『壹』 血紅蛋白凝膠過濾層析所需儀器、用具、物品和實驗的具體方案
一、實驗目的
1.了解凝膠柱層析的原理及應用；
2.掌握凝膠柱層析的基本操作技術，為進一步掌握離子交換柱層析、親和層析及吸附層析等其它分離方法打下良好的基礎。
二、實驗原理
凝膠層析：原理與應用
凝膠層析又稱凝凝膠過濾，是一種按分子量大小分離物質的層析方法。該方法是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然後用緩沖液洗脫。大分子無法進入凝膠顆粒中的靜止相中，只能存在於凝膠顆粒之間的流動相中，因而以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，並很快在流動相和靜止相之間形成動態平衡，因此就要花費較長的時間流經柱床，從而使不同大小的分子得以分離。
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凝膠過濾柱層析所用的基質是具有立體網狀結構、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質。這種物質可以完全或部分排阻某些大分子化合物於篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數Kav（被分離化合物在內水和外水體積中的比例關系）表示。Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關，即：
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恆定值，而Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值小；反之，則Kav值增大。因此，在同一凝膠柱上分離分子量不同的物質時，由於流動相的作用，這些分離物質將發生排阻和擴散效應。若緩沖液連續地傾入柱中，柱中物質的排阻和擴散效應也將連續地發生，其最終結果是分子量大的物質先從柱中流出，分子量小的物質則後從柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等時地收集起來，檢測後分段合並相同組分的各管流出物，即等於把分子量不同的物質相互分離開了。其分離效果受操作條件（如基質的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等）的影響，而最直接的影響是Kav值的差異性，Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小，則分離效果很差，或根本不能分開。
分配系數Kav既是判斷分離效果的一個參數，又是測定蛋白質分子量的一個依據。從公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要測出床體積Vt 和外水體積Vo 以及洗脫體積Ve，即可計算出Kav值。而凝膠床總體積Vt可用測量法得到：
由凝膠床的組成可知，床體積Vt等於外水體積Vo、內水體積Vi與凝膠顆粒實際佔有體積Vg之和。即
Vt = Vo+Vi+Vg = Vo+Vi
而Vo和Vi可通過實驗測得：當把分子量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時，其在內水體積和外水體積中的分布是不一樣的。溶液中的分子大於凝膠孔徑上限者不能進入凝膠網孔內，而被排阻在外水體積的溶液中。凝膠床的洗脫體積Ve剛好等於外水體積。即Ve=Vo (Kav=0)。然而，溶液中的分子小於凝膠孔徑下限者能自由進入凝膠網孔內，凝膠床的洗脫體積Ve應等於凝膠床總體積，即Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)。而溶液中的分子大小介於凝膠孔徑上限和下限之間者，則能進入部分凝膠網孔中，故其洗脫體積Ve是在Vo和Vt之間（Kav在0－1之間）。
以床體積Vt（等於pr2h）和測得值Vo來計算分配系數的值為Kav，若以床體積Vt（等於Vo+Vi）和測得值Vo來計算分配系數的值為Kd。在同一層析條件下，對同一物質計算出來的Kav和Kd值盡管有一定的差異性，但都是有效的。只因Kav計算方便，所以目前多使用Kav。分離物在凝膠過濾層析時的行為，除用Kav和Kd表示外，還可用Ve/Vo或Vo/Ve（R值）表示。
反應原理
凝膠過濾不僅常用做物質的分離，還可以根據需要用某種試劑非常方便地處理某種物質，當該物質流經試劑區時，因為可連續接觸新鮮試劑，因而可以充分發生反應，最後經過洗脫，再與過量的試劑分開。本實驗就是通過凝膠過濾，用還原劑FeSO4處理血紅蛋白。即首先在層析柱中加入含有還原劑的溶液，使形成一個還原區帶，當血紅蛋白樣品（血紅蛋白與鐵氰化鉀的混合液）流經還原區帶時，褐色的高鐵血紅蛋白立即生成紫色的還原型血紅蛋白，隨著還原型血紅蛋白繼續下移，與緩沖液中的氧分子結合又形成了鮮紅的血紅蛋白。鐵氰化鉀則因分子量小，在層析柱中呈現其本來的黃色帶而遠遠地落在血紅蛋白的後邊。本實驗操作簡便，直觀性強，趣味性濃，通過肉眼觀察即可檢驗分離效果。
三、實驗材料
1.器材：層析柱，?10×200
2.試劑：
(1) 20mM磷酸二氫鈉
(2) 20mM磷酸氫二鈉
(3) 40mM FeSO4(用時現配)
(4) 0.2M Na2HPO4，80mM Na2H2EDTA
(5) 抗凝血（哺乳動物血樣，以1：X的比例加入%檸檬酸鈉，置於4℃冰箱中保存。貯存期以不超過3個月為宜）
(6) Sephadex G-25
(7) 固體鐵氰化鉀
四、儀器設備
鐵架台、恆流泵
五、實驗步驟
1．凝膠的處理 取3克葡聚糖凝膠（Sephadex-25）乾粉，浸泡於蒸餾水中充分溶脹（室溫，6小時），然後傾斜法除去表面懸浮的小顆粒，最後加入等體積pH7磷酸緩沖液繼續浸泡（磷酸緩沖液用試劑1、2以39:51的比例混合，並用pH計校對）。
2．裝柱 將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約5-7cm高的緩沖液，把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊到入柱中，同時開啟止水螺絲，控制一定的流速，使柱中的凝膠一直處在溶液中。最好一次連續裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現界面。裝柱長度至少8cm。最後放入略小於層析柱內徑的濾紙片，以防將來加樣時凝膠被沖起。
3．平衡 用磷酸緩沖液洗脫，平衡20分鍾。注意液面不要低於凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。
4．血紅蛋白樣品的制備 取1ml抗凝血於燒杯中，加入10ml pH7 20mM磷酸緩沖液，再加入固體鐵氰化鉀，使濃度達到5mg/ml。
5．層析柱還原層的形成 取1ml 40mMFeSO4於小燒杯中，加入1ml 0.2M Na2HPO4,80mM Na2H2EDTA混合液攪拌均勻。待層析柱上緩沖液幾乎全部進入凝膠時，速取該混合液0.4ml加入層析柱中，待混合液完全進入柱床後加入0.7ml緩沖液。（注意還原劑的混合液要新鮮配製，盡可能縮短在空氣中暴露的時間）。
6．上樣 將柱中多餘的液體從底部流出後關閉止水螺絲,取前面制備好的血紅蛋白樣品0.5ml，將樣品溶液小心加到凝膠柱上，打開止水螺絲，使樣品溶液流入柱內。
7．洗脫 用緩沖液進行洗脫，控制緩沖液在約每5秒一滴的流速，觀察並記錄實驗現象。
8．清洗 待所有色帶流出層析柱後，加快流速，繼續清洗層析柱5min
『貳』 丙二酸的抑製作用
如未加特殊說明,本實驗所用溶液的濃度表示法均為百分濃度W/V.
實驗一 轉氨酶GPT活性的測定
【 原 理 】
轉氨酶是體內重要的一類酶.轉氨酶催化α–氨基酸的α–氨基與α–酮酸的α–酮基之間的相互轉化,從而生成一種新的氨基酸與一種新的酮酸,這種作用稱為轉氨基作用.它在生物體內蛋白質的合成,分解等中間代謝過程中,在糖,脂及蛋白質三大物質代謝的相互聯系,相互制約及相互轉變上都起著很重要的作用.
在動物機體中活力最強,分布最廣的轉氨酶有兩種:一種為谷氨酸草醯乙酸轉氨酶(glutamic-Oxaloacetate transaminase簡稱GOT),另一種為谷氨酸丙酮酸轉氨酶(glutamic-pyruvic transaminase簡稱GPT).本實驗以谷氨酸丙酮酸轉氨酶為例.它的催化反應如下:
GPT
丙氨酸 + α–酮戊二酸 谷氨酸 + 丙酮酸
37℃
由上可見此反應最終產物是丙酮酸.測定單位時間內丙酮酸的產量即可得知轉氨酶的活性.
丙酮酸可與2,4–二硝基苯肼反應,形成丙酮酸二硝基苯腙,在鹼性溶液中呈棕紅色,顯色的深淺在一定范圍內可反映所生成的丙酮酸量多少,與同樣處理的丙酮酸標准液進行比色,計算出其含量,以此測定轉氨酶的活性.
丙酮酸 + 2,4–二硝基苯肼 丙酮酸–2,4–二硝基苯腙(棕紅色)
本實驗用金氏(King)法(1)測定轉氨酶的活性單位為:每毫升血清與基質在37℃下作用60分鍾,生成1μmol丙酮酸為1個單位.
【 試劑和器材 】
一 試劑
1.1/15 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖溶液:
甲液:1/15 mol/L磷酸氫二鈉溶液:稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4)9.47g(或Na2HPO4 · 12H2O 23.87g)溶解於蒸餾水中,定容至1 000 ml.
乙液:1/15 mol/L磷酸二氫鉀溶液:稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4)9.078g,溶解於蒸餾水中,定容至1 000 ml.
取甲液825 ml乙液175 ml混合,測其pH為7.4即1/15 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液.
2.GPT基質液:精確稱取a–酮戊二酸29.2 mg及DL–丙氨酸1.78g,溶於1/15 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液50ml 中溶解,加1mol/L NaOH溶液0.5ml,校正pH至7.4.再以pH 7.4的磷酸緩沖液定容至100ml,充分混合,冰凍貯存.
3.2,4–二硝基苯肼溶液:精確稱取2,4–二硝基苯肼20mg,先溶解於10ml濃鹽酸中(可加熱助溶),再以蒸餾水稀釋至100ml(有沉渣可過濾),棕色瓶內保存.(注意:此溶液配製時釋放大量的熱和難聞氣味配製時應戴上口罩)
4.丙酮酸標准液(1ml = 2μmol丙酮酸即2mmol/L):精確稱取丙酮酸鈉22mg於100ml容量瓶中,用1/15 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度.此溶液應新鮮配製,不能存放.
5.0.4 mol/L氫氧化鈉溶液:稱取16g氫氧化鈉溶解於蒸餾水中,定容至1 000ml.
6.1mol/L氫氧化鈉溶液:稱取4g氫氧化鈉溶解於蒸餾水中,定容至1 00ml.
7.血清300ml.
二 器材
1.水浴鍋.
2.分光光度計.
【 操 作 】
1.標准曲線製作:取6支試管按下表操作.
試管號
試 劑
1 2 3 4 5 6
丙酮酸標准液 (ml)
GPT基質液 (ml)
PH7.4磷酸緩沖液(ml)
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
水浴37℃,10分鍾
2,4二硝基苯肼溶液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
保溫37℃,20分鍾
0.4N氫氧化鈉溶液 (ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
相當活性(單位數) 空白 100 200 300 400 500
混勻後,用分光光度計在520nm波長處進行比色測定,以空白調零,讀取各管吸光度讀數.以各管相應的轉氨酶活性單位值為橫坐標,吸光度值為縱坐標,用坐標紙繪制標准曲線.
2.GPT測定:取2支潔凈的試管按下表操作.
試 劑 空 白 測 定
血 清 (ml) 0.1 0.1
G PT基質液 (ml) -- 0.5
混勻, 37℃水浴,60分鍾
G PT基質液 (ml) 0.5 --
2,4二硝基苯肼溶液 (ml) 0.5 0.5
混勻, 37℃水浴,20分鍾
0.4mol/L氫氧化鈉 (ml) 5.0 5.0
混勻,放置5分鍾,用分光光度計在波長520nm波長處進行比色測定,以空白調零,讀取測定管吸光度值.
【 實驗結果 】
所測得的吸光度值在已繪制好的標准曲線上直接查對,即可得知待測轉氨酶的活性單位.
【 注意事項 】
1.測定血清中轉氨酶活性主要有金氏 (King) 法,賴氏 (Reitman—Frankel)法和改良穆氏(Mohun)法.這三種方法的原理,試劑和操作方法包括血清和試劑的用量及作用溫度均相同,不同之處是金氏法酶作用時間為60分鍾,而其他二法為30分鍾.因此活性單位定義不同.
2.轉氨酶只作用於L–型氨基酸,對D–型氨基酸無催化能力.實驗中所用的是DL–型的混旋氨基酸.若採用L–型時,則用量比DL–型少一半.
3.所用儀器應清潔,不應含有酸,鹼,Zn2+,Ca2+,Hg2+,Ag+等蛋白沉澱劑.
4.血清不應溶血,因血細胞內轉氨酶含量較多.樣品採集後應當日進行測定,否則應將血清分離後貯存於冰箱.
5.溫度及時間一定要嚴格控制,准確掌握.pH要准確以免影響酶活性.
實驗二 過氧化氫酶及過氧化物酶的作用
【 原 理 】
在生物機體內,某些代謝物由於需氧脫氫的結果而產生對機體有害的過氧化氫.體內的過氧化氫酶能催化過氧化氫分解成水和分子氧,使過氧化氫不致在體內積累.因此,過氧化氫酶具有保護生物機體的作用.
過氧化氫酶是一種以鐵卟啉為輔基的酶,它廣泛存在於動植物組織中.
過氧化物酶也是一種以鐵卟啉為輔基的酶,它能催化過氧化氫釋放出新生態氧以氧化某些酚類和胺類物質,例如,氧化溶於水中的焦性沒食子酸生成不溶於水的焦性沒食子橙(橙紅色).其作用機制如下:
E + H2O2 E–H2O2
E–H2O2 + H2O2 E + 2 H2O + O2
【 試劑和器材 】
一 試劑
2%過氧化氫溶液:此溶液易見光分解,應新鮮配製.
1%焦性沒食子酸溶液:焦性沒食子酸1g,用蒸餾水溶解並配至100ml.此溶液易
氧化,應新鮮配製.
鐵粉.
二 材料
鮮豬肝糜.
馬鈴薯或血液.
白菜梗提取液:白菜梗約5g,切成細塊,置研缽內,加蒸餾水15ml研磨成漿,轉
移出濾液,備用.
【 操 作 】
1.過氧化氫酶的作用
取試管5支,按下表操作:
試管 2% H2O2(ml) 新鮮肝糜 (g) 煮沸肝糜(g) 生馬鈴薯(g) 熟馬鈴薯(g) 鐵粉
1 3 0.5 - - - -
2 3 - 0.5 - - -
3 3 - - 1 - -
4 3 - - - 1 -
5 3 - - - - 少許
加畢,觀察有無氣泡放出,特別是肝糜周圍和馬鈴薯周圍.
2.過氧化物酶的作用
取試管4支,按下表操作:
試管 1%焦性沒食子酸 2% H2O2 蒸餾水 白菜梗提取液 煮沸的白菜梗提取液
(ml) (滴) (ml) (ml) (ml)
1 2 2 2 - -
2 2 - - 2 -
3 2 2 - 2 -
4 2 2 - - 2
搖勻後,觀察並記錄各管顏色變化和沉澱的出現.
實驗三 琥珀酸脫氫酶及丙二酸的抑製作用
【 原 理 】
琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環中的一個重要的酶,測定細胞中有無這種酶可以初步鑒定
三羧酸循環途徑是否存在.琥珀酸脫氫酶可使其底物脫氫,產生的氫可通過一系列傳遞體最後遞給氧而生成水.在缺氧的情況下,若有適當的受氫體也可顯示出脫氫酶的作用.如心肌中的琥珀酸脫氫酶在缺氧的情況下,可使琥珀酸脫氫生成延胡索酸,脫下之氫可將藍色的甲烯藍還原成無色的甲烯白.這樣,便可以顯示琥珀酸脫氫酶的作用.
琥珀酸 + 甲烯藍 琥珀酸脫氫酶 延胡索酸 + 甲烯白
丙二酸的化學結構與琥珀酸相似,它能與琥珀酸競爭而和琥珀酸脫氫酶結合.若琥珀酸脫氫酶已與丙二酸結合,則不能再催化琥珀酸脫氫,這種現象稱為競爭性抑制.如相對地增加琥珀酸的濃度,則可減輕丙二酸的抑製作用.
【 試劑和器材 】
一 試劑
1.1.5%琥珀酸鈉溶液:取琥珀酸鈉1.5g,用蒸餾水溶解並稀釋至100ml.如無琥珀酸鈉可用琥珀酸配成水溶液後,以氫氧化鈉溶液中和至pH7~8.
2.1%丙二酸鈉溶液:取丙二酸鈉1g,用蒸餾水溶解並稀釋至100ml.
3.0.02%甲烯藍溶液.
4.1/15mol/LNa2HPO4溶液:取Na2HPO4 · 2H2O 11.88g,用蒸餾水溶解並稀釋至1 000ml.
5.液體石蠟.
二 器材
1.玻璃勻漿器.
2.離心機.
三 材料
新鮮豬心.
【 操 作 】
1.豬心臟制備液:稱取新鮮豬心1.5~2.0g玻璃勻漿器放中,加入等體積的石英砂及1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml,搗碎成漿,再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液,放置一小時,不時搖動,離心(3000r/min 10 min)取上清液備用.
2.取4支試管,編號並按下表操作:
試管 心臟制備液 1.5%琥珀酸鈉溶液 1%丙二酸鈉溶液 蒸餾水 0.02%甲烯藍溶液
(滴) (滴) (滴) (滴) (滴)
1 5 5 - 10 2
2 5(先煮沸) 5 - 10 2
3 5 5 5 5 2
4 5 10 5 5 2
3.各管溶液混勻後,每管各加液體石蠟一薄層(約5~10滴).為什麼
4.各管置於37℃水浴中,半小時內觀察各管顏色變化,比較其速度並說明原因.然後將第一管用力搖動,觀察其有何變化 為什麼
實驗四 γ–球蛋白的分離
【 原 理 】
中性鹽 (如硫酸銨,硫酸鈉,氯化鈉,硫酸鎂等)對球狀蛋白質的溶解度有顯著影響.隨著中性鹽濃度的增加,離子強度也增加.當溶液離子強度增加到一定數值時,溶液中蛋白質的溶解度開始下降.離子強度增加到足夠高時,蛋白質可從水溶液中沉澱出來,這種現象叫做鹽析.各種蛋白質的溶解度不同,因而可利用不同濃度的高濃度鹽溶液來沉澱分離各種蛋白質.
蛋白質是一種生物大分子,它具有不能通過半透膜的性質.透析就是利用這種性質使之與其它小分子物質如無機鹽,單糖等分開.本次實驗應用的是脫鹽透析,即鹽析後,將含大量鹽類的蛋白質溶液放在半透膜的袋內,再將透析袋浸入蒸餾水中.經過一段時間,袋內的鹽類濃度即逐漸降低.若經常更換袋外的液體,最後即可使袋內的蛋白質溶液中所含的鹽類除凈,從而達到脫鹽的目的.應用不同濃度硫酸銨分段鹽析法將血清中γ–球蛋白及α,β球蛋白分離,最後用透析法脫鹽,即可得到純度較高的γ–球蛋白.
【 試劑和器材 】
一 試劑
1.pH 7.2,0.01mol/L磷酸鹽緩沖液生理鹽水(簡稱PBS): 取0.2mol/L Na2HPO4溶液36.0ml,0.2mol /L NaH2PO4溶液14.0ml混合,加NaCl 8.5克,用蒸餾水稀釋至1 000ml.
2.pH7.2飽和硫酸銨溶液:用濃氨水將2 000ml飽和硫酸銨溶液調pH到7.2.
3.納氏試劑:
納氏試劑貯存液:於500ml三角燒瓶內加入碘化鉀150克,碘110克,汞50克及蒸餾水l00ml,用力振盪7~15分鍾,至碘色將轉變時,此混合液即產生高熱.隨即將此燒瓶浸於冷水內振盪,直至棕色之碘轉變成帶綠色之碘化鉀汞溶液為止.將上清液傾入2 000ml量筒內,並用蒸餾水洗滌瓶內沉澱物數次.將洗滌液一並傾入量筒內,加蒸餾水至2 000ml刻度後,混勻即成.
納氏試劑應用液:取10%氫氧化鈉700ml,鈉氏試劑貯存液150ml及蒸餾水150ml混勻即成,如顯混濁,可靜置數日後取上清液使用.此試劑之酸鹼度極為重要.用lmol/L鹽酸溶液20ml滴定時,需此試劑11～11.5ml恰好使酚酞指示劑變成紅色時最為適宜.否則必須糾正其酸鹼度.
4.雙縮脲試劑:溶解1.50克硫酸銅(CuSO4·5H2O)和6.0克酒石酸鉀鈉(NaKC4H406 · 4H20)於500ml蒸餾水中.在攪拌下加入10%氫氧化鈉溶液300ml,用蒸餾水稀釋到1升,貯存在內壁塗以石蠟的瓶中,可長期保存.
5.濃蔗糖液:蔗糖的飽和溶液.
6.10%氫氧化鈉:取10克氫氧化鈉溶解於蒸餾水中,定容至100ml.
二 器材
1.透析袋.
2.磁力攪拌器.
3.離心機.
三 材料
兔血清
【 操 作 】
一 鹽析
1.取離心管1支加入血清2ml,再加入等量PBS稀釋血清,搖勻後,逐漸加入pH7.2飽和硫酸銨溶液2ml(相當於33%飽和度硫酸銨),邊加邊搖.然後靜止半小時,再離心(3 000r/min)20分鍾,傾去上清液(主要含白蛋白).
2.用lml PBS將離心管底部的沉澱攪拌溶解,再逐滴加飽和硫酸銨溶液0.5m1.搖勻後放置半小時,離心(3 000r/min)20分鍾,傾去上清液(主要含α,β球蛋白),其沉澱即為初步純化的γ–球蛋白.如要得到更純的γ–球蛋白,可重復鹽析過程1～2 次.
3.把提取的γ–球蛋白用1 mlPBS懸浮.
二 透析脫鹽與濃縮
1.將鹽析得到的γ–球蛋白放入透析袋內,用線繩縛緊上口,用玻璃棒懸在盛有半杯蒸餾水的100ml燒杯中,使透析袋下半部浸入水中.
2.將燒杯放在磁力攪拌器上攪拌1小時以上(中間換水1～2次),然後將透析袋取下.小心將線繩解開,吸取袋內的液體,與燒懷中的水同時用雙縮脲試劑檢查袋內外的蛋白質,用納氏試劑檢查袋內外液體中的銨離子(NH4+),觀察透析法的脫鹽效果.
3.脫鹽後得到的γ–球蛋白溶液可繼續濃縮,即用透析袋裝好懸於盛有10ml濃蔗糖或聚乙二醇溶液的小燒杯內1小時以上,觀察袋內液體體積的變化.
實驗五 γ–球蛋白含量測定(光度分析法)
【 原 理 】
雙縮脲法是蛋白質光度分析法的一種,是利用蛋白質的雙縮脲反應而測定蛋白質含量的方法.因蛋白質含有兩個以上的肽鍵,所以有雙縮脲反應.在鹼性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫紅色絡合物,其顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比,而與蛋白質的分子量及氨基酸成分無關.在一定的實驗條件下,未知樣品溶液與標准蛋白質溶液同時反應,並於540~560nm測定,即可以通過標准蛋白質的標准曲線求出未知樣品的蛋白質濃度.
【 試劑和器材 】
一 試劑
1.標准酪蛋白溶液(5mg/ml):用0.05mol/L NaOH溶液配製:5g酪蛋白加0.05mol/L NaOH溶液至1 000ml.
2.雙縮脲試劑:溶解1.5g硫酸銅(CuSO4 · 5H2O)和6.0 g酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6 · 4H2O)於500ml蒸餾水中.在攪拌下加入10% NaOH溶液300ml,用蒸餾水稀釋到1升,貯存在內壁塗有石蠟的瓶中,可長期保存.
3.未知蛋白質溶液:γ–球蛋白溶液.
二 器材
分光光度計.
【 操 作 】
1.標准曲線的繪制:取6支試管按下表操作.
試 劑 1 2 3 4 5 6
標准酪蛋白溶液(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
蒸餾水 (ml) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0
雙縮脲試劑 (ml) 4 4 4 4 4 4
室溫下(15~25℃)放置30分鍾,用分光光度計於540nm測定.以光密度為縱坐標,酪蛋白含量為橫坐標用坐標紙繪制標准曲線.
2.γ–球蛋白溶液濃度的測定:取3支試管按下表操作.
試 劑 空白管 測定1 測定2
γ–球蛋白溶液(ml) - 1 1
蒸餾水 (ml) 2 1 1
雙縮脲試劑 (ml) 4 4 4
搖勻,放置30分鍾,540nm測定讀取光密度.
【 實驗結果 】
求出待測蛋白質溶液的光密度後,從標准曲線上查出其蛋白質濃度,按稀釋倍數求出每毫升蛋白質溶液的蛋白質含量.
實驗六 凝膠柱層析法(γ–球蛋白純化)
【 原 理 】
凝膠層析(gel chromatography),又稱為凝膠過濾(gel filtration),分子篩過濾(molecular sieve filtration),凝膠滲透層析(gel osmotic chromatography)等.它是20世紀60年代發展起來的一種層析技術.其基本原理是利用被分離物質分子大小不同及固定相(凝膠)具有分子篩的特點,將被分離物質各成分按分子大小分開,達到分離的方法.
凝膠是由膠體粒子構成的立體網狀結構.網眼裡吸滿水後凝膠膨脹呈柔軟而富於彈性的半固體狀態.人工合成的凝膠網眼較均勻地分布在凝膠顆粒上有如篩眼,小於篩眼的物質分子均可通過,大於篩眼的物質分子則不能,故稱為"分子篩".凝膠之所以能將不同分子的物質分開是因為當被分離物質的各成分通過凝膠時,小於篩眼的分子將完全滲入凝膠網眼,並隨著流動相的移動沿凝膠網眼孔道移動,從一個顆粒的網眼流出,又進入另一顆粒的網眼,如此連續下去,直到流過整個凝膠柱為止,因而流程長,阻力大,流速慢;大於篩眼的分子則完全被篩眼排阻而不能進入凝膠網眼,只能隨流動相沿凝膠顆粒的間隙流動,其流程短,阻力小,流速快,比小分子先流出層析柱;小分子最後流出.分子大小介於完全排阻不能進入或完全滲入凝膠篩眼之間的物質分子,則居中流出.這樣被分離物質即被按分子的大小分開.
用於凝膠層析的凝膠均為人工合成的產品,主要有交聯葡聚糖(商品名為Sephadex),瓊脂糖(商品名為Sepharose),聚丙烯醯胺凝膠(商品名為Bio–gel)及具有一定網眼的細玻璃珠等和這些凝膠的衍生物.
本實驗主要介紹葡聚糖凝膠,這是由葡萄糖的多聚物與1–氯–2,3–環氧丙烷 (CH2—CH—CH2C1)交連而成.環氧丙烷引入丙三醇基將鏈狀的多聚葡萄糖單位交聯起來,凝
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O 膠網眼的大小由多聚葡萄糖的分子和環氧丙烷的比例(交聯度)來控制.
葡聚糖具有較強的親水性,在水和電解質溶液中膨脹成為柔軟而富於彈性的凝膠,其吸水能力與葡聚糖凝膠的交聯度有密切關系.交聯度大的,孔徑小,吸水少,膨脹的程度小;交聯度小的,孔徑大,吸水多,膨脹的程度大.因此,葡聚糖凝膠孔徑的大小可以其吸水量的大小來表示,常以G–10至G–200號碼標記.G後面的數字是其吸水量(毫升水/克干膠)乘以10所得的值.如G–25即表示吸水量為2.5ml/g干膠.市售有G–10,G–25,G–50,G–75,G–100,G–150,G–200等型號.G–75以上的膠因吸水量大,膨脹後形態柔軟易變,統稱為軟膠.G–75以下的稱為硬膠.
葡聚糖凝膠可分離的分子大小從幾百到數十萬.可根據被分離物質的分子大小及目的選擇使用.一般說Sephadex G–l0～15通常用於分離肽及"脫鹽".Sephadex G–75～200用以分離各類蛋白質.
凝膠層析是一種物理分離法.葡聚糖凝膠基本上不帶電荷呈多惰性,不與被分離物質發生反應,所以分離的效果較好.然而由於它是葡萄糖的聚合物,因而仍有少量活性羥基,能吸附少量蛋白質等被分離的物質.為了克服這個缺點,一般使用含有離子強度達0.08的NaCl等中性鹽緩沖液作洗脫液.
本實驗採用凝膠過濾法純化γ–球蛋白,除去其中的硫酸銨,以達到純化目的.
【 試劑和器材 】
一 試劑
1.實驗二提取出的γ–球蛋白
2.磷酸鹽緩沖液(pH6.7,0.0175mol):取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml,0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合,用蒸餾水稀釋至1 000ml.
3.Sephadex G–25.
4.奈氏試劑
5.20%磺醯水揚酸
6.洗脫液:磷酸鹽緩沖液(pH 7.0,0.01mol) 取0.2mol/L Na2HPO4溶液30.5ml,0.2mol /LNaH2PO4溶液19.4ml混合,加NaCl 8.5克,用蒸餾水稀釋至1 000ml.
二 器材
1.lcm×20cm層析柱
2.洗脫瓶.
3.部分收集器
恆流泵
5.監測儀
【 操 作 】
1.凝膠處理:溶脹(水化):商品葡聚糖凝膠和聚丙烯醯胺凝膠均為乾燥顆粒,使用前必須水化溶脹.商品瓊脂糖凝膠呈懸浮膠體可直接用,玻璃球不用溶脹.
凝膠溶脹有兩種方法:一種是將所需葡聚糖凝膠浸入蒸餾水中於室溫下溶脹;另一種 是置於沸水浴中溶脹.各種葡聚糖在上述溶脹方法中所需的時間見實驗原理部分.
必須浸泡足夠的時間以使凝膠充分溶脹.兩種方法中,沸水浴溶脹不但節省時間,還可以殺滅凝膠中污染的細菌並排出網眼.
凝膠溶脹後,需用蒸餾水洗滌幾次,每次應將沉降緩慢的細小顆粒隨水傾倒出去,以免在裝柱後產生阻塞現象,降低流速.洗後將凝膠浸泡在洗脫液中待用.
一支層析柱中應該裝入的干膠量可以用下法推算:稱取1g所需型號的葡聚糖干膠,放在5ml量筒中,用室溫溶脹的方法充分溶脹,觀察溶脹後凝膠的體積.然後在層析柱中加水到所需柱床高度,將水倒出,量取柱床體積.根據1g干膠溶脹後的體積和所需柱床體積,即可推算出干膠的需要量.
2.裝柱 將層析劑裝入柱中進行層析的方法稱柱層析法.作層析用的柱子稱層析柱.層析柱有玻璃和透明塑料的兩種.柱子的一端為進口,另一端為出口,出口端底部有燒結玻璃砂板或尼龍布,能阻止層析劑流出,溶劑則可流過.如果沒有市售的層析柱,可以選用粗細均勻,長短合適的玻璃管,在兩端塞上合適的膠塞,膠塞中插人細玻璃管,在一端放一層尼龍布為出口,即可作為層析柱使用.層析柱的長短粗細根據實驗的目的而定,一般說來,凝膠層析時柱越長,分離效果越好.但柱過長,層析時間長,樣品易稀釋造成擴散,反而影響分離效果.柱的內徑不宜較細,直徑1cm以下的柱易發生"管壁效應",即柱中部分的物質組分移動較快,管壁周圍的則移動較慢,造成分離混亂.當然柱的內徑也不宜過粗.
凝膠層析中,在把小分子物質(mw<1 500),如無機或其他物質與大分子物質 (mw0.5ml/支).
配製測定試劑:1號試劑:2號試劑:3號試劑=1.0:0.1:0.1,混勻.臨用前視需要量配製,現用現配.
二 器材
1.水浴鍋
2.分光光度計
三 材料
血清
【 操 作 】
試劑測定管(U) 標准管(S) 空白管(B)
血清 (μl)(1:5) 30 – –
標准液 (μl) – 30 –
測定試劑 (ml) 0.6 0.6 0.6
蒸餾水 (ml) 0.25 0.25 0.28
4號應用液(ml) 0.15 0.15 0.15
充分混勻,置37℃水浴30分鍾
顯色劑 (ml) 1.0 1.0 1.0
血清(1:5):0.1ml+0.4ml生理鹽水1:5稀釋後使用.
混勻,室溫10分鍾後,分光光度計550nm,1cm厚度比色杯比色,用蒸餾水調零.
酶活性單位表示:SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個單位.結果以每毫升酶單位表示.
【 實驗結果 】
SOD U/ml = B-U/B-S×33.3×標准液體積/樣品的體積
=B-U/B-S×33.3×30/30×1000/5000
=B-U/B-S×167
正常參考值:人血清SOD:59.5±17.1U/ml(血清取樣量6μl)
實驗十七 等電聚焦法測定SOD等電點
【 原 理 】
等電點聚焦就是在電泳槽中放入載體兩性電解質,當通以直流電時,兩性電解質即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度,當蛋白質放進此體系時,不同的蛋白質即移動到或聚焦於與其等電點相當的pH位置上.等電聚焦的優點是:有很高的解析度,可將等電點相差0.01-0.02 pH單位的蛋白質分開;一般電泳由於受擴散作用的影響,隨著時間和所走的距離加長,區帶越走越寬,而等電聚焦能抵消擴散作用,使區帶越走越窄;由於這種電聚焦作用,不管樣品加在什麼部位,都可聚焦到其電點,很稀的樣品也可進行分離;可直接測出蛋白質的等電點,其精確度可達0.01pH單位.
載體兩性電解質必需具備的條件:(1)在等電點處必需有足夠的緩沖能力,以便能控制pH梯度,而不致被樣品蛋白質或其他兩性物質的緩沖能力改變pH梯度的進程. (2)在等電點必需的足夠高電導,以便使一定的電流通過,而且要求具備不同pH值的載體有相同的電導系數,使整個體系中的電導均勻,如果有局部電導過小,就會產生極大的電位降,從而其他部分電壓就會太小,以致不能保持梯度,也不能使應聚焦的成分進行電遷移,達到聚焦.(3)分子量要小,便於與被分離的高分子物質用透析或凝膠過濾法分開. (4)化學組成應不同於被分離物質,不幹擾測定.(5)應不與分離物質反應或使之變性.總起來說,當一個兩性電解質的等電點介於兩個很近的pk值之間時,它在等電點的解離度大,緩沖能力強,而且電導系數高,這就是好的載體兩性電解質.
理想的載體兩性電解質的合成:具有幾個pH值很相近的多乙烯多胺(如五乙烯六胺)為原料,與不飽和酸(如丙烯酸)發生加合反應:加合反應優先加在α,β飽和酸的β碳原子上,調節胺和酸的比例可以加上一個或多個羧基,這種合成方法與一般有機會合成不同,有機合成一般要求合成的產物越純越好,而這里要求合成出的產物越復雜越好,要有多異構物和同系物,以保證的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值,從而得到平滑的pH梯度.載體兩性電解質的等電點在pH3-10的范圍,分子量在300-1000之間,它們的緩沖能力等於或優於組氨酸,電導性能良好,可以使電場強度分布較均勻,它們的水溶性良好,在1%水溶液中的紫外吸收值(260mμ)很低.
【 試劑和器材 】
一 試劑
1. 1mol/LNa3PO3
2. 1mol/LNaOH
3. 1%甘氨酸
4.染色液:0.2%考馬斯亮藍
5.10%三氯乙酸
6.5%磺基水楊酸
7.電泳儀
8.脫色液:35%無水乙醇與10%冰乙酸等體積混和
9.20%甘油
二 器材
1.微量注射器
2.薄層膠片
3.濾紙
三 材料
透析後的蛋白質樣品
【 操 作 】
1.薄層膠片的灌制
(1)配製凝膠溶液(2)架制膠室(3)灌膠(4)保存
2.樣品的預處理:透析除鹽,用1%甘氨酸或載體兩性電解質為溶劑溶解透析後的蛋白質樣品.
3.樣品的施加: 將濾紙(擦凈紙)剪成0.4×0.5cm2的小方塊,先貼在膠質上,再用微量注射器滴加一定量的樣品.
4.電極液的施加:電極液採用1mol/LNa3PO3為正極液,1mol/LNaOH為負極液.用濾紙條浸潤電極液,然後分正負極,貼加在薄層膠片的兩端.
5. 電泳的條件: 4℃下電泳或室溫通冷凝水電泳.起始電壓為60V,15分鍾調至120V,轉而恆流(每cm膠片長度0.8-1.0mA),約1小時左右,電壓便上升到600～700V,再轉而恆壓600V或700V,維持3～3.5小時即可結束電泳.
6.pH梯度的測定: 把1×7 cm2薄層膠片切下來,分成14等分,每份加0.4ml重蒸水,攪碎後,測出pH.
7.染色及保存: 蛋白質染色步驟:5%磺基水楊酸與10%三氯乙酸等體積混合固定1小時;置脫色液(35%無水乙醇與10%冰乙酸等體積混勻)45min;0.2%考馬斯亮藍R250的脫色液溶液(W/V)染色30min;置脫色液中,37℃溫箱內過夜.染色後的膠片可放在20%甘油中,也可製成乾片.
8.等電點的測定: 測定染色後所分離的區帶距正極端的長度,按pH曲線找出其相應的等電點.
實驗十八 牛乳中酪蛋白磷酸肽的制備
【 原 理 】
牛乳中含豐富的蛋白質,其中主要是酪蛋白.酪蛋白在牛乳中約占總蛋白量的5/6.酪蛋白是一種含磷蛋白的不均一混合物.蛋白質在其等電點pH溶液中溶解度降低.將牛乳的pH調整至4.8,即酪蛋白的等電點時,酪蛋白即沉澱出來.用乙醇除去酪蛋白沉澱中不溶於水的脂肪,得到純的酪蛋白.牛乳酪蛋白中含有磷酸肽,其活性中心是磷酸化的絲氨酸和谷氨酸簇,是最有效的促鈣吸收因子.酪蛋白經酶水解可產生酪蛋白磷酸肽.氮磷比是評價CPP產品質量的最重要指標,氮磷比(N/P)越小,則CPP產品中磷酸基密度越高和肽鏈越短,它促進人體對鈣吸收的生理活性也越高,N/P一般應小於7.5.
【 試劑和器材 】
一 試劑
1.乙酸鈉緩沖液(0.2mol/L pH4.6)
2.1%NaOH
3.10%乙酸
4.乙醇
5.乙醚
6.0.1mol/LnaOH
7.胰蛋白酶
8.pH7.4,0.1mol/LTris-HCl緩沖液
二 器材
1.pH計
2.離心機
3.表面皿
4.
三 材料
1.新鮮牛乳
2.酪蛋白
【 操 作 】
酪蛋白的制備
取新鮮牛乳300ml,放入250ml燒杯中加熱至40℃.加入100ml加熱至同樣溫度的乙酸鈉緩沖液,一邊加一邊搖動,並用pH計檢測,調整混合液的pH為4.8(用1%NaOH或10%乙酸進行調整).冷卻至室溫,繼續放置5分鍾,離心(2500r/min,20min)獲沉澱物,用少量蒸餾水洗幾次,過濾.將洗凈的沉澱物懸浮在約 30ml乙醇中,離心得沉澱,用乙醇和乙醚等量混合液洗滌兩次,最後用50ml乙醚洗一次.取出抽乾的粉狀物,攤開在表面皿上,使乙醚完全揮發.
『叄』 儀器分析——層析技術二、層析法實驗技術
（一）凝膠層析法
凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等。它的突出優點是層析所用的凝膠屬於惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，並且對分離成分理化斗旦晌性質的保持有獨到之處。對於高分子物質有很好的分離效果。
⒈凝膠的選擇根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開，由於它們在分配系數上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG-25和G-50，對於小肽和低分子量的物質（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大於樣品中分子量物質的凝膠，層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部，由於Kd不同，最後得到分離。
⒉柱的直徑與長度根據經驗，組別分離時，大多採用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的空鋒層析柱，其直徑在1-5cm范圍內，小於1cm產生管壁效應，大於5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質宜在30-40之間。
⒊凝膠柱的制備凝膠型號選定後，將干膠顆粒懸浮於5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之後將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內充滿洗脫液，將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛於柱頂的容器中，然後在微微地攪拌下使凝膠下沉於柱內，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應低於層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無「紋路」或氣泡，或加一些有色物質來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。
⒋加樣和洗脫凝膠床經過平衡後，在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大於凝膠總床體積的5％-10％。樣品濃度與分配系數無關，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2.樣品加入後打開流出口，使樣品滲入凝膠床內，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進入凝膠床後，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預先設計好流速，然後分部收集洗脫液，並對每一餾份做定性、定量測定。
⒌凝膠柱的重復使用、凝膠回收與保存一次裝柱後可以反復使用，不必特殊處理，並不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析後加入0.02％的疊氮鈉，在下次層析前應將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。
如果不遲碰再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70％、90％、95％乙醇脫水平衡至乙醇濃度達90％以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、乾燥保存。濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封後高壓滅菌保存。
⒍凝膠層析的應用
⑴脫鹽：高分子（如蛋白質、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱長與直徑之比為5-15，樣品體積可達柱床體積的25％-30％，為了防止蛋白質脫鹽後溶解度降低會形成沉澱吸附於柱上，一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然後加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍乾燥法除去揮發性鹽類。
⑵用於分離提純：凝膠層析法已廣泛用於酶、蛋白質、氨基酸、多糖、激素、生物鹼等物質的分離提純。凝膠對熱原有較強的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。
⑶測定高分子物質的分子量：用一系列已知分子量的標准品放入同一凝膠柱內，在同一條件下層析，記錄每一分鍾成分的洗脫體積，並以洗脫體積對分子量的對數作圖，在一定分子量范圍內可得一直線，即分子量的標准曲線。測定未知物質的分子量時，可將此樣品加在測定了標准曲線的凝膠柱內洗腫後，根據物質的洗脫體積，在標准曲線上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時水分和低分子量的物質就會進入凝膠粒子內部的孔隙中，而高分子物質則排阻在凝膠顆粒之外，再經離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。
（二）離子交換層析法
離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質來分離離子型化合物的一種方法。
⒈離子交換劑預處理和裝柱對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。
⒉加樣與洗脫加樣：層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。
洗脫：已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6.兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1＝A2時為線性梯度，當A1＞A2時為凹形梯度，A1＞A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求：①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不致於太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
⒊洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。
⒋離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產品建立用0.02％疊氮鈉。
⒌離子交換層析的應用離子交換層析技術已廣泛用於各學科領域。在生物化學及臨床生化檢驗中主要用於分離氨基酸、多肽及蛋白質，也可用於分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。
『肆』 凝膠過濾層析的原理是什麼
凝膠過濾層析的原理是利用具有多孔網狀結構的顆粒的分子篩作用，根據被分離樣品中各組分相對分子質量大小的差異進行洗脫分離，主要是根據蛋白質的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化。
凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析，小分子物質能進入其內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
『伍』 凝膠層析法分離血紅蛋白和硫酸銅的注意事項
分離和提純蛋白質方法多種多樣，其中最為重要的一種方法就是凝膠過濾層析。凝膠過濾層析是根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法，是一種有效的液相層析色譜技術，具有設備簡單、操作方便、分離迅速及不影響分子的生物學活性等優點，目前已廣泛應用於各種生物大分子物質的分離和純化[1]。作為一項基本的實驗技能，在農業類院校已經把凝膠過濾分離血紅蛋白與硫酸銅作為生物化學教學的一項基本實驗[2]。凝膠層析技術不僅被廣泛應用於科研與教學，同時也是醫學和生物技術類院校普遍安排的對本科生和研究生的生化實驗[3，4]。通過凝膠過濾分離血紅蛋白與硫酸銅，讓學生充分了解凝膠過濾層析的工作原理、方法及應用等，初步掌握凝膠過濾分離技術。但由於實驗過程步驟復雜、耗時過長，或者實驗結果不理想，再加上儀器、試劑、樣品處理等原因的約束，而使其在本科生實驗教學中很難開設。為了能讓學生在兩個學時內完成實驗過程並且能掌握實驗原理與實驗的方法，我們進行了多次的預習實驗，最後確定了一套實驗方法與步驟，簡化了實驗過程，充分利用了試劑，對樣品也進行了一些改進，在實驗過程中使用直徑為1cm、長為15cm的層析柱。利用較少的樣品、簡便的器材即可以完成操作，使其適合在本科生實驗教學中開設[5]。現將整個實驗方案介紹如下。
一、實驗原理
凝膠過濾的方法廣泛地應用於分離、提純、濃縮生物大分子及脫鹽等。凝膠是一種有立體網狀結構的不溶性珠狀顆粒物質，用它來分離物質，主要是根據多孔凝膠對不同半徑的蛋白質分子具有不同的排阻效應進行分離。把樣品加到充滿凝膠顆粒的層析柱中用緩沖液洗脫，當被分離的混合物溶液通過凝膠的網孔向下運動時，由於大分子物質直徑大於凝膠的網孔，不能進入膠粒內部而完全被排阻在外，沿著膠顆粒間的縫隙向下移動，所以大分子物質流程短、流速快，首先流出柱外。而一些小分子物質由於直徑小於凝膠的網孔，不被排阻，可以自由擴散，進入凝膠的顆粒內部，而後又被經過的洗脫液帶走。由於其不斷地進入和流出凝膠顆粒，使其流程變長、移動速度變慢，小分子物質反而最後流出層析柱。這樣就使樣品中各組分按相對分子質量從大到小的順序先後流出層析柱，而達到分離的目的。凝膠過濾層析又稱之為排阻層析[1]（如Sephadex G-50），是一種按照分子量大小分離物質的層析方法[6]。
『陸』 凝膠過濾層析常用介質有哪些凝膠過濾層析技術有何優點與用途
凝膠滲透層析就是按照溶質分子的大小不同而進行分離的一種層析技術。當溶質分子大小不同的樣品溶液通過凝膠柱時，由於凝膠顆粒內部的網路結構具有分子篩效應，分子大小不同的溶質就會受到不同的阻滯作用。分子量大的因不易滲入網路，被排阻在顆粒之外，因而所受到的阻滯作用小，1.凝膠顆粒2.中分子3.小分子4.大分子先流出層析床，分子量小的因能滲透到網路圖1、凝膠滲透層析原理示意圖內部洗脫流程長，因而所受到的阻滯作用大，後流出層析床，這樣就可以達到分離的目的。
凝膠層析的關鍵在於建立液固相平衡，然後以合適的洗脫速度將不同物質分離流出。溫度高有利於快速建立液固相平衡。但是，溫度高也造成溶質在液體中會擴散太快，導致分離效率降低。
目的是分離混合物，獲得一定數量的純凈組分，這包括對有機合成產物的純化、天然產物的分離純化