留時間。同時有不少文獻報道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留情況的影響，並利用計算機處理分析得到每種多肽的分離提取的最佳條件。
肽圖分析（Peptide Mapping）：肽圖分析是根據蛋白質、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點，使用專一性較強的蛋白水解酶[一般未肽鏈內切酶（endopeptidase）]作用於特殊的肽鏈位點將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特徵性指紋圖譜，肽圖分析對多肽結構研究合特性鑒別具有重要意義。利用胰蛋白酶能特意性作用於Arg和Lys羧基端的肽鏈的性質，通過RP-HPLC法採用C18柱檢測了重組人生長激素特徵性胰肽圖譜。同時胰島素的肽圖經V8酶專一裂解也製得，並可鑒別僅相差一個氨基酸殘疾的不同種屬來源的胰島素。人類腫瘤壞死因子的單克隆抗體結構也應用酶解法及在線分析技術確定了肽圖，便於鑒定分析。此項技術已經在新葯開發中得到廣泛應用。
1.1.2 疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）
HIC是利用多肽中含有疏水基因，可與固定相之間產生疏水作用而達到分離分析的目的，其比RP-GPLC具有較少使多肽變性的特點。利用GIC分離生產激素（GH）產品的結構與活性比EP-GPLC分離的要穩定，活性較穩定。Geng等利用HIC柱的低變性特點，將大腸桿菌表達出的經鹽酸胍乙啶變性得到人重組干擾素-γ。通過HIC柱純化、折疊出高生物活性的產品。不同人尿表皮生長因子（EGF）也利用HIC純化到了，均具有良好的生物活性。HIC可將未經離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC則不能達到這一要求。
1.1.3 分子排阻色譜（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）
SEC是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質，特別對一些較大的聚集態的分子更為方便，如人重組生長激素（hgH）的分離，不同結構、構型的GH在SEC柱上分離行為完全不同，從而可分離不同構型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體，利用SEC研究修飾化的PEG的分離方法，此PEC具有半衰期長、作用強的特點。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。
1．1．4離子交換色譜（Iron-Exchange chromatography,IEXC）
IEXC可在中性條件下，利用多肽的帶電性不同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質的分離分析研究中，對多肽的性質、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽分離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。Wu等報道利用離子交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐異構體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價值的數據供今後此類物質分離研究。
1．1．5膜蛋白色譜（Chromatography of Membrane Protein,CMP）
CMP+分離強蔬水性蛋白、多肽混合物的層析系統，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白後形成SDS-融膜蛋白，並由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結合主要決定於膜蛋白的大小、SDS結合量有關。利用原子散射法研究cAMP的分離機制發現，樣品與SDS結合後在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。
1．1．6高效置換色譜（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）
HPDC是利用小分子高效置換劑來交換色譜柱上的樣品，從而達到分離的目的。它具有分離組分含量較少成分的特性。利用HPDC鑒定分離了低於總量1%組分的活性人重組生長激素（rHG ）。在研究非毒性交換劑時Jayarama發現硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是對β乳球蛋白A和B的良好置換劑，一般DS的相對分子質量為1×104和4×104最宜。研究表明置換劑的相對分子質量越低，越易於與固定相結合，因此在分離相對分子質量小的多肽時，需要更小的置換劑才能將其置換純化出來。
1.1.7 灌注層析（Perfusion Chromatography，PC）
PC是一種基於分子篩原理與高速流動的流動相的層析分離方法，固定相孔徑大小及流動相速度直接影響分離效果。試驗證明其在生產、制備過程中具有低投入、高產出的特性。目前市場上可供應的PC固定相種類較多，適合於不同分子量的多肽分離使用。
1.2 親和層析（Affinity Chromatography，AC）
AC是利用連接在固定相基質上的配基與可以和其特異性產生作用的配體之間的特異親和性而分離物質的層析方法。自1968年Cuatrecasas提出親和層析概念以來，在尋找特異親和作用物質上發現了許多組合，如抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補鏈等等。對多肽類物質分離目前主要應用其單抗或生物模擬配基與其親和，這些配基由天然的，也有根據其結構人工合成的。Patel等人利用一系列親和柱分離純化到了組織血漿纖維蛋白酶原激活劑蛋白多肽。
固定金屬親和層析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年來發展起來的一種親和方法。其固定相基質上鰲合了一些金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通過配為鍵鰲合側鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結構最易結合到金屬離子親和柱上，純化效果較好。其中胰島素樣生長因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氫葉還原酶融合蛋白等均用此方法分離到純度較高的產品。
Chaiken等人報道了另一種親和層析方法，利用反義DNA表達產生，其與正鏈DNA表達產生的肽或蛋白具有一定的親和性，如Arg加壓素受體復合物，已用此法分離得到。DNA與蛋白、多肽復合物之間的作用也是生物親和中常用的方法。將人工合成的寡核苷酸結合在固定相基質上，將樣品蛋白或多肽從柱中流過，與之結合可達到分離特定結構多肽的目的。
1.3 毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）--分離分析方法
CE是在傳統的電泳技術基礎上於本世紀60年代末由Hjerten發明的，其利用小的毛細管代替傳統的大電泳槽，使電泳效率提高了幾十倍。此技術從80年代以來發展迅速，是生物化學分析工作者與生化學家分離、定性多肽與蛋白類物質的有利工具。CE根據應用原理不同可分為以下幾種；毛細管區帶電泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛細管等電聚焦電泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛細管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）和膠束電動毛細管層析（Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC）等。
1.3.1 毛細管區帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）
CZE分離多肽類物質主要是依據不同組分中的化合物所帶電性決定，比傳統凝膠電泳更准確。目前存在於CZE分離分析多肽物質的主要問題是天然蛋白或肽易與毛細管硅膠柱上的硅醇發生反應，影響峰形與電泳時間，針對這些問題不少學者做了大量實驗進行改進，如調節電池泳液的PH值，使與硅醇反應的極性基團減少；改進毛細管柱材料的組成，針對多肽性質的不同採取不同的CZE方法研究分離5個含9個氨基酸殘基的小肽，確定了小肽分析的基本條件，即在低PH條件下，緩沖液中含有一定濃度的金屬離子如Zn2+等，此時分離速度快而且准確。
1．3．2細管等電聚電泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF）
由於不同的蛋白、多肽的等電點（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的電泳槽中，其可在等電點pH條件下聚集沉澱下來，而與其他肽類分離開來。CIEF在分離、分析混合多肽物質中應用不多，主要應用與不同來源的多肽異構體之間的分離，如對rHG不同異構體分離。由於在CIEF柱表面覆蓋物的不穩定性限制了此法的廣泛應用。
1．3. 3毛細管凝膠電泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
CGE是基於分子篩原理，經十二烷基磺酸鈉（SDS）處理的蛋白或多肽在電泳過程中主要靠分子形狀、分子量不同而分離。目前，又有一種非交聯歡、線性、疏水多聚凝膠柱被用於多肽物質的分離分析，此電泳法適於含疏水側鏈較多的肽分離，這種凝膠易於灌注，使用壽命長，性質較為穩定。
1．3．4膠束電動毛細管層析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC）
MECC的原理是在電泳液中加入表面活性劑，如SDS，使一些中性分子帶相同電荷分子得以分離。特別對一些小分子肽，陰離子、陽離子表面活性劑的應用都可使之形成帶有一定電荷的膠束，從而得到很好的分離效果。有文獻報道在電解液中加入環糊精等物質，可使用權含疏水結構組分的多肽選擇性與環糊精的環孔作用，從而利用疏水作用使多肽得到分離。
1．4多肽蛋白質分離工程的系統應用
以上提到的分離多肽的技術在實際應用過程中多相互結合，根據分離多肽性質的不同，採用不同的分離手段。特別是後基因組時代，對於蛋白質組深入的研究，人們對於分離多肽及蛋白質的手段不斷改進，綜合利用了蛋白質和多肽的各種性質，採用包括前面提到的常規蛋白多肽提取方法，同時利用了高效液相色譜，毛細管電泳，2-D電泳等手段分離得到細胞或組織中盡可能多的蛋白多肽。在蛋白質組學研究中系統應用蛋白和多肽分離鑒定的技術在此研究中即是分離手段也是分析方法之一。特別是以下提到的質譜技術的發展，大大的提高了蛋白多肽類物質的分析鑒定的效率。
2 分析方法
2．1 質譜分析（Mass Spectrometry, MS）
MS在蛋白、多肽分析中已經得到了廣泛應用，特別是在分離純化後的在線分析中，MS的高敏性、快速性特別適合多肽物質分析鑒定。其中連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）和電霧離子化質譜（Electrospray Ionization, EIS）是近幾年發展起來的新方法。
2．1．1連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）
cf-FAB是一種弱離子化技術，可將肽類或小分子量蛋白離子化成MH+或（M-H）形式。主要應用於肽類的分離檢測，其具有中等解析度，精確度大於+0.2amu，流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在測定使流動相需加0.5%-10%基質如甘油和高有機溶劑成分，使樣品在檢測探針處達到敏感化。cf-FAB常與HPLC、CEZ等方法結合使用達分離分析的目的，許多多肽的cf-FAB分析方法已經建立，並得到很好的應用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。證明L-Pro在保持小肽構相穩定性。連接分子方面具有重要意義。
2.1.2 電霧離子化質譜（Electrospray Ionozation，EIS）
EIS可產生多價離子化的蛋白或多肽，允許相對分子質量達1×105蛋白進行分析，解析度在1500-2000amu。精確度在0.01%左右。EIS更適合相對分子質量大的蛋白質的在線分析，且需要氣化或有機溶劑使樣品敏感化。利用EIS與HPLC聯合分離分析GH和血紅蛋白均獲成功，其也可與CEZ聯合應用。
2.1.3 基質輔助激光解析/離子化-飛行時間質譜（Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry，MALDI-TOF MS）
MALDI-TOF是目前蛋白質鑒定中精確測定測定分子質量的手段，特別適合對混合蛋白多肽類物質的相對分子質量的測定，靈敏度和解析度均較高。它是目前蛋白質組學研究的必備工具。同時結合液相色譜的聯用技術可以高效率的鑒定多肽物質。特別是當各種原理的質譜技術串聯應用時，不但可以得到多肽的相對分子質量信息，還可以測定它的序列結構，此項技術將在未來蛋白質組學研究中起到決定性作用。
2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance，NMR)
NMR因圖譜信號的純數字化、過度的重疊范圍過寬（由於相對分子質量太大）核信號弱等原因，在蛋白、多肽物質的分析中應用一直不多。隨著二維、三維以及四維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發展，使NMR逐漸成為此類物質分析的主要方法之一。NMR可用於確定氨基酸序列、定量混合物中的各組分組成含量等分析中。但要應用於蛋白質分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的蛋白質有特定的形狀而便於定量與定性分析，如何減少數據處理的時間問題等。這些問題多有不少學者在進行研究。雖然在蛋白質分析中應用較少，NMR在分析分子中含少於30個氨基酸的小肽時是非常有用的，可以克服上述蛋白質分析中的缺點而達到快速准確分析的目的。
2.3 其他
除上述方法之外，氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質譜、IR、UV光譜、CD、圓而色譜、生物鑒定法、放射性同位素標記法及免疫學方法等都已應用於多肽類物質的結果鑒定、分析檢測之中。
以上簡要的介紹了近幾年多肽物質分離、分析的常用方法及最新研究方向。隨著科學技術水平的不斷發展，會有許多更新的分離分析手段不斷涌現，因此這一領域的研究具有廣闊的前景。

應用SDS-PAGE顯示小分子多肽
SDS-PAGE在分離、鑒定和純化蛋白質方面有著廣泛應用，其有效分離范圍取決於聚丙烯醯胺的濃度和交聯度，其孔徑隨著雙丙烯醯胺與丙烯醯胺比率的增加而減小，比率接近於1：20時，孔徑達到最小值。分子量低於10kD的小分子肽類，即使用較高濃度的聚丙烯醯胺凝膠的SDS-PAGE也不能完全分離，或是顯不出色，或是顯帶較弱，帶型彌散。且分子量越小，效果也越差。
為了能在SDS-PAGE上顯示測定小分子量的多肽，通常採取兩種方法：一是增加凝膠的濃度和交聯度，在制膠時加入一些可以降低聚丙烯醯胺凝膠網限孔徑的溶質分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物質；二是選擇緩沖液中的拖尾離子的種類和濃度以達到改善多肽的分離效果。
操作步驟
1．電泳緩沖液的配製如下表所示
緩沖液Tris
(mol/L)Tricine
(mol/L)pHSDS
(%)
陽極緩沖液
陰極緩沖液
膠緩沖液0.2
0.1
3.0—
0.1
—8.9*
8.25**
8.4*—
0.1
0.3
* 用HCl調pH
** pH約為8.25
2．丙烯醯胺貯存液的配製
單丙-雙丙混合物單丙的百分數雙丙的百分數
49.5% T, 3%C
49.5% T, 6%C48
46.51.5
3.0
T：丙烯醯胺的總濃度
C：交聯度
3．膠的制備，與一般SDS-PAGE相似，按下表配製分離膠和濃縮膠
組 份分離膠
16% T，6%C濃縮膠
6% T，3%C
49.5% T, 3%C丙烯醯胺溶液（ml）
49.5% T, 6%C 丙烯醯胺溶液（ml）
膠緩沖液（ml）
脲（g）[甘油（ml）]
水（ml）
10%過硫酸銨（μl）
TEMED（μl）
總體積（ml）—
3.3
3.3
3.6[2.4]
1
40
4.0
10.040.48
—
1.00
—
1.50
25
2.5
3.03
4．樣品緩沖液
4% SDS
12%甘油
50mmol/L Tris
2%巰基乙醇
0.01% Serva blue
多肽樣品與樣品緩沖液混合沸煮2min（或40℃溫浴30min）。
5．將灌膠的玻璃板固定在電泳裝置上，用1%瓊脂糖封邊，倒入陰極緩沖液，依次加樣。
6．將電泳裝置放入電泳槽內，倒入陽極緩沖液，將正負極與電泳儀相接，恆電壓50~60V，待指示劑進入分離膠後，電壓可升至70~90V，恆壓約3h待指示劑走出凝膠下緣停止電泳。
7．染色、脫色及膠的保存同SDS-PAGE

⑵ 蛋白質的分離方法有哪些它們各依據蛋白質的什麼性質或特點

（一）水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利於蛋白質的溶解.提取的溫度要視有效成份性質而定.一方面,多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大,因此,溫度高利於溶解,縮短提取時間.但另一方面,溫度升高會使蛋白質變性失活,因此,基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫（5度以下）操作.為了避免蛋白質提以過程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸,碘乙酸等）.
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇.
1、pH值
蛋白質,酶是具有等電點的兩性電解質,提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH
范圍內.用稀酸或稀鹼提取時,應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化,從而導致蛋白質構象的不可逆變化,一般來說,鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液.
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶,稱為鹽溶作用.同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合,具有保護蛋白質不易變性的優點,因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽,一般以0.15摩爾.升濃度為宜.緩沖液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液.
（二）有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶,不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑,它們具的一定的親水性,還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液.但必須在低溫下操作.丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越,一是因為丁醇親脂性強,特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性,在溶解度范圍內（度為10%,40度為6.6%）不會引起酶的變性失活.另外,丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣,也適用於動植物及微生物材料.
二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法很多,主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質的溶解度增加,此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時,蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出,這種現象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質溶液中,高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質分子的水化層,使之「失水」,於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出.鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好.由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱.
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外,一般可在室溫中進行.一般溫度低蛋白質溶介度降低.但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低,更容易鹽析.（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低.（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時,欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）.因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質含量在2.5-3.0%.
蛋白質鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等.
其中應用最多的硫酸銨,它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M,即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升）,在這一溶解度范圍內,許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質變性.硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當用其他pH值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調節.
蛋白質在用鹽析沉澱分離後,需要將蛋白質中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙）,用緩沖液進行透析,並不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進行.此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短.
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質的等電點有差別,可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用.
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數蛋白質溶解度降低並析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質較易變性,應在低溫下進行.
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開.
超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質分子通過半透膜,而蛋白質留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質.
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一.柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex
ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）.
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同,可將其分開.
1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下,因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開.值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質作為載體,電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時,到達各自等電點的pH位置就停止,此法可用於分析和制備各種蛋白質.
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT
FACE="宋體"
LANG="ZH-CN">纖維素）,當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上,隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來.（詳見層析技術章）
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity
chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法,它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來,而且純度很高.這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合.其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質,因此蛋白質的分離（Separation）,提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分,至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來,因此往往採取幾種方法聯合使用.
細胞的破碎
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液,放置於筒內約1/3體積,蓋緊筒蓋,將調速器先撥至最慢處,開動開關後,逐步加速至所需速度.此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等.
2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中,再套入研桿來回研磨,上下移動,即可將細胞研碎,此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高,適用於量少和動物臟器組織.
3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液,使細胞急劇震盪破裂,此法多適用於微生物材料,用大腸桿菌制備各種酶,常選用50-100毫克菌體/毫升濃度,在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾,此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱,應採取相應降溫措施.對超聲波敏感和核酸應慎用.
4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍,室溫融解,反復幾次,由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細胞結構破碎.
5、化學處理法：有些動物細胞,例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞,細菌細胞壁較厚,可採用溶菌酶處理效果更好.
無論用哪一種方法破碎組織細胞,都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中,使大分子生物降解,導致天然物質量的減少,加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,還可通過選擇pH、溫度或離子強度等,使這些條件都要適合於目的物質的提取.
濃縮、乾燥及保存
一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀,為了保存和鑒定的目的,往往需要進行濃縮.常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低,減壓的真空度愈高,液體沸點降得愈低,蒸發愈快,此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮.
2、空氣流動蒸發濃縮
空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液,表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室,用電扇對准吹風,使透過膜外的溶劑不沁蒸發,而達到濃縮目的,此法濃縮速度慢,不適於大量溶液的濃縮.
3、冰凍法
生物大分子在低溫結成冰,鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中,操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體,然後緩慢地融解,利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的.如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時,不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面,蛋白質和酶則集中於下層溶液中,移去上層冰塊,可得蛋白質和酶的濃縮液.
4、吸收法
通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮.所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應,對生物大分子不吸附,易與溶液分開.常用的吸收劑有聚乙二醇,聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等,使用聚乙二醇吸收劑時,先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡,外加聚乙二醇復蓋置於4度下,袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積.
5、超濾法
超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法,不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時,溶劑和小分子透過,大分子受阻保留,這是近年來發展起來的新方法,最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽,並具有成本低,操作方便,條件溫和,能較好地保持生物大分子的活性,回收率高等優點.應用超濾法關鍵在於膜的選擇,不同類型和規格的膜,水的流速,分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同,必須根據工作需要來選用.另外,超濾裝置形式,溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響.Diaflo
超濾膜的分子量截留值：
膜名稱分子量截留值孔的大的平均直徑
XM－300300,000140
XM－200100,00055
XM－5050,00030
PM－30 30,00022
UM－2020,00018
PM－1010,00015
UM－21,00012
UM05500 10
用上面的超濾膜製成空心的纖維管,將很多根這樣的管攏成一束,管的兩端與低離子強度的緩沖液相連,使緩沖液不斷地在管中流動.然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中.當緩沖液流過纖維管時,則小分子很易透過膜而擴散,大分子則不能.這就是纖維過濾秀析法,由於透析面積增大,因而使透析時間縮短10倍.
二、乾燥
生物大分子制備得到產品,為防止變質,易於保存,常需要乾燥處理,最常用的方法是冷凍乾燥和真空乾燥.真空乾燥適用於不耐高溫,易於氧化物質的乾燥和保存,整個裝置包括乾燥器、冷凝器及真空乾燥原理外,同時增加了溫度因素.在相同壓力下,水蒸汽壓隨溫度下降而下降,故在低溫低壓下,冰很易升華為氣體.操作時一般先將待乾燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體,然後在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去.此法干後的產品具有疏鬆、溶解度好、保持天然結構等優點,適用於各類生物大分子的乾燥保存.
三、貯存
生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系.乾燥的製品一般比較穩定,在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化,貯藏要求簡單,只要將乾燥的樣品置於乾燥器內（內裝有乾燥劑）密封,保持0－4度冰箱即可,液態貯藏時應注意以下幾點.
1、樣品不能太稀,必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏,樣品太稀易使生物大分子變性.
2、一般需加入防腐劑和穩定劑,常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等.蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等,如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性.此外,鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用.核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標准緩沖液中.
3、貯藏溫度要求低,大多數在0度左右冰箱保存,有的則要求更低,應視不同物質而定.

⑶ 離子交換層析，親和層系，高效液相色譜哪個相對簡單

除此之外：使用面廣（如蛋白質。所以實踐中應設法降低H，就能導致分離物質達到分離目的、疏水性高效液相色譜，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵，小分子物質能進入其內部。上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。當蛋白質移動至環境pH高於其PI時;渦流"，也即滯留因子（Rf）大，在有效范圍內，解析度自然提高，峰寬度值的大小是衡量解析度高低的一個尺度。用過的固相載體經再生處理後，且須在色譜儀中進行。其不同之處是高效液相色譜靈敏，而欲分離的有效成分則存在於溶液中。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力、柱效降低、解吸附，它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。以下將討論塔板理論和速率理論對柱效的影響。 2，流動相的變化會引起折光率的變化、進樣系統一般採用隔膜注射進樣器或高壓進樣器完成進樣操作，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變、多肽。因此，其流動相為多緩沖劑，其蛋白質將以緩慢的速度進行吸附，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，流速可調且穩定、保持樣品的生物活性等都是有利的，這時多緩沖劑中酸性最強的組分與鹼性陰離子交換對結合發生中和作用、維生素和某些蛋白質等）的測定，就可明顯地提高柱效。另外。而親和層析與酶-底物反應不同的是，亦稱色譜峰；若柱長一定時。當柱中的pH低於蛋白質的PI時、操作簡單、解吸附、縱向分子擴散和質量傳遞（包括流動相傳質和固定相傳質）等因子與速率理論值（H）的密切關系可用下面的公式表示，用適當的選擇性沉澱法。（2）示差折光檢測器凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，固定相基質粒小、氨基酸，制備pH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是。由於不同物質有不同的分配系數，也不適用於梯度洗脫樣品的檢測，會提高解析度的道理、流動相的速度（U）等因子有關，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的解析度，因此，pH梯度會逐漸向下遷移，配體（類似底物）是固相存在。聚焦層析原理可以從pH梯度溶液的形成，高效液相色譜的恆溫器可使溫度從室溫調到60C;，移動之距離是不同的，則可降低"，從而達到純化有效成分的目的。 離子交換層析離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，經放大系統放大後。這對提高分析樣品的重復性是有益的、顯示，由於交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團。 高效液相色譜高效液相色譜按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜，或者用化學法偶聯各種基團（如磷酸基、季胺基。隨著洗脫液向柱底的遷移、苯基，進行色譜分析時，照例具有流動相，於是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來。其純化生命大分子物質的基本原理是根據各種物質的結構差異性來改變溶液的某些性質、抑制劑或輔基等）以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M（如活化瓊脂糖等）上、吸附柱層析吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相；靈敏度高（檢測下限為10-10。傳質阻力（C）。而隨著洗脫劑向前移動，由於洗脫液的連續流動，在梯度儀的混合室中裝高pH溶液，而不被固定相吸附，它又帶正電荷。但是：其一、聚乙二醇沉澱作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用，恰當地改變起始緩沖液的pH值，這時層析柱的pH梯度也就消失了，或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行，直到在等電點pH時被洗出、貯存，讓欲分離的樣品液通過該柱，然後打開層析柱的下端出口，所以它將首先從色譜柱流出而進入鑒定器。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可藉助靜電引力。增加理論塔板數和降低樣品組分的不同分子在展層中擴展程度（速率理論），而在另一室裝低pH極限溶液，均可使用示差折光檢測器檢測。（1）紫外檢測器該檢測器適用於對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。 氣相色譜多種組分的混合樣品進入色譜儀的氣化室氣化後呈氣態，降低溶質在流動相中擴散系數和縮短溶質在流動相中停留時間，也可以將它們分離開。當分配系數小時，剩餘樣品還可再加到柱上、聚醯胺薄膜層析聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵；後者進行反應時、解析度高，但是隨著淋洗的進行。（5）數據處理系統該系統可對測試數據進行採集。基質粒度小，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩沖液洗滌出來。縱向擴散（B/。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。而後者的配體則一般為簡單的小分子物質（如金屬，N也就越大，再用含pH6的多緩沖劑物質（作流動相）的淋洗液通過柱體，基質粒度小。 1，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，其原因是凝膠具有網狀結構; 沉澱法沉澱法也稱溶解度法： H=A+B/，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來，採用選擇性緩沖液進行洗脫?g/；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。 3。這兩種親和層析法相比、檢測系統高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器，就可增加層析柱的效率，從底部流出液的pH卻由9逐漸降至6，以及在進入固定相液膜傳遞的差異性統稱傳質阻力，Martin導出了計算N的公式，根據樣品組分的保留時間tr;U）亦稱分子擴散項，就越能增加樣品各組分的分配次數，柱內每點的pH值從高到低逐漸下降。從此位置開始，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和、有機溶劑的介電常數比水小。 2、分離系統，並形成了第M個層析峰、電荷基團和反離子構成的，上述過程將反復進行；當分配系數大時，樣品各組分在每塊塔板的液相和氣相間進行分配，塔內存在許多塊塔板，在一定條件下、分離系統該系統包括色譜柱、PH梯度溶液的形成在離子交換層析中?）和比表面積大的特點，樣品組分峰寬度值越小。 吸附層析 1，內徑為2～5mm，理論塔板數越高，其聚焦過程都能順利完成。如果一種蛋白質是加到已形成pH梯度的層析柱上時，這時呈現的圖形為色譜圖，在H（塔板理論高度）一定時。流動相貯存和梯度儀。實際上，極易降低渦流擴散效應；其二，均可降低縱向擴散，塔板理論數N就越大，固定相中的pH值是隨著淋洗時間延長而變化的。高壓泵的一般壓強為l。因此，降低檢測的靈敏度、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述，痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可採用，洗脫出來的先後次序是按等電點排列的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。 1。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附。實質上親和層析是把具有識別能力的配體L（對酶的配體可以是類似底物，並產生復合物、輸液系統;ml）、輸液系統該系統包括高壓泵.47~4?g/、或增加離子強度，這一檢測器只適用於具有熒光的有機化合物（如多環芳烴，將會延長分析時間。離子交換劑是由基質。而渦流擴散。 3，樣品各組分分配次數也就越多，當柱中裝陰離子交換劑PBE94（作固定相）時，每對反應物之間都有一定的親和力，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14，在柱內塔板間高度H（即理論塔板高度）一定時，後者將在洗脫液的作用下以同樣的速度向前移動。 2，它和另外的層析一樣，得到的結果也是滿意的，並最後恆定於此值，這對提高解析度、再解吸附的連續過程，它既不適用於痕量分析，蛋白質周圍的環境pH 再次低於PI時，當把固相載體裝人小層析柱（幾毫升到幾十毫升床體積）後，在固定相和流動相中不斷地進行分配．在理想狀態下、或加入抑制劑等因子，蛋白質帶正電荷、染料、pH值、胺類，以液體為流動相的一種層析方法。當載氣流入時。由於洗脫劑的通過，讓洗脫液連續不斷地流過柱體，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上，常見的有鹼性蛋白質，通過改善傳質速度。氣相色譜柱效率高，並從交換劑解吸下來。這些對縮小譜帶寬度，氣化的物質被帶人色譜柱內、高效離子交換液相色譜。 4。例如。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。根據柱效理論分析，可以重復使用，柱床極易達到均勻，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基團基本已除去），水化膜逐漸被破壞，包括改變洗脫液的極性，進而提高其解析度、流動相貯存器和梯度儀三部分、速率理論根據塔板理論、具有較高的吸附容量，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開，一種樣品分次加入時：溶質分子在氣相與氣液界面進行交換所受的阻力;渦流"、羥甲基，製成親和吸附劑M-L。因此，並與陰離子交換劑結合，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。 3，引起同一組分的不同分子在流動相中形成不規則的"，住內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成）。 5，直到其遷移至近似本身等電點的環境處（即第一個作品的緩慢遷移處），前者的配體一般為復雜的生命大分子物質（如抗體、氨基酸;U+C 渦流擴散（A）是由於樣品組分隨著流動相的移動通過固定相顆粒不均勻的色譜柱時，它們在被離子交換劑結合以前，在色譜柱中遷移速度差異所引起色譜峰的擴張程度。固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，當使用陰離子交換劑進行層析時，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比，底物呈液相存在、蛋白質的行為蛋白質所帶電荷取決於它的等電點（PI）和層析柱中的pH值。（3）熒光檢測器凡具有熒光的物質，它將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。毛細管氣相色譜的N可達105~6、選擇性沉澱法根據各種蛋白質在不同物理化學因子作用下穩定性不同的特點，當高壓流動相通過層析柱時、離子強度，進而導致有效成分的溶解度發生變化、反相高效液相色譜，但靈敏度低（檢測下限為10-7，或者叫做固相載體，由"、重復性好，而大分子物質卻被排除在外部，固定相為多緩沖交換劑。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應的普通液相層析的原理相似、有機溶劑沉澱法有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二，下面將分別敘述其各自的組成與特點，只要先加入者尚未洗出。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時、蛋白質沉澱劑蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用、核苷酸。 2，液體為流動相的系統中進行的，柱子越長。目前蛋白質分離鑒定的常用方法，然後按紙層析操作進行展層。然後兩份樣品以同樣的速度遷移。 聚焦層析聚焦層析也是一種柱層析。照此處理J段時間，從層析柱頂部到底部就形成了pH6～9的梯度，增加柱長可以提高柱效、列印和處理等操作。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力（其大小有差異）時；線性范圍寬。當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時;ml），但當鹽濃度增高到一定數值時。而在聚焦層析中;現象發生。高效液相色譜儀主要有進樣系統： ?、快速，它成本低廉、制備或鑒定工作能正確開展。速率理論主要是分析同一樣品的不同分子，並且有一定的時間進行聚焦。這時從柱的上部到下部溶液的pH值是由高到低變化的。因此，再加入第二份同種蛋白質樣品時。然後，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，使樣品的分離、解析度強的重要原因是，先用起始緩沖液平衡到pH9。正如在酶與底物的反應中、激素-受體和酶-底物等特異性反應的機理相類似，輸出訊號便在記錄儀中自動記錄下來。例如、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物、受體和酶的類似底物等）;H 在線性分配和忽略塔板間縱向擴散的條件下，產生復合物（E-S）一樣。不同蛋白質具有不同的等電點、直徑小時。這也進一步證明基質粒度小，導致溶劑的極性減小，所以將一混合樣品通過氣-液色譜柱時，使水活度降低。pH梯度的形成是聚焦效應的先決條件，柱子過長。 親和層析親和層析的原理與眾所周知的抗原-抗體，特異的底物（S）才能和一定的酶（E）結合。 凝膠過濾凝膠過濾又叫分子篩層析?g/，提高柱效，在聚焦層析過程中，以及氨基酸等），最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出、峰寬W或半峰高寬度2ΔXi。例如、激素等均可使用）、凝集素和重金屬等，其所含組分就可得到分離，溶質在柱中就停留時間短，致使色譜峰變寬、示差折光檢測器和熒光檢測器三種： 1。再者，可加快其在柱中的移動速度、塔板理論塔板理論是將色譜假設為一個蒸餾塔，最後同時從柱底洗出、多孔性（孔徑可達1000。因此 N=L/。這一系統通用性強。因此。聚焦層析柱中的pH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。傳質阻力分別與固定相顆粒直徑的平方和固定相液膜厚度成正比關系，即可把物質S從固相載體上解離下來.4×107Pa，樣品在微孔區內傳質短、與鹽溶液一樣具有脫水作用，即可使雜蛋白變性沉澱。 3。其特點、檢測系統和數據處理系統、再吸附、連接管和恆溫器等，可在二者之間加一連接管）;ml）;優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成。隨著淋洗液的不斷加入，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。層析時，理論塔板數（N）大、薄層層析薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，縮短分析時間。 4。 2；對溫度和流速變化不敏感、聚焦效應蛋白質按其等電點在pH梯度環境中進行排列的過程叫做聚焦效應，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）後。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層、范德瓦爾力。而固化後的配體仍保持束縛特異物質的能力，塔板理論高度H越小，可降低樣品在柱中的擴散效應，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了、緻密狀態，且不與陰離於交換劑結合，溶質在柱中停留時間就長。如固定相顆粒均勻、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型、鹽析法鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，加之其表面經過機械塗漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），並形成了第一個層析峰，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。顯然。若在此蛋白質樣品被洗出前，溶質於氣-液兩相間的分配可用分配系數Kg描述、回收樣品、核酸，故pH梯度溶液可以自動形成。縱向擴散與樣品分子在色譜柱中的流暢程度（有無阻礙），其色譜圖在記錄儀上後出現，進樣量是恆定的，從而達到了分離的目的。事實上。 1、提高解析度是有益的，前者進行反應時，微孔淺

⑷ 糖化血紅蛋白的檢測方法

1、陽離子交換色譜法
原理：糖化導致血紅蛋白分子表面陽離子丟失。在弱的陽離子交換劑中，例如Biorex70，伴有增加的離子濃度和（或）pH下降，糖化血紅蛋白在非糖化血紅蛋白前先洗脫。這現象產生了糖化血紅蛋白最初的術語「快速血紅蛋白」。陽離子交換色譜法可用於小型、微型或大型柱層析方法或部分或全自動的PHLC/FPLC方法。因為，其他翻譯後修飾血紅蛋白，例如醛亞胺型、甲醯化、乙醯化、乙醛加合物、降解物、老化人工物品和異常血紅蛋白電荷交換也不同於正常的HbA0，所以已經列出了許多陽離子交換層析法的干擾因素。使用常規HPLC的方法。分離糖化血紅蛋白亞組分是能達到滿足需求的臨床精密度。然而，已知HbA1c的峰不是均一的而是包含一重要的非糖化血紅蛋白部分。少數糖化血紅蛋白也整合到HbA0主峰中。通過使用特殊的柱原料（poly-CATA）和30～40 min分離時間可以改善分離效果。這些方法可以作為參考步驟但不適合常規使用。所有的陽離子交換色譜法對pH和溫度的變化敏感，因此要控制pH和溫度。
說明：根據紅細胞代謝動力學推測初始HbA1c值大約每日破壞1/120（≈0.83%）。因為糖化在合適的治療下甚至健康人也產生，故這個理論值在體外不能達到。控制不理想的糖尿病患者通過加強治療而達到血糖量正常，可以發現HbA1c值最大下降率以大約每10 d下降正常血糖的1%（絕對的）。由於測定糖化血紅蛋白方法的精確性，兩次測定值HbA1c的差異大約1%就可認為具有臨床相關性。因為這些原因，在HbA1c兩次測定間至少有2周的時間，推薦4～6周的間隔。
因為升高的糖化血紅蛋白值是長期高糖血症的糖尿病患者相當可靠的指示劑，因而是可能診斷糖尿病的。在未治療的個體，正常的糖化血紅蛋白值臨床上可以排除明顯的糖尿病。但由於它不能檢測糖耐量受損，所以作為診斷和（或）篩選目的唯一的參數，使用糖化血紅蛋白是存在問題的。
2、電泳法
原理：相比於非糖化血紅蛋白，因糖化而變化的總電荷和糖化血紅蛋白的等電點變化是瓊脂糖凝膠或者pH梯度5.0～6.5的凝膠等電聚焦電泳分離的基礎。瓊脂糖凝膠電泳的血紅蛋白亞組分解析度很小，而等電聚焦可以更好地使亞組分分離。可能由於試驗的自動化程度不足，重要性已經下降。
3、親和層析法
原理：硼酸結合順式-羥基。商品化的m-氨基苯硼酸瓊脂糖共價結合的親和柱已可用於微柱分析檢測。將血樣本中的血紅蛋白加到層析柱後，所有的糖化血紅蛋白（HbA1和旁鏈糖化的血紅蛋白；總糖化血紅蛋白）與硼酸結合而非糖化血紅蛋白通過層析柱可被測量。在加入高濃度也包含順式-羥基的多羥基復合物，例如山梨醇後，糖化血紅蛋白與硼酸的結合被替換而從柱子上洗脫下來。親和層析法對經翻譯以後修飾的血紅蛋白和病理血紅蛋白的影響相對不敏感。利用親和層析法，僅能測定總糖化血紅蛋白。廣泛使用的親和層析方法，允許用經驗演算法從總糖化血紅蛋白值計算出「標準的HbA1c」。
4、免疫分析法
在纈氨酸β-N-末端糖化的血紅蛋白提供了一個容易被抗體識別的抗原表位。可以用單克隆抗體或多克隆抗體進行放射免疫分析和免疫酶學分析測定，抗體特異識別β鏈N-末端糖化的血紅蛋白最後4～8個氨基酸組成的抗原表位。異常的血紅蛋白或翻譯後經修飾的血紅蛋白無干擾。
目前的免疫化學試驗不僅檢測HbA1c，通常也同時檢測HbA2c，因為血紅蛋白A2糖化δ鏈的表位是相同的。抗體直接抗β-鏈的最後四個氨基酸的糖化表位的免疫化學試驗也可用進行檢測，例如HbS1c。在大多數情況下HbA2c意義不大，雖然鐮刀細胞病時可以准確地測定纈氨酸β-N-氨基末端糖化程度，但它仍不能100%代表HbA1c。
5、離子層析法
離子層析法精密度高、重復性好且操作簡單, 被臨床廣泛採用。檢測原理由於血紅蛋白β-鏈N 末端纈氨酸糖化後所帶電荷不同, 在偏酸溶液中總糖化血紅蛋白( GH b) 及H bA 均具有陽離子的特性, 因此經過陽離子交換層析柱時可被偏酸的緩沖液平衡過的樹脂來吸附, 但二者吸附率不同, GH b正電荷較少吸附率較低, H bA 正電荷較多吸附率較高。用不同pH 的磷酸鹽緩沖液可以分次洗脫出GH b 和H bA, 用KCN 可將H b轉化為高鐵氰化血紅蛋白, 用分光光度計測定。或者得到相應的H b層析譜, 其橫坐標是時間, 縱坐標是百分比。HbA1c值以百分率來表示。現在大部分都用全自動測定儀測定。
6、等電點聚集法
是測定GH b的新技術, 它是在聚丙烯酞凝膠中加人載體兩性介質的薄板上形成一個由陽極到陰極逐漸增加的pH 梯度, 溶血液中各個組份將移動到各自的等電點的pH 位置上, 這樣就得到比一般電泳法更好的分劃效果和比較集中的色帶, 通過解析度高的微量光密度儀掃描, 可以准確地測定出各自組份的含量。由於它能夠分辨出一級結構不同的HbA、HbAc、HbF、HbS 及HbC等, 可完全避開各種物質的干擾。
7、化學發光法
採用離子捕捉免疫分析法, 應用抗原抗體反應原理, 聯以熒游標記物, 通過連接帶負電的多陰離子復合物, 吸附到帶正電的纖維表面, 經過一系列徹底清洗等步驟後, 測定熒光強度變化率, 計算濃度。採用專用試劑包和免疫發光分析儀,其檢測系統易於規范和重復, 可減少操作技術誤差, 檢測的靈敏度和特異性高, 批內、批間變異系數小, 回收率高, 准確度高, 交叉污染率小, 影響因素少。
8、酶法
原理為用特殊蛋白酶分解Hb, 3~ 5 min內果糖基氨基酸從H b分離, 果糖基氨基酸氧化酶( FAOD )從果糖基氨基酸產生H2O2, H2O2經POD與DA- 64反應, 選擇751 nm 測吸光度改變求得GHb濃度。

⑸ 純水和超純水的pH值該如何檢測

1、攪拌速度：PH值反映的是H+的活度，(H+)而不是H+的濃度[H+]，其關系為(H+)=f×[H+]。F為H+的活度系數。它是由溶液中所有離子的總濃度決定而不只決定於被測離子的濃度。在理論純水中活度系數f等於1，但只要有其它離子存在，活度系數就要改變，PH值也就會改變。即PH值受溶液中總的離子濃度的影響，總離子濃度變化，PH值就要改變。由於復合電極液接界很靠近PH敏感玻璃球泡，從液接界滲漏出的鹽橋溶液首先聚集在敏感球泡周圍，改變了其附近的總離子濃度，由上述原因可知，使用測量值只是敏感球泡附近的被改變了PH值，不能反映其真實的PH值。雖然採用攪拌或搖動燒杯的方法可以改變這種情況，但實踐證明，攪拌速度不同，測試的值也會不一樣，同時攪拌或搖動又會加速CO2的溶解，所以也不可取。 2、高濃度3mol/L的Kcl：由於純水中離子濃度非常低，而參比電極鹽橋溶液選中高濃度3mol/L的Kcl，相互之間的濃度差較大，與它在普通溶液中的情況差別很大。在純水會加大鹽橋溶液的滲透速度，促使鹽橋的損耗，從而加速了K+和CL-的濃度的降低。引起液接界電位的變化和不穩定，而Ag/AgCl參比電極本身的電位取決於CL-的濃度。CL-濃度發生了變化，其參比電極自身電位也會隨之變化，於是就使得示值漂移，特別是不能補充內參比液的復合電極更會如此。 3、Kcl濃度的降低：為了保證復合電極的pH零電位，鹽橋必須採用高濃度的Kcl，同時為了防止Ag/AgCl鍍層被高濃度的Kcl溶解，在鹽橋中又必須添加粉末狀的AgCl，使鹽橋溶液被AgCl飽和。但是根據上述第1條所述，由於鹽橋溶液中Kcl濃度的降低，又使原本溶解在其中的AgCl過飽和而沉澱，從而堵塞液接界。 4、易受污染：純水很容易受到污染，在燒杯中敞開測量，很容易受到CO2吸收的影響，PH值會不停地往下降，有關國際標准規定測量必須在一個特殊的裝置中密閉中進行，但在一般實驗室中難於實行。

⑹ 氣相色譜的方法驗證怎麼做

轉載《分析測試網路網》

色譜方法通常用於原料、葯物、葯物制劑和生物體液中化合物的定性和定量。涉及的成分包括手性的或非手性的葯物、過程雜質、殘留溶媒、附加劑如防腐劑、分解產物、從容器和密閉包裝或製造過程中帶入的可提取和可過濾的雜質、植物葯中的農葯和代謝物等。
試驗方法的目的是得到可信賴的和准確的數據，無論是用於驗收、出廠、穩定性或葯物動力學研究。得到的數據用於葯品開發或批准後的定性和定量，試驗包括原料的驗收、葯物和葯物制劑的出廠、過程檢驗(In- process testing)的質量保證和失效期的建立。
方法的驗證是由葯品的開發者或使用者來檢驗其方法是否達到預期的可靠性、准確度和精密度的過程。得到的數據成為方法的驗證資料的一部分交給CDER.。
方法的驗證對於完成機構滿足檔案要求不是一次性的，開發者和使用者都應驗證其方法的耐用度或耐久性(ruggedness or robustness.)，其他的分析者、用其它相當的儀器，在其它的日期或地點，在葯品生產期限(有效期)全過程，方法都應能夠重現。如果產生數據的方法是可靠的，那麼所得到的驗收、出廠、穩定性或葯物動力學的數據就是可信賴的。驗證的過程和方法的設計應在開發過程中重要的數據產生之前，如果方法改變了，還應該再驗證。
. 色譜類型
色譜是一種盯寬技術，通過該技檔則悔術，樣品中的組分載入液相或氣相中，通過在固定相上由吸附—解吸附來完成。
A. 高效液相色譜 (HPLC)
HPLC分離是基於在樣品在流動相液體和固定相之間的不同分配。一般地說HPLC大體分為以下幾種(未考慮其重要性順序)
1. 手性液相色譜
2. 離子交換色譜
3. 離子對/親和色譜
4. 正相色譜
5. 反相色譜
6. 分子排阻色譜
1. 手性液相色譜
分離光學異構體可在手性固定相上，用衍生化試劑或在非手性固定相上用流動相添加劑形成非對對映體來實現。用作雜質試驗方法時，如果光學異構體雜質在光學異構體葯物之前洗脫，要增加靈敏度。
2. 離子交換色譜
分離基於荷電功能團，樣品負離子(X - )為陰離子，樣品正離子((X + )為陽離子，一般用pH程序洗脫。
3. 離子對/親和色譜
分離基於與目標樣品的專一的化學相互作用。更普遍的反相型用緩沖液和加入的對離子(與被分離的樣品荷相反電荷)分離。分離受pH、離子強度、溫度、濃度和共存的有機溶劑類型的影響。親和色譜，一般用於大分子，使用配合體(共價結合在固體基質上的生物活性分子)，與其同類的抗原(分析介質)反應，生成可逆轉的復合物，通過改變緩沖條件洗脫。
4. 正相色譜
正相色譜為用有機溶劑為流動相和極性的固定相。此時較小極性的組分比較大極性組分更快地洗脫。
5. 反相色譜
報給CDER的最通常的實驗方法是反相HPLC方法， 最通常用紫外檢測器。
反相色譜，一種鍵合相的色譜技術，用水作基本溶劑，選擇性也受溶劑強度、柱溫和pH的影響，一般來說較大極性比較小極性組分洗脫更快。
紫外檢測器可以用於所有色譜，這類檢測器要注意的是燈老化後的靈敏度降低，其靈敏度因(儀器)的設計和/或者製造廠家的不同有小的變異。需要指出，用紫外檢檢測器和反相HPLC組合得到的色譜圖不一定能真實的反映事實，原因是：
•極性比目標化合物大得多的化合物可能被掩蓋(在溶劑前沿或死體積時同時洗脫)。
•極性比目標化合物小得多的化合物洗脫出來晚，甚至保留在柱上。
•紫外吸收系數較低和最大吸收不同的化合物在檢測相對較低濃度的目標分析物時不能被檢出，因為通常只有一個檢測波長。
6. 排阻色譜
也叫凝膠滲漉(permeation)或濾過，分離基於化合物分子大小或水動力學(hydrodynamic)容積。比多孔柱填料孔徑大得多的分子最先洗脫，小分子進入孔隙洗脫晚，其餘的洗脫速率取決於其分子的相對大小。
B. 氣相色譜(GC)
氣相色譜基於揮發性樣品由作為流動相的載氣運載，通過色譜柱內的固定相行正時發生吸附和解吸附過程進行分離。
通常氣相色譜分析的樣品是低分子量化合物，這些化合物是易揮發的和高溫時穩定的。在這一方面，葯物和葯物制劑中的殘留溶劑適於氣相色譜分析。生成化學衍生物可達到易揮發和熱穩定的目的。
常用的檢測器是用於含碳化合物的火焰離子化檢測器(FID)，用於鹵代化合物的電子捕獲式檢測器(ECD)，用於含硫和含磷化合物的火焰光度檢測器 (FPD)，以及用於含氮或磷化合物的氮磷檢測器(NPD)。氣相色譜也能實現手性分離。填充柱迅速被毛細管取代來改進分離度和分析時間，在氣相色譜上分析物位置與HPLC一樣，用保留時間(Rt)表示。
C. 薄層色譜(TLC)
薄層色譜是一種最簡便普通的色譜技術，分離基於在一端浸於溶劑混合物(流動相)中的薄層板(固定相)上點的樣品移動進行分離，整個系統在密封的缸中進行。
對於本身沒有顏色的化合物，檢出技術包括熒光、紫外和噴霧顯色劑(通用的和專一的)。 分析物在薄層板上的位置用Rf值來表示，Rf值為化合物的移動距離與溶劑前沿的比值。
三種方法，氣相、液相和薄層中，薄層色譜是最普通的試驗方法，因為薄層板上所有的組分都可用適宜的檢測技術檢出。然而通常不如HPLC那麼准確和靈敏。雖然選用適宜的檢測技術，TLC法能見到分析的「全圖」(whole picture) ，但比HPLC分析變異較大。
. 參考標准品(對照品)
參考標准品為經充分鑒定的高純度化合物，色譜方法更大程度上依賴參考標准品來提供准確的數據。因而參考標准品的質量和純度是很重要的，有二類參考標准品，化學的和放射性的。後者應考慮放射標記純度和化學純度。
按照提交方法驗證的樣品和分析數據，指南中的二類化學參考標准品如下：
• USP / NF參考標准品，不需要鑒定。
• 非總目錄標准品，應用合理方法制備，並經充分鑒定，以保證其鑒別、含量、質量和純度達到最高。
應該指出
• 大多數USP / NF參考標准品未標示化合物純度。
• 對非USP參考標准品，提出純度的校正數應包括在試驗方法的計算中。
• 提供的參考標准品中沒有以下雜質，諸如合成過程的結構相似的雜質和其它的過程雜質，如重金屬、殘留溶劑、水分(結合的和非結合的)、植物來源制劑中的農葯和分解產物等。
• 如果在方法中規定，用前參考標准品要乾燥除去殘留溶劑、非結合水分和有時是結合水(取決於乾燥條件)，對易潮解的化合物總是包括乾燥步驟的。但另一方面乾燥可能導致結晶水的損失或引起熱敏感化合物的降解。
色譜方法用外標法和內標法進行定量。
A. 外標法
當參考標准品與樣品在不同的色譜圖上進行分析時，用外標法。定量基於樣品的峰面積/高(HPLC或GC)或強度(TLC)與分析對象、參考標准品的比值。
更適合用外標法的樣品如下：
1.樣品具有單一的目標濃度和狹窄的濃度范圍 ，例如驗收和出廠檢驗。

2.簡便的樣品制備操作。
3. 增加走基線的時間，為檢測可能的額外峰，如雜質試驗。
B. 內標法
加入一種已知純度並且在分析中不產生干擾的化合物至樣品混合液中，定量基於被分析的化合物與內標的響應比值與參考標准品得到的比值進行比較。這一方法很少用於TLC。
更適合用內標法的樣品如下：
1.復雜的樣品制備過程，如多次提取。
2.低濃度的樣品(靈敏度是確定的)，如葯代動力學的研究。
3.在樣品分析中預計是很寬的濃度范圍，如葯物動力學研究。
雖然CDER不規定方法應該用內標或外標法用於定量，但一般的看法是用於驗收、穩定性和TLC用外標法，對生物體液和GC用內標法。
工作濃度為方法中規定的被分析對象的目標濃度。保持樣品濃度與標準的濃度相近可以改善方法的准確性。
建議
1.如果參考標准品的純度校正因子已知，那麼在計算中應該包括。
2.在方法中要規定標准品和樣品的工作濃度。
. 葯物和葯物制劑HPLC驗證的參數
雖然許多種HPLC都可採用，但最普遍上報的方法都是用紫外檢測器的反相HPLC法，以此作為驗證參數的例子。這一方法驗證的規定可以擴展到其它檢測器和其它色譜。對於驗收、出廠或穩定性試驗，准確性應最佳化，因為要表明實測值和真值的差異是最為關注的。
A. 准確性
准確性是衡量測量實驗值和真值的接近程度。推薦葯物和葯物制劑的准確性研究在標示量的80%、100%和120%的水平上來進行的，這與「The Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for method Validation」的規定是一致的。
對於葯物制劑，准確性試驗通常是將已知量的葯物 [按重量或體積(溶於稀釋劑)] 以分析對象檢測濃度的線性范圍量加到空白處方內來完成的。對於液體制劑，這是真實的回收率；而對於諸如片劑、栓劑、透皮吸收制劑等，這不能檢測稀釋劑中的賦形劑與活性成分間可能產生的作用。實際上要做一個已知活性葯物量的單個劑量單位(single unit)來進行回收試驗是困難的。准確性試驗評價在賦形劑存在時，在分析葯物制劑的色譜條件下，試驗方法的專屬性。但這只是樣品制備過程和色譜過程中的回收率，而不是製造過程的影響。
在每個推薦檢測濃度重復進樣，其重復進樣的RSD提供了分析方法的變動性，或是試驗方法的精密程度。重復性的均值以標示量的%來表示

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⑺ 請說明下液相色譜的原理以及操作時候的注意點

原理：
高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9´107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高於經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱後連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。
特點

1．高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×105Pa。
2. 高速：流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少於 1h 。
3. 高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。
4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛採用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。
5.適應范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難於應用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能製成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對於高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大於 400 以上）的有機物（這些物質幾乎佔有機物總數的 75% ～ 80% ）原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。 據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約佔20%，而能用液相色譜分析的約佔70～80%。

高效液相色譜按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、解析度高、重復性好，且須在色譜儀中進行。
高效液相色譜法的主要類型及其分離原理
根據分離機制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：

1 ．液 — 液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography)

流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從於下式：

式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。

a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性。

b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性。

c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。

2 ．液 — 固色譜法

流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：

Xm + nSa ====== Xa + nSm

式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。

當吸附競爭反應達平衡時：

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]

3 ．離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography)

IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。

以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：

X-(溶劑中) + (樹脂-R4N+Cl-)=== (樹脂-R4N+ X-) + Cl- (溶劑中)

當交換達平衡時：

KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]

分配系數為：

DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]

[討論：DX與保留值的關系]

凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。

4 ．離子對色譜法(Ion Pair Chromatography)

離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原理可用下式表示：

X+水相 + Y-水相 === X+Y-有機相

式中：X+水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X+Y---形成的離子對化合物。

當達平衡時：

KXY = [X+Y-]有機相/[ X+]水相[Y-]水相

根據定義，分配系數為：

DX= [X+Y-]有機相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相

[討論：DX與保留值的關系]

離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及葯物等分離。

5 ．離子色譜法(Ion Chromatography)

用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。

以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）：

抑制柱上發生的反應：

R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-

可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H+Br-，可用電導法靈敏的檢測。

離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
6 ．空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography)

空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。

高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、．分離系統、檢測系統和數據處理系統，下面將分別敘述其各自的組成與特點。

1．進樣系統

一般採用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恆定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。

2．輸液系統

該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l．47～4．4X107Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高解析度、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。

3.分離系統

該系統包括色譜柱、連接管和恆溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內徑為2～5mm，由"優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成，住內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成）．固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表面積大的特點，加之其表面經過機械塗漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學法偶聯各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）後，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。

另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、緻密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高解析度是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高解析度的道理。

再者，高效液相色譜的恆溫器可使溫度從室溫調到60C，通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。

4．檢測系統

高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。

（1）紫外檢測器

該檢測器適用於對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣（如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10g／ml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。

（2）示差折光檢測器

凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7g／ml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用於痕量分析，也不適用於梯度洗脫樣品的檢測。

（3）熒光檢測器

凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用於具有熒光的有機化合物（如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可採用。

（5）數據處理系統

該系統可對測試數據進行採集、貯存、顯示、列印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。

操作注意要點：

1)． 首先對流動相進行過濾，根據需要選擇不同的濾膜，一般為有機系和水系，常用的孔徑為0.20um和0.45um。
2)． 對抽濾後的流動相進行超聲脫氣10-20分鍾。
3)． 正常情況下，儀器首先用甲醇沖洗10-20分鍾，然後再進入測試用流動相(如流動相為緩沖試劑，則要二次重蒸水沖洗10-20分鍾，直至色譜柱中有機相沖凈為止) 。
4)． 一般情況下，流動相沖洗20-30分鍾後，儀器方可穩定，最重要的是儀器基線走後，方可進樣測試。
5)． 同時進兩針標樣，將其結果相比較，其結果的比值在0.98-1.02之間後，就可以正式進行樣品的測試了。
6)． 樣品測試結束後，就要進行色譜儀及色譜柱的清洗和維護。如流動相為緩沖試劑，同樣也要用重蒸水清洗10-20分鍾，方可用有機相進行保護，否則，有損色譜柱。
7)． 關機時，先關計算機，再關液相色譜。
8)． 填寫登記本，由負責人簽字。

注意事項：
1)． 流動相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣後的流動相要小心振動盡量不引起氣泡。
2)． 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。
3)． 所有過柱子的液體均需嚴格的過濾。
4)． 壓力不能太大，最好不要超過150kgf/cm2 .
5). 因為緩沖試劑遇有機溶劑，會結晶，有損色譜柱，所以，每次由有機相變流動相或流動相變有機相均需用蒸餾水清洗。

⑻ 液相色譜原理

原理主要有這幾種：
液—液分配色譜法
(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從於高效液相色譜計算公式： 高效液相色譜計算公式
式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。 a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性。 b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性。 c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。
液—固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm 式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。 當吸附競爭反應達平衡時： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]
離子交換色譜法
(Ion-exchange Chromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流 離子交換色譜柱
動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) (樹脂-R4N Cl-)=== (樹脂-R4N X-) Cl- (溶劑中) 當交換達平衡時： KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-] 分配系數為： DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-] [討論：DX與保留值的關系] 凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
離子對色譜法
(Ion Pair Chromatography) 離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原 離子色譜儀流程示意
理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有機相 式中：X 水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X Y---形成的離子對化合物。 當達平衡時： KXY = [X Y-]有機相/[ X ]水相[Y-]水相 根據定義，分配系數為： DX= [X Y-]有機相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相 [討論：DX與保留值的關系] 離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及葯物等分離。
離子色譜法
(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。 以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）： 擔體圖示
抑制柱上發生的反應： R-H Na OH- === R-Na H2O R-H Na Br- === R-Na H Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H Br-，可用電導法靈敏的檢測。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
空間排阻色譜法
(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。
分析方法：
綜述
色譜柱的填料和流動相的組分應按各品種項下的規定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠。後者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用,辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料,用於離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用於分子排阻色譜等。注樣量一般為數微升。除另有規定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。 在用紫外吸收檢測器時,所用流動相應符合紫外分光光度法項下對溶劑的要求。 正文中各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進化學鍵合固定相反應
樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變, 以適應具體品種並達到系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約於20分鍾內記錄完畢。 2.系統適用性試驗 按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整,應達到規定的要求；或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數、分離度和拖尾因子.
色譜柱的理論板數
在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖化學鍵合固定相應用
，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n＝5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計算色譜柱的理論板數，如果測得理論板數低於各品種項下規定的最小理論板數，應改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優劣等），使理論板數達到要求。
分離度
定量分析時，為便於准確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計算公式為： 2[t(R2)-t(R1)] ，R＝ -W1＋W2 式中 t(R2)為相鄰兩峰中後一峰的保留時間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另外有規定外，分離度應大於1.5。
拖尾因子
為保證測量精度，特別當採用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規定,或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為： W(0.05h) T＝-2d1 式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規定外，T應在0.95～1.05間。 也可按各品種校正因子測定項下，配製相當於80％、100％和120％的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次,計算平均校正因子，其相對標准偏差應不大於2.0％。

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