hilic柱與陰離子交換色譜柱

① 液相色譜柱種類

色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類

①常規分析柱（常量柱），內徑2~5mm,柱長10~30cm；

②窄徑柱（narrowbore），內徑1~2mm，柱長10~20cm；

③毛細管柱（又稱微柱microcolumn），內徑0.2~0.5mm；

④半制備柱，內徑＞5mm；

⑤實驗室制備柱，內徑20~40mm，柱長10~30cm；

⑥生產制備柱內徑可達幾十厘米。

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色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度>20um時，干法填充制備柱較為合適；顆粒<20um時，濕法填充較為理想。填充方法一般有四種：

①高壓勻漿法，多有用於分析柱和小規模製備柱的填充；

②徑向加壓法，Waters專利；

③軸向加壓法，主要用於裝填大直徑柱；

④干法，柱填充的技術性強，大多數實驗室使用己填充好的商品柱。

必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環節，但根本問題還在於填料本身性能的優劣，以及配套的色譜儀系統的結構是否合理。

② 2. 蛋白質組學樣品前處理（3）

說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學院與康昱盛主辦的蛋白質組學網路大課堂整理而成，侵刪。該課程由復旦大學生物醫學研究院（IBS）的劉曉慧博士所授。

我們通過上一篇筆記里介紹的各種方法把蛋白質提取出來以後，這事兒還沒完，因為我們需要對提取出來的蛋白進行一下質控，以確認是否成功提取出了足夠的蛋白，是否有污染等。

如上圖，質量控制分兩個部分：

含量測定 ：檢測是否有充足的蛋白被提取出。注意上圖里提到的不兼容問題，如果你樣品里加過SDS，就不要用Bradford法來測定蛋白濃度，而可以選用BCA方法；反之，如果你樣品里加入了還原劑，就不要用BCA方法來測定蛋白，可以選用Bradford法。

SDS-PAGE ：檢測蛋白的提取效率，以及是否有污染。比如我們上了50個樣，能看到的條帶卻很少，說明定量不準確。如果想從幾組樣品中尋找差異蛋白，特別需要做一次SDS-PAGE檢測同類樣品蛋白的提取效率。

以上圖為例，0號樣品中間的條帶不見了，可能是提取蛋白不充分引起的差異，也可能是樣品本身的差異。我們可以重新提取一次，先排除是否是提取造成的差異；如果是樣品本身的差異，建議用label free的方法，每個樣品單獨做定量，而不要用iTRAQ或TMT標記定量，否則會因為中間這個高豐度蛋白的影響，而導致定量不準。

我們再看來幾種常見的問題，以及解決方法，如下圖：

情況1：提取出來的結果差異很大。這種情況需要重新提取，以檢測到底是提取不充分造成的差異，還是樣品本身的差異；

情況2：左邊是分子量marker,右邊是實際樣品，可以看到實際樣品的條帶很少，可能是提取不充分，需要重設提取參數，使用更劇烈的條件，更長的時間，重新提取；

情況3：橫紋、縱紋比較多，很可能是核酸或脂蛋白的影響，這種情況需要進行脫鹽處理，也就是利用脫鹽柱與肽段結合，而與其它物質不結合，從而達到去除污染的目的。

情況4：兩個條帶很類似，但一條明顯比另一條淡。可能造成這種情況的原因有哪些呢？第一種情況，由於這是同樣類型的樣品，比如都是小鼠肌肉組織，一個樣品的蛋白質抽提充分，而另外一個樣品蛋白抽提不充分，就會導致兩條帶不一樣，這種情況下需要重新抽提。還有一種可能，考慮到是等量上樣跑的SDS-PAGE，如果兩個條帶顯示出的蛋白含量差別很大，則可能因為參考的含量測定結果不準確引起的，這時候需要重新定量。

蛋白提取後，還需要做脫鹽處理，我們來看看可以用哪些方法實現。

超濾： 可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積較小的樣品。操作步驟可以是，從100μL超濾濃縮到40μL，再加緩沖液至100μL，再超濾到40μL，反復幾次。事實上，超濾是很難把污染（比如SDS）完全去掉的，最終仍然會有極少量的污染物存在，但當這些污染物的濃度降到一定程度時，則樣品的純凈度我們認為是可以接受的了。

透析 ：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積比較大的樣品，比如尿液，可以將鹽透析至外面的透析液里。

丙醇沉澱 ：-20℃丙酮（V _樣品 ：V _冷丙酮 =1：3以上）沉澱2個小時以上。

C18色譜柱脫鹽法 ：Waters公司生產的XBridge C18色譜柱，利用柱子上的填料與蛋白結合，而鹽類物質則流穿過去，從而達到分離的目的。

脫鹽完成以後，接下來我們就要進行相當重要的一步：還原烷基化及酶解。整個流程，大夥兒看下面這張圖：

這裡面有兩件事要先跟大夥兒聊聊。

首先，我們來說說為什麼步驟里要把丙酮沉澱放在烷基化以後。通過之前的學習，我們知道丙酮可以溶解樣品的去污劑、還原劑等，而蛋白是不會在丙酮中溶解的，而是會沉澱下來，這樣就達到了去除雜質的目的。

烷基化以後，球狀蛋白變成鏈狀，再通過丙酮沉澱去掉尿素或SDS等污染物，然後復溶（即重新溶解，以備下一步酶解操作），那麼鏈狀的蛋白比球狀蛋白的復溶效果會更好，可以避免因為復溶不充分而造成的損失。因此，丙酮沉澱要放在烷基化之後再做。

另外，關於酶切這一步，有些抗體如果只用胰酶進行酶切，由於酶切位點太少，導致切出來的肽段太長，不便於質譜檢測。這種情況下可以結合其它酶，比如Lys-C，進行多酶酶切，使肽段變得短一些。經過測試我們發現，用Lys-C+胰酶酶切，比只用胰酶酶切，可以提高10%-20%的鑒定率。

酶解需要在buffer體系下完成，比如25mM碳酸氫銨體系（易揮發，pH 7-8）最為常用，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺鹽，10-100mM）。

酶的用量可以參考以下的公式：

W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50

此外，需要注意的是胰酶酶解的兼容性問題。胰酶只能耐受最多1M的尿素，且不能與SDS同時使用。

前面提過，質譜儀是一種離子飽和性儀器，高豐度蛋白的存在會對低豐度蛋白的信號產生抑制，並且質譜儀反應也需要一定的時間。例如，人的細胞內通常會表達20300種蛋白，它們酶解後，每種蛋白會產生10-20種肽段，那麼就有幾十萬種肽段，質譜很難同時檢測到這么多種肽段。所以對肽段混合物進行分級，可以降低檢測的難度，得到更多的肽段/蛋白鑒定結果。

我們既可以從蛋白水平進行分離，也可以從肽段水平進行分離，還可以將多種分離手段結合起來。從蛋白水平的分離，大家都比較熟悉吧？通常我們用SDS-PAGE或IEF等技術，利用蛋白質的分子量、形狀、等電點等理化性質的不同，將混合在一起的蛋白質分開。

第二種分離方案是在肽段水平上進行，根據肽段的不同性質，使用不同填料進行分離。

SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅膠為基質的強陽離子交換柱，可以與陽離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陽離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陽離子的肽段分離的目的。

SAX（Strong Anion Exchange）：硅膠鍵合季銨基團的強陰離子交換柱，可以與陰離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陰離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陰離子的肽段分離的目的。

RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色譜柱，與正相柱在表面鍵合極性官能團不同，反相柱的表面鍵合的是非極性的官能團，例如，鍵合十八烷基官能團，稱為C18柱，其它常用的還有C8，C4和C2等。這里我們選用C18柱，根據肽段疏水性的不同，達到分離的目的。

HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：親水色譜柱可以用來分離極性化合物。由於強極性肽段在反相色譜柱中保留情況都比較差，很難將它們分開，而親水色譜柱卻可以用來固定強極性的肽段，並結合高比例有機相與低比例水相組成的流動相，來實現分離的目的，且這樣的流動相組成尤其有利於提高電噴霧離子化質譜（ESI-MS）的靈敏度。

High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相條件，結合pH2的RPLC酸性條件，進行分離。

多維分離：例如，先從蛋白水平進行分離，再從肽段水平進行分離，或者多種肽段水平的分級分離結合起來使用。接下來我們重點聊一下各種多維分離的策略和效果。

我們先來看看上面這張圖。左上角的「A圖「展示的是通過High pH - Low pH RPLC將樣品分成了40個餾分，然後進行叉開的合並，合並為20個餾分，這樣的合並可以讓樣品中的肽段分布更加均勻。

右上角的」B圖」展示的是通過SDS-PAGE進行分離，也分成20個餾分，然後用兩種合並方案，分別合並為5個餾分和6個餾分，這樣做的目的也是為了讓樣品的肽段分布更加均勻。

左下角的「C圖」針對同一種樣品，對High/Low pH RPLC和SDS-PAGE兩種分離策略進行了比較，發現經過兩種分離方法後，有5408個蛋白是都可以鑒定到的，另外有1951種蛋白是只在High/Low pH RPLC分離策略中鑒定到的，而用SDS-PAGE分離，則可以鑒定到其它389種蛋白。從這個圖上看，兩種方法有互補性。

右下角的四幅小圖說明，當我們在做分級分離時，分的級別越多，能鑒定到的蛋白也就越多。不過這種增長並不是呈線性關系的，分級的級數達到一定程度時，能鑒定到的蛋白數量的增長就會飽和。所以比較省時省力又能保證效果的做法時，選擇一個合適的分級數即可。

我們來看一下目前發表的文獻里，利用多級分離所能鑒定到的蛋白數量。

就像前面說到的，對蛋白及多肽分離的級數越多，能鑒定到的蛋白也就越多，但常常因為機時的限制，再加上這種變化趨勢到一定程度總會飽和，所以我們通常有個權衡。比如常規的分10個餾分，基本上可以鑒定到5000-8000個蛋白。如果是血清樣品，可以餾分更多一些，尤其是RPLC一維，如果分到40或60個餾分，再合並為10或20個餾分，比直接分成10個或20個餾分能鑒定到的蛋白要多30%左右！

樣品前處理的各個步驟就介紹到這，下篇將繼續分享樣品前處理的最新方法與進展

③ 液相的柱壓不穩定，總是上下波動且幅度很大，可以怎麼解決

當液相柱壓不穩定時可以進行以下操作：

1、檢查是否脫氣，壓力不穩定很可能是管路中有氣泡。

2、更換密封墊，泵密封墊損壞，會把空氣帶進泵內。

3、打開泵的排氣閥，按purge健排氣，或者以大流速（2ml/m）排氣，流動相真空脫氣或者超聲脫氣。

4、換下雙泵,沖洗閥的過濾芯，將流動相混合均勻後,超聲20min後,真接單泵分析就可。

5、檢查是否是柱子久用引起的柱壓不穩，用異丙醇：甲醇＝10:90沖，流速要調低。

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在選擇色譜柱之前，先多了解自己的樣品和雜質，他們的類型結構、極性、酸鹼性、分子量大小等等。

1.樣品是極性的且弱酸性的，就可以選擇C18在100%酸性水溶液條件下檢測，即要選擇承受100%純水且對極性化合物保留很好的色譜柱。

2. 如果樣品極性太強，或酸性太強，可以選擇CN，NH2，或硅膠柱，HILIC（親水色譜），也有使用C18+強陰離子對試劑或強陰離子交換色譜柱。

（缺點是離子對試劑平衡時間長，對流動相pH要求比較精密，否則很難重復實驗，另外離子對試劑很難洗下來，基本上用了離子對的色譜柱就不能再用於其它實驗）。

3. 若樣品是鹼性的，可選擇高純硅膠柱（高純硅膠缺少金屬雜質，且硅膠端基封尾）或一些經過修飾的C18柱（如極性嵌入技術或鹼去活技術等）。

他們都會減少鹼性化合物的拖尾，一般會選擇中性或偏鹼的條件下做，因為這樣可增加鹼性樣品的保留。

4.如果鹼性化合物的極性太強，或鹼性太強，可以選擇寬pH的C18色譜柱在高pH值檢測（優點是方法開發簡單，缺點是目前實 現這一技術的色譜柱品牌比較少，價格也高）。

或者選用HILIC色譜柱（硅膠柱在反相條件下使用，這也是很經典的檢測鹼性樣品的方法）選擇強離子交換柱也有使用C18+強陰離子對試劑或強陰離子交換色譜柱。

④ 離交柱陰柱難淋洗怎麼辦

陰離子交換柱的清洗方式通用有三種，分別用於清洗酸溶性、鹼溶性或有機污染物，在清洗過程中必須要確保嚴格按照清洗過程進行，否則會引起色譜柱的局部高壓而損壞色譜柱。對於有機溶劑清洗色譜柱，需要逐步減少有機溶劑的量以避免由於混合的流動相黏度的變化。

（一）選擇合適的清洗溶劑

1、對高價親水污染物：用1~3mol/l的鹽酸做淋洗液。

2、對低價親水污染物：用10倍的淋洗液。

3、有機污染物：有機污染物會引起色譜柱效降低，可以採用兼容的有機溶劑清洗，有時也可以採用高濃度的鹽酸與有機溶劑混合清洗則更有效。

4、對金屬污染物：會引起色譜峰不對稱性，可採用絡合劑酸類，如0.2mol/l草酸。

（二）清洗過程

1、配製500mL合適的清洗溶液。

2、斷開抑制器中，分別清洗保護住和分離柱，如果分離柱和保護住串聯清洗，則將保護柱接在分離柱之後。

3、設置流速對2mm色譜柱採用0.5ml/min，而對4mm色譜柱採用2ml/min。

4、用二次去離子水沖洗色譜柱15min。

5、用清洗液清洗色譜柱60min。

6、用二次去離子水沖洗色譜柱15min。

7、連接抑制器，用淋洗液平衡色譜柱。

⑤ 陰離子交換柱流出水的電導率為什麼遠小於陽離子交換柱流出水

陰離子交換柱和陽悉局皮離子交換柱都是常見的離子交換色譜柱，但是它們的工作原理和流出水的離子種類不同，因此流出水的電導率也不同。
在陰離子交換柱中，固定相通常是帶有正電荷的樹脂，它可以吸附帶有負電荷的陰離子。當樣品溶液通過柱子時，陰離子會被樹脂吸附，而流出水中的離子主要是未被吸附的陽離子。因此，陰離子交換柱流出水的電導率遠小於陽離子交換柱流出水。此外，陰離子交換柱的流出水通常需要用鹼性溶液進行洗脫，這些鹼性離子也會降低流出水的電導率。
相比之下睜差，陽離子交換柱中的固定相是帶有負電荷的樹脂，它可以吸附臘鄭帶有正電荷的陽離子。當樣品溶液通過柱子時，陽離子會被樹脂吸附，而流出水中的離子主要是未被吸附的陰離子。因此，陽離子交換柱流出水的電導率通常比陰離子交換柱高。
總之，陰離子交換柱和陽離子交換柱的工作原理不同，導致它們流出水的離子種類和電導率也不同。

⑥ 高效液相色譜柱的一些要求

最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠。反相色譜系統使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。
填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。孔徑在15nm（1nm=10&Aring;）以下的填料適合於分析分子量小於2000 的化合物，分子量大於2000 的化合物則應選擇孔徑在30nm 以上的填料。除另有規定外，分析柱的填充劑粒徑一般在3μm~10μm 之間。粒徑更小（約2μm）的填充劑常用於填裝微徑柱（內徑約2mm），使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當的調整。當對其測定結果產生爭議時，應以品種正文規定的色譜條件的測定結果為准。 存放前除去雜質和鹽，採用合適的存放溶劑，避免色譜柱床的乾枯，避免機械振動，防止細菌生長，注意存放的溫度。