離子交換吸附固定化酶的缺點

A. 什麼是固定化酶有何優點如何制備固定化酶

什麼是固定化酶？有何優點？如何制備固定化酶
1固定化酶的傳統制備方法
1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法,將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖類或多孔玻璃、離子交換樹脂等載體上的固定方式.
顯著特點是：
工藝簡便及條件溫和,包括無機、有機高分子材料,
吸附過程可同時達到純化和固定化；
酶失活後可重新活化,
載體也可再生.
但要求載體的比表面積要求較大,有活潑的表面
1.2包埋法
包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子結構或微囊結構等多空載體中,而底物仍能滲入格子或微囊內與酶相接觸.這個方法比較簡便,酶分子僅僅是被包埋起來,生物活性被破壞的程度低,但此法對大分子底物不適用.
(1)網格型
將酶或包埋在凝膠細微網格中,製成一定形狀的固定化酶,稱為網格型包埋法.也稱為凝膠包埋法.
(2)微囊型
把酶包埋在由高分子聚合物製成的小球內,製成固定化酶.由於形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米,所以也稱為微囊化法.
1.3結合法
酶蛋白分子上與不溶性固相支持物表面上通過離子鍵結合而使酶固定的方法,叫離子鍵結合法.其間形成化學共價鍵結合的固定化方法叫共價鍵結合法.共價鍵結合法結合力牢固,使用過程中不易發生酶的脫落,穩定性能好.
該法的缺點是載體的活化或固定化操作比較復雜,反應條件也比較強烈,所以往往需要嚴格控制條件才能獲得活力較高的固定化酶.
1.4交聯法
交聯法是用多功能試劑進行酶蛋白之間的交聯,使酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵,得到三向的交聯網架結構,除了酶分子之間發生交聯外,還存在著一定的分子內交聯.多功能試劑制備固定化酶方法可分為：
(1) 單獨與酶作用；
( 2) 酶吸附在載體表面上再經受交聯；
( 3) 多功能團試劑與載體反應得到有功能團的載體,再連接酶.交聯劑的種類很多,最常用的是戊二醛,其他的還有異氰酸衍生物、雙偶氮二聯苯胺、N,N-乙烯馬來醯亞胺等.
交聯法的優點是酶與載體結合牢固,穩定性較高；缺點是有的方法固定化操作較復雜,進行化學修飾時易造成酶失活
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競爭性抑制劑與被抑制的酶的底物通常有結構上的相似性,能與底物競相爭奪酶分子上的結合位點,從而產生酶活性的可逆的抑製作用.與酶的活性中心相結合.與酶的結合是可逆的.
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增大底物濃度可以減弱競爭性抑制劑的影響.

B. 為什麼要進行酶的固定化方法有哪些各有何優缺點

用物理或化學方法處理水溶性的酶使之變成不溶於水或固定於固相載體的但仍具有酶活性的酶衍生物，便於與反應物分離，並能可重復使用。提高生成物的質量。

與自然酶相比，固定化酶和固定化細胞具有明顯的優點（也就是為什麼要進行酶的固定化）： 一、可以做成各種形狀如顆粒狀、管狀、膜狀，裝在反應槽中便於取出，便於連續、反復使用。
二、穩定性提高，不易失去活性，使用壽命延長。
三、便於自動化操作，實現用電腦控制的連續生產。
方法：物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化學法包括結合法、交聯法。
各種方法優缺點
1·吸附法 ：利用各種吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定的方法。 常用吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 採用吸附法固定酶，其操作簡便、條件溫和，不會引起酶邊形或失活，且載體廉價易得，可反復使用。
2·包埋法 酶被裹在凝膠的細格子中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微膠囊型兩種。優點酶包埋在聚合物中不易漏出;操作條件溫和、對外界環境的緩沖作用大，可防止酶體的機械損傷,易於再生,產物分離提取容易。3·共價結合法（屬化學法中的結合法）即酶蛋白的非必需基團通過共價鍵和載體形成不可逆的連接。共價結合法酶與載體之間結合緊密，不易脫落，穩定性好，但反應條件激烈，操作復雜，控制條件苛刻，活力損失較大
4·交聯法 依靠雙功能團試劑使酶分子之間發生交聯凝集成網狀結構，使之不溶於水從而形成固定化酶，此法制備的細胞與載體結合緊密，但制備麻煩，活力損失較大

C. 什麼是固定化酶有何優點

所謂固定化酶，是指在一定的空間范圍內起催化作用，並能反復和連續使用的酶。通常酶催化反應都是在水溶液中進行的，而固定化酶是將水溶性酶用物理或化學方法處理，使之成為不溶於水的，但仍具有酶活性的狀態。

酶固定化後一般穩定性增加，易從反應系統中分離，且易於控制，能反復多次使用。便於運輸和貯存，有利於自動化生產，但是活性降低，使用范圍減小，技術還有發展空間。固定化酶是近十餘年發展起來的酶應用技術，在工業生產、化學分析和醫葯等方面有誘人的應用前景。

(3)離子交換吸附固定化酶的缺點擴展閱讀：

固定化酶的制備方法有物理法和化學法兩大類。

物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的優點在於酶不參加化學反應,整體結構保持不變,酶的催化活性得到很好保留。但是,由於包埋物或半透膜具有一定的空間或立體阻礙作用,因此對一些反應不適用。

化學法包括結合法、交聯法。結合法又分為離子結合法和共價結合法。是將酶通過化學鍵連接到天然的或合成的高分子載體上,使用偶聯劑通過酶表面的基團將酶交聯起來,而形成相對分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。

D. 酶的固定化方法主要有哪些

包埋法化學結合法 物理吸附法

E. 固定化細胞和固定化酶比較，2個的優缺點

固定化酶:固定化酶的研究已取得大量重要成果。其重要原因是它和水溶性酶比較具有以下優點：1.
極易將固定化酶與底物、產物分開；產物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝。2.
可以在較長時間內反復使用，有利於工藝的連續化、管道化。3.
酶反應過程可以嚴格控制，有利於工藝自動化和微電腦化。4.
在絕大多數情況下提高了酶的穩定性。5.
能較好地適應於多酶反應。6.
酶的使用效率提高，產物得率提高，產品質量有保障，成本低。固定化酶也存在一些缺點：1.酶固定化時酶的活力有所損失。同時也增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。2.比較適應水溶性底物和小分子底物。3.與完整細胞比較，不適於多酶反應，特別是需要輔因子的反應，同時對胞內酶需經分離後才能固定化。酶的固定化方法酶的固定化方法有：吸附法、共價鍵結合法、交聯法和包埋法。固定化細胞是在固定化酶的基礎上發展起來的。它的優點如下:1.
省去了酶的復雜分離過程，自身即為多酶系統，無須輔因子再生。2.
細胞生長快、數量多、反應快。3.
可以連續發酵，節約成本，而且在蒸餾和提取前不用分離除去細胞，因此可一邊排出發酵液，一邊進行培養，消除了產物抑制和消耗。4.
保持酶在細胞內的原始狀況，增加了酶的穩定，特別是對污染因子的抵抗力增強。固定化細胞同時也存在—些缺點：1.
必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產品純度。2.必須防止細胞內蛋白酶對所需酶的分解，同時，需抑制胞內其他酶的活性止副產物的形成。3.細胞膜、壁會阻礙底物滲透和擴散。菌體細胞的固定方法基本上沿用酶的固定化方法，主要有包埋法、吸附法和加熱固定法；動植物細胞一般比菌體嬌嫩，一般選用吸附法和包埋法，尤其是動物細胞更為嬌嫩，以吸附法居多。

F. 酶、細胞、原生質體固定化

酶的一些不足之處：
（1）酶的穩定性較差
（2）酶的一次性使用
（3）產物的分離純化較困難
◆改善方法之一就是固定化技術的應用:
(1)固定化酶是指固定在一定載體上並在一定的空間范圍內進行催化反應的酶.固定化酶既保持了酶的催化特性,又克服了游離酶的不足之處,具有增加穩定性,可反復或連續使用以及易於和反應產物分開等顯著優點.
(2)固定化細胞是指固定在載體上並在一定的空間范圍內進行生命活動的細胞.也稱為固定化活細胞或固定化增值細胞.通常只能用於胞外酶等胞外產物的生產.
(3) 固定化原生質體技術,有利於胞內物質的分泌.
1. 酶固定化
◆採用各種方法,將酶與水不溶性的載體結合,制備固定化酶的過程稱為酶的固定化.固定在載體上並在一定的空間范圍內進行催化反應的酶稱為固定化酶.
◆固定在載體上的菌體或菌體碎片稱為固定化菌體,它是固定化酶的一種形式.
1.1酶的固定化方法
固定化的方法：吸附法、包埋法、結合法、交聯法和熱處理法等.
(1)吸附法：
◆利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上,而使酶固定化的方法稱為物理吸附法,簡稱吸附法.
◆物理吸附法常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等.
◆靠物理吸附作用,結合力較弱,酶與載體結合不牢固而容易脫落,所以使用受到一定的限制.
(2)包埋法
◆將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中,使酶固定化的方法稱為包埋法.
◆包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯醯胺、光交聯樹脂、聚醯胺、火棉膠等.
◆包埋法制備固定化酶或固定化菌體時,根據載體材料和方法的不同,可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法兩大類.
◇凝膠包埋法：凝膠包埋法是將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內部的微孔中,製成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體.大多數為球狀或片狀,也可按需要製成其他形狀.
常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯醯胺凝膠、光交聯樹脂等合成凝膠.
◇半透膜包埋法：半透膜包埋法是將酶包埋在由各種高分子聚合物製成的小球內,製成固定化酶.
常用於制備固定化酶的半透膜有聚醯胺膜、火棉膠膜等.
(3)結合法
◆選擇適宜的載體,使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法稱為結合法.
◆根據酶與載體結合的化學鍵不同,結合法可分為離子鍵結合法和共價鍵結合法.
◇離子鍵結合法：通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法稱為離子鍵結合法.
離子鍵結合法所使用的載體是某些不溶於水的離子交換劑.常用的有DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等.
◇共價鍵結合法：通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法稱為共價鍵結合法.
共價鍵結合法所採用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等.
酶分子中可以形成共價鍵的基團主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等.
◇要使載體與酶形成共價鍵,必須首先使載體活化,即藉助於某種方法,在載體上引進一活潑基團.然後此活潑基團再與酶分子上的某一基團反應,形成共價鍵.
◇使載體活化的方法很多.主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等.
(4)交聯法
◆藉助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯作用,製成網狀結構的固定化酶的方法稱為交聯法.交聯法也可用於含酶菌體或菌體碎片的固定化.
◆常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等.其中應用最廣泛的是戊二醛.
(5)熱處理法
◆將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間,使酶固定在菌體內,而制備得到固定化菌體.◆熱處理法只適用於那些熱穩定性較好的酶的固定化,在加熱處理時,要嚴格控制好加熱溫度和時間,以免引起酶的變性失活.
1.2固定化酶的特性
(1)穩定性:固定化酶的穩定性一般比游離酶的穩定性好.
(2)最適溫度: 固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多,活化能也變化不大.
(3)最適pH值: 酶經過固定化後,其作用的最適pH值往往會發生一些變化.
◆影響固定化酶最適pH值的因素主要有兩個,一個是載體的帶電性質,另一個是酶催化反應產物的性質.
(4)底物特異性: 固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同,其變化與底物分子量的大小有一定關系.對於那些作用於低分子底物的酶,固定化前後的底物特異性沒有明顯變化.
◆固定化酶底物特異性的改變,是由於載體的空間位阻作用引起的.
1.3固定化酶的應用
固定化酶既保持了酶的催化特性,又克服了游離酶的不足之處,具有如下顯著的優點：
（1）酶的穩定性增加,減少溫度、pH值、有機溶劑和其他外界因素對酶的活力的影響,可以較長期地保持較高的酶活力.
（2）固定化酶可反復使用或連續使用較長時間,提高酶的利用價值,降低生產成本.
（3）固定化酶易於和反應產物分開,有利於產物的分離純化,從而提高產品質量.
固定化酶已廣泛地應用於食品、輕工、醫葯、化工、分析、環保、能源和科學研究等領域.

2.細胞固定化
◆通過各種方法將細胞與水不溶性的載體結合,制備固定化細胞的過程稱為細胞固定化.(固定化活細胞或固定化增殖細胞)
◆微生物細胞、植物細胞和動物細胞都可以製成固定化細胞.
2.1細胞固定化的方法
◆主要可分為吸附法和包埋法兩大類方法.
(1)吸附法
◆利用各種固體吸附劑,將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法.
◆用於細胞固定化的吸附劑主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金屬絲網、微載體和中空纖維等.
(2) 包埋法
◆將細胞包埋在多孔載體內部而製成固定化細胞的方法稱為包埋法.
◆包埋法可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法.
◇以各種多孔凝膠為載體,將細胞包埋在凝膠的微孔內而使細胞固定化的方法稱為凝膠包埋法.
○凝膠包埋法是應用最廣泛的細胞固定化方法,適用於各種微生物、動物和植物細胞的固定化.
○凝膠包埋法所使用的載體主要有瓊脂、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠、聚丙烯醯胺凝膠和光交聯樹脂等.
2.2微生物細胞固定化
2.2.1固定化微生物細胞的特點：
①固定化微生物細胞保持了細胞的完整結構和天然狀態,穩定性好.
②固定化微生物細胞保持了細胞內原有的酶系、輔酶體系和代謝調控體系,可以按照原來的代謝途徑進行新陳代謝,並進行有效的代謝調節控制.
③發酵穩定性好,可以反復使用或者連續使用較長的一段時間.
④固定化微生物細胞密度提高,可以提高產率.
⑤提高工程菌的質粒穩定性,
2.2.2固定化微生物細胞的應用
◆主要用在兩個方面：
◇是利用固定化微生物細胞發酵生產各種胞外產物.
◇二是利用固定化微生物細胞與各種電極結合製成微生物電極.
(1)利用固定化微生物生產各種產物
(2)固定化微生物細胞製造微生物感測器
2.3植物細胞固定化
2.3.1固定化植物細胞的特點：
（1）植物細胞經固定化後,由於有載體的保護作用,可減輕剪切力和其他外界因素對植物細胞的影響,提高植物細胞的存活率和穩定性.
（2）細胞經固定化後,被束縛在一定的空間范圍內進行生命活動,不容易聚集成團.
（3）固定化植物細胞發酵可以簡便地在不同地培養階段更換不同的培養液,即首先在生長培養基中生長增殖,在達到一定的細胞密度後,改換成發酵培養基,以利於生產各種所需的次級代謝物.
（4）固定化植物細胞可反復使用或連續使用較長的一段時間,大大縮短生產周期,提高產率.
（5）固定化植物細胞易於與培養液分離,利於產品的分離純化,提高產品質量.
2.3.2 植物細胞固定化的方法：
◆植物細胞固定化的方法主要有吸附法和包埋法兩種.
◆吸附法是將植物細胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內,或者將植物細胞吸附在中空纖維的外壁上.
◆包埋法是將植物細胞包埋在瓊脂、角叉菜膠、海藻酸鈣凝膠、聚丙烯醯胺凝膠、明膠等多孔凝膠之中.包埋方法與微生物細胞包埋時基本相同.
2.3.3固定化植物細胞的應用：
◆固定化植物細胞的主要用途是製造人工種子,就有可能獲得大量具有相同遺傳特性的植株.對種質的保存具有重要意義.並可以節約種子的用量.
◆固定化植物細胞還可以用於生產各種色素、香精、葯物、酶等次級代謝物.
2.4動物細胞固定化
2.4.2固定化動物細胞的特點：
（1）提高細胞存活率：動物細胞經固定化後,由於有載體的保護作用,可以減輕或免受剪切力的影響,同時動物細胞可附著在載體表面生長,從而可顯著提高動物細胞的存活率.
（2）提高產率：動物細胞固定化後,可先在生長培養基中生長繁殖,使細胞在載體上形成最佳分布並達到一定的細胞密度.然後可簡便地改換成發酵培養基,控制發酵條件,使細胞從生長期轉變到生產期,以利於提高產率.
（3）固定化動物細胞可反復使用或連續使用較長的時間.例如,中國倉鼠卵巢細胞（CHO）生產人干擾素可以穩定地生產30天.
（4）固定化細胞易於與產物分開,利於產物分離純化,提高產品質量.
2.4.2動物細胞固定化方法：
◆動物細胞固定化地方法有吸附法和包埋法兩種.
(1)吸附法：
◆大多數動物細胞屬於附著細胞,它們在培養過程中,必須趨向於附著在固體表面.故此吸附法特別適合於動物細胞的固定化.
◆轉瓶是由玻璃或塑料製成,表面經過一定方法處理而帶上電荷.
◆微載體是指顆粒細小的固定化載體,直徑一般為100～200μm,相對密度接近1.0.是由帶有表面電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯或玻璃等材料製成.微載體已用於多種動物細胞的固定化；
◆中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物製成.
(2)包埋法
◆包埋固定化法一般適用於懸浮細胞.
◆根據載體和方法的不同,有凝膠包埋法、半透膜包埋法兩種.
①凝膠包埋法：利用各種多孔凝膠為載體將動物細胞固定化.細胞被固定在凝膠的微孔中生長繁殖和新陳代謝,由於有載體的保護,動物細胞有較好的穩定性,可顯著提高其存活率.
用於動物細胞固定化的凝膠載體主要有瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白等.
②半透膜包埋法：利用高分子聚合物形成的半透膜將動物細胞包埋,形成微囊型固定化動物細胞.
2.4.3固定化動物細胞的應用：
動物細胞中大部分為貼壁細胞,需要貼附在載體的表面才能正常生長.所以固定化動物細胞廣泛應用.特別是採用微載體對動物細胞進行吸附固定化.

3.原生質體固定化
◆固定化原生質體的制備主要包括原生質體的制備和原生質體固定化兩個階段.
3.1原生質體的制備
◆不同種類的細胞,由於各自細胞壁的組成、結構和性質不同,原生質體的制備方法也不一樣.
◆原生質體的制備過程是首先將對數生長期的細胞收集起來,懸浮在含有滲透壓穩定劑的高滲緩沖液中.然後加入適宜的細胞壁水解酶,在一定的條件下作用一段時間,使細胞壁破壞.分離除去細胞壁碎片、未作用的細胞以及細胞壁水解酶,而得到原生質體.
◆除去細胞壁所使用的酶應根據細胞壁的主要成分的不同而進行選擇.
◇細菌的細胞壁主要成分是肽多糖,所以細菌原生質體制備時主要採用從蛋清中得到的溶菌酶；
◇酵母細胞壁主要由β-葡聚糖構成,故採用β-1,3-葡聚糖酶；
◇黴菌的細胞壁組分比較復雜,除含有幾丁質外,還有其他多種組分,故要去除黴菌的細胞壁,則需有幾丁質酶與其他有關酶共同作用.
◇植物細胞壁由纖維素、半纖維素和果膠組成,故制備植物原生質體時主要應用纖維素酶和果膠酶.
◆為防止制備得到的原生質體破裂,應加入適當的滲透壓穩定劑.如：無機鹽、糖類、糖醇等化合物.
◆應選擇對數生長期的細胞制備原生質體,以獲得較高的原生質體形成率.
◆所加進的細胞壁溶解酶的種類和濃度、酶作用溫度,pH值以及作用時間等對原生質體的制備都有明顯影響,必須經過試驗確定其最佳條件.
3.2原生質體固定化
◆採用包埋法製成固定化原生質體.
◆原生質體固定化一般採用凝膠包埋法.常用的凝膠有：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠和光交聯樹脂等.
3.3固定化原生質體的特點：
(1)固定化原生質體由於解除了細胞壁這一擴散屏障,可增加細胞膜的通透性,有利於氧氣和營養物質的傳遞和吸收,也有利於胞內物質的分泌,可顯著提高產率.
(2)固定化原生質體由於有載體的保護作用,具有較好的操作穩定性和保存穩定性,可反復使用和連續使用較長的時間,利於連續化生產.在冰箱保存較長時間後仍能保持其生產能力.
(3)固定化原生質體易於和發酵產物分開,有利於產物的分離純化,提高產品質量.
(4)固定化原生質體發酵的培養基中需要添加滲透壓穩定劑,以保持原生質體的穩定性.這些滲透壓穩定劑在發酵結束後,可用層析或膜分離技術等方法與產物分離.
3.4固定化原生質體的應用
固定化原生質體一方面保持了細胞原有的新陳代謝特性,可以照常產生原來在細胞內產生的各種代謝產物,另一方面又去除了細胞壁這一擴散屏障,有利於胞內產物不斷地分泌到胞外,這樣就可以不經過細胞破碎和提取工藝而在發酵液中獲得所需的發酵產物,為胞內物質的工業化生產開辟了新途徑.
固定化原生質體可用於各種氨基酸、酶和生物鹼等物質的生產以及甾體轉化等.