融合蛋白離子交換電荷異質性

❶ 常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種各自的作用原理是什麼

常用的蛋白質純化方法有離子交換色譜、親和色譜、電泳、疏水色譜等等
1.
離子交換色譜：蛋白質和氨基酸一樣會兩性解離，所帶電荷決定於溶液ph。ph小於pi時蛋白質帶正電，ph大於pi時蛋白質帶負電。不同蛋白質等電點的蛋白質在同一個溶液中，表面電荷情況不同。離子交換就是利用不同蛋白質在同一溶液中表面電荷的差異來實現分離的。
2.
親和色譜：生物大分子有一個特性，某些分子或基因對它們有特異性很強的吸附作用。如鎳柱中ni可以與his標簽的蛋白結合，這種只針對一種或一類物質的吸附就是親和色譜的原理。
3.
電泳：sds-聚丙烯醯胺凝膠電泳，sds能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的sds溶液中，
與sds分子按比例結合，形成帶負電荷的sds-蛋白質復合物，這種復合物由於結合大量的sds，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態形成僅保持原有分子大小為特徵的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由於sds與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決於分子大小。
4.
疏水色譜：疏水色譜基於蛋白質表面的疏水區與介質疏水配體間的相互作用，在高濃度鹽作用下，蛋白質的疏水區表面上有序排列的水分子通過鹽離子的破壞被釋放，裸露的疏水區與疏水配體相互作用而被吸附。疏水色譜就是利用樣品中各組分在色譜填料上配基相互作用的差異，在洗脫時各組分移動速度不同而達到分離的目的。隨著鹽離子濃度的降低，疏水作用降低，蛋白質的水化層又形成，蛋白質被解吸附。

❷ 離子交換層析的原理是什麼 已解決

離子交換層析法是從復雜的混合物中，分離性質相似大分子的方法之一，依據的原理是物內質的酸鹼性容，極性，所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質就能依次從層析柱中分離出來。

層析開始前，功能基團與反離子穩定結合，就與反離子發生可逆交換，與層析劑結合被固定下來。因為鹽離子可以與底物競爭功能基團，鹽濃度越高樣品與層析劑結合越不緊密，易被洗脫下來。不同物質與層析劑結合程度不同，洗脫下來的時間不同，因此得以分開。

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離子交換劑的選擇首重保持欲分離物質的生物活性，以及在不同pH值環境中，此物質所帶的電荷和電性強弱，陰陽離子交換劑的選擇若被分離物質帶正電荷，這些鹼性蛋白質，它們在酸性溶液中較穩定，親和力強，故採用陽離子交換劑。

在鹼性溶液中較穩定，則使用陰離子交換劑，如果欲分離的物質是兩性離子，一般考慮在它穩定的pH范圍帶有何種電荷，作為交換劑的選擇。離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生，若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌。

❸ 離子交換介質的結構

使用離子交換色譜進行細分級分離是較為常見的一種蛋白純化方式。它是根據蛋白質的電荷不同來分離蛋白質混合物，被分離的目的蛋白所攜帶的電荷能與離子交換劑中所帶的相反電荷相結合，而且這兩者之間的結合作用是可逆的，通過逐漸增加離子強度或改變洗脫液PH值的方式處理色譜柱，離子交換劑上結念差合的目的蛋白便可與洗脫液中的離子發生交換而被洗脫到溶液當中。由於不同蛋白質的電荷不同，其與離仔則皮子交換劑的結合能力也不同，所以根據蛋白洗脫到溶液中的先後順序來進行提取，就可以輕松分離出我們需要的目標蛋白。

離子交換劑的介質種類還可分為離子交換樹脂、離子交換纖維素和離子交換凝膠等。強離子交換樹脂保持離子化的PH值范圍較寬，而弱離子交換樹脂若想保持離子化，就只能在很窄的PH值范圍內進行處理。離子交換色譜的優點是具有極高的解析度，因此可以通過放大規模的方式直接應用於工業生產中。盯返根據數據統計結果可知，大多數蛋白質的靜電荷是為負值，因此陰離子交換色譜的應用在純化蛋白領域的最為廣泛。選擇離子交換介質時，首先要考慮的一點就是目的蛋白的分子大小，因為蛋白分子的大小不但會影響介質上的帶電基團，還會影響介質對蛋白分子的動力載量，從而影響分離的效果和速度。

❹ 蛋白質的分離純化技術有哪些

蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的 SO4 和 NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液 pH 在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4 度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25 度）比 0 度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH 值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在 2.5-3.0%。蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25 度時飽和溶液為 4.1M，即 767 克/升；0 度時飽和溶解度為 3.9M，即 676 克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之間，當用其他 pH 值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常
用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠 G-25 或 G-50 過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的 pH 達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同 pH 環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一 pH 條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的 pH 梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的 pH 位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變 pH 或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質
從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。

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❺ 蛋白純化陰離子交換，緩沖液帶什麼電荷

既然是陰離子交換，就要讓目標蛋白帶負電，那麼緩沖液PH就要大於等電點。緩沖體系的選擇也很重要，一般用TRIS-HCl，特別是弱陰離子柱不可選用帶負電強的磷酸鹽緩沖液，否則上樣液中被交換的將是磷酸根而不是目標蛋白。一般用NaCl平衡後上樣進行離子交換，然後再用較強的陰離子洗脫。