陰離子交換柱檢測多糖

① 膜分離技術可以完成糖類物質分離嗎

到現在為止膜分離技術暫時不可以完成糖類物質分離。

可以完成糖類物質分離的方法： 分步沉澱法、柱層析法、陰離子交換法、凝膠色譜法、大孔樹脂柱色譜、超濾法

先將糖類物質提取出來

• 分步沉澱法

多糖的結構和分子量不同，其極性大小不同，在有機溶劑（如醇或酮）中的溶解度不同，根據這一原理，可以依次增加醇濃度，從而將多糖按分子量從大到小的沉澱出來。仍需要藉助柱層析法等進一步純化，方可得到均一性的多糖。

• 柱層析法

要獲得均一性的多糖，一般是先經過陰離子交換柱進行粗步純化，然後再用凝膠柱進一步純化。有些多糖也採用大孔樹脂柱進行純化。下面對這三種柱層析法進行詳細介紹。

• 陰離子交換法

一般使用陰離子交換柱對真菌、藻類和高等植物的多糖進行初步分離。陰離子交換色譜常用的介質有DEAE-纖維素、DEAE-瓊脂糖凝膠、DEAE-葡萄糖凝膠。

• 凝膠色譜法

凝膠色譜法根據被分離組分尺寸大小與凝膠的孔徑關系實現分離，類似於分子篩的作用。常用的凝膠有葡聚糖凝膠（SephadexG）、Sephadex LH-20、聚丙烯酸凝膠Toyopearl HW等。多糖的進一步分離往往會選擇用各種凝膠進行分離純化。

• 大孔樹脂柱色譜

大孔樹脂柱色譜是利用大孔樹脂的選擇性吸附作用和分子篩作用分離純化多糖。比如用AB-8大孔樹脂從青錢柳葉中分離純化出均一性多糖。

• 超濾法

超濾是以壓力為推動力的膜分離技術，應用膜分離原理將小分子溶質和溶劑除去而留下大分子溶質，從而使大分子物質得到純化。

② DEAE纖維素柱的原理

DEAE纖維素柱原理，基於離子交換層析：離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖回維素組成。

陰離子答交換基質結合，帶有負電荷的蛋白質，然後這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質從而洗脫下來。

(2)陰離子交換柱檢測多糖擴展閱讀：

基本信息：

性狀：乾燥纖維狀。

用途：用於柱色譜分析，用以分離提純多糖、肽、核苷酸、酶、血清組分和病毒等，陰離子交換填料。

保存：常溫乾燥封袋保存。

DEAE—纖維素的使用方法：

稱取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸餾水浸泡過夜，觀察溶脹後DEAE的體積。根據所需層析柱的柱床體積計算所需DEAE的用量，稱取所需DEAE用蒸餾水浸泡過夜，其間換幾次水，每次除去細小顆粒。

抽干，改用0.5mol/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用無離子水漂洗，使pH至8左右（用pH試紙檢查）。再改用0.5mol/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用無離子水洗至pH6左右。本實驗中在用前應以0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，浸泡平衡後使用。

③ 多糖的純化方法與哪些

多糖純化：
a、分部沉澱法：根據各種多糖在不同濃度的低級醇或丙酮中具有不同溶解度的性質，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉澱，經反復溶解與沉澱後，直到測得的物理常數恆定（最常用的是比旋光度測定或電泳檢查）。這種方法適合於分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩定，常在pH7進行，唯酸性多糖在pH7時－COOH是以－COO` 離子形式存在的，需在pH2－4進行分離，為了防止苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖製成各種衍生物如甲醚化物、乙醯化物等，然後將多糖衍生物溶於醇中，最後加入乙醚等極性更小的溶劑進行分級沉澱分離。
b、鹽析法：在天然產物的水提液中，加入無機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉澱析出，與其它水溶性較大的雜質分離。常做鹽析的無機鹽的有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
c、季銨鹽沉澱法：季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉澱，常用於酸性多糖的分離。通常季胺鹽及其氫氧化物並不與中性多糖產生沉澱，但當溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時，也會與中性多糖形成沉澱。常用的季銨鹽有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的濃度一般為1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉澱出來，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小於9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會被沉澱出來
d、柱層析：
纖維素柱層析：纖維素柱層析對多糖的分離既有吸附色譜的性質，又具有分配色譜的性質，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先後順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最後出柱，與分級沉澱法正好相反。
纖維素陰離子交換柱層析：最常見的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或鹼型），洗脫劑可用不同濃度的鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適於分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝膠柱層析：凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開來，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（sephadex G）、瓊脂糖凝膠（sepharose bio－gel A）、聚丙烯醯胺凝膠（bio－gel P）等，常用的洗脫劑是各種濃度的鹽溶液及緩沖液，但它們的離子強度最好不低於0.02。出柱的順序是大分子的先出柱，小分子的後出柱。由於糖分子與凝膠間的相互作用，洗脫液的體積與蛋白質的分離有很大的差別。在多糖分離時，通常是用孔隙小的凝膠如sephadex G－25、G－50等先脫去多糖中的無機鹽及小分子化合物，然後再用孔隙大的凝膠sephadex G－200等進行分離。凝膠柱層析法不適合於粘多糖的分離。

④ 離子交換純化多糖使用什麼方法檢測收集

離子交換純化多糖使用什麼方法檢測收集
鑒定多糖（參考資料）：
1.苯酚-硫酸法 需要多糖的純品和特定的酶
2.蒽酮-硫酸法 多糖在濃硫酸水合產生的高溫下迅速水解，產生單糖，單糖在強酸條件下與苯酚反應生成橙色衍生物。在波長490nm左右處和一定濃度范圍內，該衍生物的吸收值與單糖濃度呈線性關系，從而可用比色法測定其含量，所用的單糖對照品盡量採用與其多糖組成一致或為含量較高的單糖，這樣測得的值較准確。
3.3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法） 在鹼性條件下顯色，較准確測定還原糖與總糖的含量從而求出多糖的含量，可消除還原性雜質的干擾。

多糖的分離純化
在多糖提取物中，常會有無機鹽、蛋白質、色素及小分子物質等雜質，必須分別除去．一般是先脫除非多糖組分，再對多糖組分進行分級．
2．1 除蛋白：除蛋白質時一般選擇能使蛋白質沉澱而不使多糖沉澱的試劑來處理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必須處理時間短，溫度低，避免多糖降解。Sevage法（氯仿：戊醇/丁醇=4：1）和三氟三氯乙烷法在避免降解上有較好效果但要達到除盡游離蛋白質的目的仍需反復處理。如能加入蛋白質水解酶，使蛋白質大分子進行一定程度的降解，再用Sevage法處理，一般效果更好。
為了避免使用有機溶劑也可採用反復凍融的方法除蛋白，將多糖液濃縮後，一20℃室溫反復凍融7～8次，離心除去蛋白質。另外，蛋白質在等電點時溶解度最小，用氫氧化鈣飽和液調pH10～pH11可除去偏鹼性的蛋白質，然後再用硫酸調pH5～pH6，可除去偏酸性的蛋白質。凍融和等電點沉澱除蛋白質操作簡單，但多糖液里往往有低濃度的蛋白質殘留，應與其它方法結合使用。
2．2 脫色：植物多糖提取物中含有酚類化合物而使其顏色較深，可用吸附劑(纖維素、硅藻土、活性炭等)、離子交換柱(DEAE一纖維素)、氧化劑(H2O2)等脫除。活性炭比表面積大，吸附能力強，在進行當歸多糖的提取時只向多糖液中加入了0．1％左右的活性炭，煮沸後濾過即完成了脫色操作。此法成本低廉，適合工業化生產。
2．3 除小分子雜質
小分子雜質如低聚寡糖的殘留往往影響多糖的生物活性，需要進一步脫除，提高純度。傳統的方法是透析法，該法操作簡單、技術成熟，但周期長，往往需要2一3天，常溫下操作有可能造成多糖的霉變，必要時需加入少量防腐劑或需在低溫條件下進行。隨著膜分離技術的發展，纖維濾器透析法已經發展起來了，它利用不同孔徑的膜使大小不同的分子分級，這種方式可縮短生產周期，而且條件溫和，無疑是多糖脫除雜質的一條新途徑。
2．4 多糖的分級純化
採用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分級的方法可達到純化的目的．可按溶解性不同進行分級、按分子大小和形狀分級(如分級沉澱、超濾、分子篩、層析等)，也可按分子所帶基團的性質分級．
2．4．1按溶解性不同分離
2.4.1.1分步沉澱法
分步沉澱法是根據不同多糖在不同濃度低級醇、酮中具有不同溶解度的性質，從小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮進行分步沉澱．
2.4.1.2 鹽析法
鹽析法是根據不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同而將其分離的一種方法。常用的鹽析劑有氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等，其中以硫酸銨最佳。
2.4.2 按電離性質不同分離
2.4.2.1季胺鹽沉澱法
季胺氫氧化物是一類乳化劑，能與酸性多糖形成不溶性化合物季銨絡合物，此絡合物在低離子強度的水溶液中不溶解而產生沉澱。若提高多糖液pH值或加入硼砂緩沖液，也可使中性多糖沉澱分離。常用季銨鹽有十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。
2．4．3 柱層析法
2.4.3.1凝膠柱層析法
凝膠柱層析法常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，從而使不同大小的多糖分子得到分離純化，但不適宜粘多糖的分離。
2.4.3.2纖維素陰離子交換劑柱層析法
纖維素陰離子交換劑柱層析法常用的交換劑為DEAE一纖維素和ECTEOLA一纖維素，分類硼砂型和鹼型兩種，洗脫劑可用不同濃度鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液，其優點可吸附雜質、純化多糖，並適用於分離各種酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙參多糖、太子參多糖等。
2.4.3.3 活性炭柱層析法
活性炭吸附量大、效率高，是分離水溶性物質的常用吸附劑。柱層析時活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀釋劑，以增加溶液的流速。糖溶液上柱後先用水洗脫無機鹽、單糖等再依次增加乙醇濃度進行洗脫。
2.4.3.4 離子交換柱層析和普通凝膠柱層析聯用法
有些植物的多糖成分復雜， 除中性多糖外，還含有糖醛酸等，因此往往兩種不同性質的色譜柱聯用才能得到單一多糖組分。
2.4.3.5 三種層析柱聯用
採用離子交換葡聚糖凝膠柱、丙烯葡聚糖凝膠柱和葡聚糖凝膠柱三者聯用，即先進行DEAE—SephadexA柱層析，用蒸餾水洗脫。水洗組分進一步用SephacrylS柱層析，得到主要組分再用SephadexG一100柱層析，有時會有較高的得率。
三、多糖的純度鑒定
經過分級純化的多糖在測定結構前須進行純度鑒定．而且多糖的純度不能用通常化合物的純度標准來衡量，因為即便是多糖純品，其微觀也並不均一，僅代表相似鏈長的多糖分子的平均分布，通常所謂的多糖純品也只是一定相對分子質量范圍的多糖的均一組分．目前常用於多糖純度的鑒定方法有：高效液相、 凝膠層析法、電泳法、色譜法、旋光度法等．

多糖的單糖組分的鑒定稱取多糖粗品8 mg，用2 mL濃度為1 mol／L硫酸100*C水解6 h。飽和Ba(OH)2中和至中性，抽濾，取濾液，濃縮，毛細管點樣，薄層層析法分析。採用硅膠G板105"(2活化2 h後使用。標准糖分別為D一半乳糖，D一葡萄糖，D一甘露糖，L一山梨糖、L一阿拉伯糖。展開劑為正丁醇一冰醋酸一水(4：1：5)(體積比)。用AgNO3一NaOH 溶液顯色。

⑤ 多糖的紫外光譜怎麼看

經過分級純化的多糖在測定結構前須檢查其純度及測定分子量。
檢查純度最常用的判斷方法：
（1）用gc、hpLc測純吵做定組成多糖的單糖的摩爾比是否恆定。
用不同的柱型測定結果更為可靠。
（2）電泳只出現一條帶。
如可用聚丙烯醯胺凝膠電泳、乙酸纖維素薄膜電泳及玻璃纖維紙電泳。對於碰頃中性多糖可採用高壓電泳，以硼酸鹽為緩沖液，可增大其遷移速度。
（3）凝膠柱層析圖呈現對稱的單峰。若有「拖尾」現象，說明其均一性不夠好。陰離子交換層析純化
用DeAe一纖維素52(2.6x100cm)柱層析,0.lmol/Lnacl洗脫,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管檢測,繪制收集體積與糖含量之間的關系曲線。看是否有單一對稱峰。
按照Ye等報道,採用DeAe一52一纖維素交換柱層析法(2.6x30cm)對鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖進行初步分離。DeAe一纖維素凝膠預處理:稱取DeAe一52一纖維素凝膠乾粉,加入約10倍體積質量比(ml/g)的0.5mol/Lna0h溶液浸泡30分鍾,倒出上清液,用大量去離子水反復浸洗至ph值近中性;再用相同體積的0.5mol/LhcI溶液浸泡30分鍾,倒出上清液,用大量去離子水反復浸洗至ph值近中性;最後用相同體積的0.5mol/lnaoh溶液再浸泡30分鍾,用大量去離子水反復浸洗至ph值中性。處理完畢後,進行濕法裝柱,用去離子水0.5mol/Lnacl溶液,去離子水依次分別平衡(流速1.0ml/min)2一3個柱體積備用.
糖樣100mg溶於5ml的去離子水中,離心除去不溶物,上樣於DeAe一52一纖維素陰離子
-1層析柱(2.6x30cm,cl型),分別採用去離子水0.1和0.3mol/LnacI溶液進行分段梯度洗脫,
流速1.0ml/min,自動收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。用硫酸一苯酚法跟蹤檢測各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數為橫坐標。吸光值(490nm)為縱坐標繪制DeAe一52一纖維素色譜柱洗脫曲線。依據洗脫峰型,合並相同組分,50℃旋轉蒸發濃縮,對去離子水透析48h以去除nacI及小分子雜質,最後將透析內液冷凍乾燥,得初步純化產品。
初步純化多糖得率計算公式:
多糖得率(%)=純化多糖質量/粗多糖質量x100%
葡聚糖凝膠層析純化
採用sephadexg-100凝膠層析法對DeAe-52一纖維素初步純化的不同組分的多糖樣品進一步純化。葡聚糖凝膠(sephadexg一100)的預處理:稱取sephadexg一100凝膠乾粉,加入30倍體積質量比(ml/g)的去離子水,沸水浴5小時使其溶脹。冷卻後用去離子水反復浸洗,減壓脫氣後進行濕法裝柱,用0.1mna2so4;溶液平衡(流速0.25ml/min)2一3個柱體積備用。
分別稱取經DeAe一纖維素一52初步純化的各多糖組分樣品20mg,溶於2ml0.1mna2so4溶液中,上樣於sephadexg一100層析柱(2.6x60cm)用0.1mna2so4溶液溶液洗脫,流速0.25ml/min,分步收集(5ml/管)。
用硫酸一苯酚法跟蹤檢測各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數為橫坐標。吸光值(490nm)為縱坐標繪制sephadexg一100色譜柱洗脫做衡曲線。依據洗脫峰型,合並相同組分,50℃旋轉蒸發濃縮,對去離子水透析48h以去除na2so4;及小分子雜質,最後將透析內液冷凍乾燥,得不同純化產品。
純化多糖得率計算公式:
純化多糖得率(%)=純化多糖質量/粗多糖質量x100%
（鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖）
（4）紙層析法呈單一集中斑點。
取0.5%的多糖樣品溶液50ul,點樣於新華中速濾紙(3cmx20cm)距端點1cm處的中部,以正丁醇:濃氨水:水(4o:50:5)為展開劑,飽和2小時以上,在室溫下展開6h,取出吹乾,用0.5%甲苯胺藍液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一個清晰的斑點。
（5）瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳法
在瓊脂糖板(厚度為0.2cm)上點樣3一5ul採用濃度為0.075mol/L,ph8.6的巴比妥緩沖液,電泳1-1.5h,電壓為64一80V,甲苯胺藍(濃度為1%)染色,醋酸乙醇混合溶液(醋酸:乙醇:水=0.1:5:5)脫色。多糖純品經電泳展開後,看是否呈現單一斑點,斑點是否清晰。
（6）紫外分光光度法
將多糖pwZ加0.9%nacI溶液溶解,配成濃度為1mg/ml的溶液,採用uV一16oA紫外可見光譜儀掃描(200nm一30onm)觀察260nm、280nm處是否有吸收峰。
多糖的分子量測定：
過去用超速離心沉降法、光散射法、滲透壓法、粘度法(:多糖質譜鑒定)等，這些方法操作復雜且誤差較大，現已少用。現在較常用的方法有凝膠過濾法和高效凝膠液相色譜法，這兩種方法須先用已知分子量的標准多糖對照測定樣品的分子量。
一般來說，多糖結構分析包括以下幾點：
（1）單糖組成分析：研究確定單糖的種類及摩爾比；
完全酸水解後用高效液相色譜方法(hpLc)或氣相色譜方法測定。
（2）糖苷鍵類型：研究確定糖苷鍵及支鏈點連接位置；
甲基化分析方法
高碘酸氧化法與smith降解法
（3）糖環大小：研究確定糖苷鍵為呋喃糖或吡喃糖；
紅外光譜
（4）異頭碳構型：研究確定糖苷殘基的a-或p-構型；
2DnmR.()光譜分析方法測
（5）確定單糖殘基和重復單元的序列
甲基化分析方法與磁共振光譜分析方法結合分析，一般會參考多糖的單糖組成及摩爾比信息以利於解析多糖結構。
高碘酸氧化法
薄層層析(TLc)——定性，
氣相色譜法
（6）取代基團位點：研究0h-修飾基團的種類和取代位點，如0-磷酸化，乙丑基取代，0-
硫酷化等；
比色分析方法
（7）多糖分子量分布的研究。
紫外光譜
定性與定量方法
薄層層析：殘基定性
氣相色譜：殘基定量
氣質聯用：殘基定量
高效陰離子色譜法：殘基定量
鑒定結構常用物理化學方法：
高效液相色譜:確定單糖組分和相對分子量
紅外光譜分析:測定多糖的官能團，不僅可以檢測酮糖、酵糖的恥喃糖環或呋喃糖環的構象和糖苷鍵的構型
核磁共振:α-構型與β-構型殘基的比例；判斷異頭碳構型；推斷主鏈和支鏈連接鍵型鑒定結構復合方法：
甲基化分析:推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例
高碘酸氧化法與smith降解法:判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度及支鏈多糖的分支數目
糖睛乙酸酷衍生物的氣相色譜法:單糖組成和摩爾比
各種多糖化學結構鑒定方法的具體實施方案
1、酸水解
（1）完全酸水解
-1稱取20mg樣品,加入2mL2mol·L的h2so4於安培管中沸水浴水解8h,水解液用
baco3中和至ph=7,離心,取上清夜置冰箱冷藏備測。（阿魏側耳子實體多糖分離純化及其化學結構的初步研究）
（2）部分酸水解
稱取糖樣70mg，80℃條件下，0.05m三氟乙酸水解2h。降至室溫後，離心（4000r/min，10min），將沉澱乾燥，留做gc分析。上清用無水乙醇除酸至中性(ph為6～7)，蒸餾水透析48h：將袋外透析液濃縮，真空乾燥，留做gc分析；袋內液濃縮至5ml左右，加10倍體積無水乙醇，醇沉過夜，離心(4000r/min，10min)，沉澱常規乾燥，作gc分析；上清濃縮，真空乾燥，留做gc分析。
2、高效液相色譜
確定樣品的單糖組成
色譜條件為:
色譜柱為shodexKs804sugar(300mm×7.8mm)
柱溫40度
流動相為水
-1流速0.8mL·min
檢測用410RⅠ示差檢測器，數據處理用810gpc軟體進行。
同時用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、岩藻糖8種單糖進
行對照,根據峰值確定樣品的單糖組成。
分子量的測定以標準分子量的葡聚糖pulluan作分子量測定標准。讓其通過高壓液相色譜柱,條件同上,先以分子量對數與對應的保留時間作標准曲線,從標准葡聚糖pulluan的工作曲線上可以求得該成分分子量。
例如：（阿魏側耳子實體多糖分離純化及其化學結構的初步研究）
將水解後的多糖樣品pw2進行hpLc分析,結果如表所示:阿魏側耳子實體多糖pw2經過酸水解後,得到2種單糖:葡萄糖和半乳糖,摩爾比例1.77∶1。
例如：
4經hpLc測定後對照標准曲線得多糖pw2的分子量為3.18×10。（阿魏側耳子實體多糖
分離純化及其化學結構的初步研究）
4、甲基化分析
(1)基本原理
先將多糖中各種單糖殘基中的游離羥基全部甲基化，然後將多糖中的糖苷鍵進行完全酸水解，水解後得到的化合物，其羥基所在的位置，即為原來單糖殘基的連接點。同時根據不同甲基化單糖的比例，可以推測出此種連接鍵型在多糖重復結構中所佔的比例。
用此種方法得到的羥基及nabh4還原醛基後產生的羥基，經乙醯化可得到甲基化的糖醇乙酸酯(此產物易揮發，可進行gc分析)，再經gc與gc-ms分析，通過氣相色譜的出峰順序和對質譜譜圖的主要離子碎片的分析便可以較准確地確定糖的連接鍵型。
反應通式如下
:
（2)甲基化反應
取充分乾燥的多糖樣品10mg，溶解在2.0ml的二甲基亞礬（Dmso)中。在n2保護下快速加入乾燥的naoh粉50mg，用n2排出空氣，加蓋密封，室溫反應1.0h並間歇振盪。在n2保護下緩慢滴加碘甲烷1.0ml，用n2排出空氣，加蓋密封，室溫繼續反應1.0h並間歇振盪，反應完成後加0.5ml水終止反應。反應液先用自來水流水透析48h，再用蒸餾水透析24h，透析液冷凍乾燥得第一次甲基化樣品。第一次甲基化樣品繼續甲基化，反應步驟同上，得第二次甲基化樣品。如此重復甲基化三次。甲基化後的樣品用紅外光譜檢測，3700
cm-1—3100cm-1，附近無羥基的特徵吸收峰，表明甲基化反應完全。
（3)甲基化樣品的衍生化
上述完全甲基化多糖樣品加入2mol/1的三氟乙酸(TFA)3.0ml,120℃密閉水解2.0h。冷卻後50℃減壓蒸發干，加2.0ml甲醇再蒸發干，重復三次，最後蒸發幹得完全甲基化多糖的水解產物。加蒸餾水2.0ml使其溶解，再加硼氫化鈉25mg，振盪後室溫還原反應2.0h。反應完後滴加0.1mol/1醋酸分解過量的硼氫化鈉並調ph值至5.5~7.0弱酸性。反應液50℃減壓蒸發蒸干，加2.0ml甲醇再蒸干，重復三次，最後蒸發干。
上述蒸發干樣品加入1.0ml醋酸酐和1.0ml吡啶，封管後在沸水浴中反應1.0h。反應液50℃減壓蒸發干，加2.0ml甲醇再蒸發干，重復三次，最後蒸發干。加入丙酮1.0ml，用0.45ul尼龍微孔濾膜過濾，取樣進行gc/ms分析。
(4)衍生化樣品的gc/ms分析
多糖樣品經甲基化、水解、還原、乙醯化後得到甲基化糖醇乙酸酯，進行gc/ms聯機分析，根據文獻的相對保留時間和不同單糖的主要離子碎片(m/e），推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例。
本實驗採用的條件為:gc(Variancp3800型)和ms（Variansatum2200型)氣相一質譜聯用儀，Db-5ms石英毛細管柱(30mx0.25mmx0.25um);程序升溫，初溫80℃，保持1min，以8℃/min升至210℃，保持1min，再以20℃/min升至260℃,保持1min;氦氣作載氣，進樣口溫度250℃，分流比1:50，柱流速1.0ml/min;電子電離源(eI源)70eV，倍增器電壓350V，燈絲電流250uA，介面溫度260℃,離子源溫度180℃，質荷比(m/z)掃描范圍30~450，掃描速率2.5scan/sec。（胞式層孔菌菌絲體多糖分離純化、結構鑒定及其生物活性研究）
流程圖如下：（mAep-2a-2b是安絡小皮傘菌絲體多糖的某個過程中第某個樣品）
篇二：1多糖含量檢測
億信檢測推出單糖組成方案
簡介：gc-ms（氣相質譜聯用技術測定單糖組成）
1多糖含量檢測
方法：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，並迅速脫水生

⑥ 多糖提取純化過程中的注意事項

多糖純化：
a、分部沉澱法：根據各種多糖在不同濃度的低級醇或丙酮中具有不同溶解度的性質，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉澱，經反復溶解與沉澱後，直到測得的物理常數恆定（最常用的是比旋光度測定或電泳檢查）。這種方法適合於分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩定，常在pH7進行，唯酸性多糖在pH7時－COOH是以－COO` 離子形式存在的，需在pH2－4進行分離，為了防止者基畢苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖製成各種衍生物如甲醚化物、乙醯化物等，然後將多糖衍生物溶於醇中，最後加入乙醚等極性更小的溶劑進行分級沉澱分離。
b、鹽析法：在天然產物的水提液中，加入無機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉澱析出，與其它水溶性較大的雜質分離。常做鹽析的無機鹽的有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
c、季銨鹽沉澱法：季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉澱，常用於酸性多糖的分首芹離。通常季胺鹽及其氫氧化物並不與中性多糖產生沉澱，但當溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時，也會與中性多糖形成沉澱。常用的季銨鹽有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的濃度一般為1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉澱出來，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小於9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會被沉澱出來
d、柱層析：
纖維素柱層析：纖維素柱層析鋒棚對多糖的分離既有吸附色譜的性質，又具有分配色譜的性質，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先後順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最後出柱，與分級沉澱法正好相反。
纖維素陰離子交換柱層析：最常見的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或鹼型），洗脫劑可用不同濃度的鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適於分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝膠柱層析：凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開來，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（sephadex G）、瓊脂糖凝膠（sepharose bio－gel A）、聚丙烯醯胺凝膠（bio－gel P）等，常用的洗脫劑是各種濃度的鹽溶液及緩沖液，但它們的離子強度最好不低於0.02。出柱的順序是大分子的先出柱，小分子的後出柱。由於糖分子與凝膠間的相互作用，洗脫液的體積與蛋白質的分離有很大的差別。在多糖分離時，通常是用孔隙小的凝膠如sephadex G－25、G－50等先脫去多糖中的無機鹽及小分子化合物，然後再用孔隙大的凝膠sephadex G－200等進行分離。凝膠柱層析法不適合於粘多糖的分離。

⑦ 多糖的純化方法與哪些

ctab即十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度的溶液中沉澱核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質和中性多聚糖仍留在溶液里，在高離子強度的溶液里，ctab與蛋白質和大多數酸性多聚糖以外的多聚糖形成復合物，只是不能沉澱核酸。因此，ctab可以用於從大量產生粘多糖的有機體如植物以及某些革蘭氏陰性菌（包括e.coli的某些株）中制備純化dna
去垢劑(表面活性劑)是一類即具有親水基又具有疏水基的物質，一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分陰離子、陽離子和中性去垢劑等多種類型，中性去垢劑在蛋白提取鍾應用的較多。
a．中性去垢劑
又稱非離子表面活性劑，對蛋白質的變性作用影響較少，宜於蛋白質或酶提取之用。一般市售中性去垢劑有聚乙二醇類，如peg200；多元醇類表面活性劑，如山梨醇、司盤類和吐溫類；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄澤類、平平加類；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如igepal
co、乳化劑op、triton、pluronic(用作消泡劑、潤濕劑、增溶劑)、泡敵。中性去垢劑作用後可通過sephadex
lh-50柱除去；也可直接上deae-sephadex柱層析分離目的蛋白，不必先除去去垢劑。
b．陰離子去垢劑
常見的有十二烷基硫酸鈉和十二烷基璜酸鈉。前者可促進核蛋白的溶解，將核酸釋放出來，並對核酸酶有一定抑製作用，常用於核酸的提取。
c．陽離子去垢劑
如潔爾滅、新潔爾滅、ctab、cpc、zeph、克菌定、消毒凈（tmpb）、杜滅芬等，消毒滅菌類居多。
d．天然表面活性劑
又稱為生物表面活性劑，包括種類較為廣泛，如各種樹膠（阿拉伯膠、杏膠、桃膠、果膠）、明膠、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、瓊脂、海藻酸鈉、酪蛋白、膽甾醇、膽酸類、多糖類（如環糊精）等。
e．兩性表面活性劑
在鹼性水溶液中呈陰離子表面活性劑的性質，起泡性好，去污力也強；在酸性溶液中則呈現陽離子表面活性劑特徵，其殺菌性很強。
蛋白質變性劑的作用是破壞蛋白質的次級鍵，如氫鍵、鹽鍵和疏水力，引起天然構象的解體；它們並不破壞共價鍵，如肽鍵和二硫鍵，故不涉及一級結構的改變。變性劑有溶解型和沉澱型兩類，sds、尿素和胍鹽是有效的溶解型變性劑，而三氯乙酸、甲醇、和氯仿/異戊醇是有效的沉澱變性劑。一般而言，變性劑應用時常大大過量，破壞氫鍵的變性劑用量至少兩倍於氨基酸的克分子數，如1克蛋白質可可結合1.4g。
sds溶於水可達25%，對溫度敏感，w/v貯存液最為方便。需要注意的是sds的鉀鹽是不溶性的，所以sds溶液中要避免混入鉀鹽。
尿素極易溶於水，可達10mol/l,在8mol/l以上要注意溫度以防止沉澱。尿素在水中緩慢分解形成氨及高度活性的氰酸離子，故要防止高溫。
三氯乙酸與過氯酸（tca，pca）都是極好的沉澱劑，能沉澱蛋白質和核酸，前者應用更為廣泛。

⑧ 多糖的定性與定量

鑒定多糖（參考資料）：
1.苯酚-硫酸法 需要多糖的純品和特定的酶
2.蒽酮-硫酸法 多糖在濃硫酸水合產生的高溫下迅速水解，產生單糖，單糖在強酸條件下與苯酚反應生成橙色衍生物。在波長490nm左右處和一定濃度范圍內，該衍生物的吸收值與單糖濃度呈線性關系，從而可用比色法測定其含量，所用的單糖對照品盡量採用與其多糖組成一致或為含量較高的單糖，這樣測得的值較准確。
3.3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法） 在鹼性條件下顯色，較准確測定還原糖與總糖的含量從而求出多糖的含量，可消除還原性雜質的干擾。

多糖的分離純化
在多糖提取物中，常會有無機鹽、蛋白質、色素及小分子物質等雜質，必須分別除去．一般是先脫除非多糖組分，再對多糖組分進行分級．
2．1 除蛋白：除蛋白質時一般選擇能使蛋白質沉澱而不使多糖沉澱的試劑來處理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必須處理時間短，溫度低，避免多糖降解。Sevage法（氯仿：戊醇/丁醇=4：1）和三氟三氯乙烷法在避免降解上有較好效果但要達到除盡游離蛋白質的目的仍需反復處理。如能加入蛋白質水解酶，使蛋白質大分子進行一定程度的降解，再用Sevage法處理，一般效果更好。
為了避免使用有機溶劑也可採用反復凍融的方法除蛋白，將多糖液濃縮後，一20℃室溫反復凍融7～8次，離心除去蛋白質。另外，蛋白質在等電點時溶解度最小，用氫氧化鈣飽和液調pH10～pH11可除去偏鹼性的蛋白質，然後再用硫酸調pH5～pH6，可除去偏酸性的蛋白質。凍融和等電點沉澱除蛋白質操作簡單，但多糖液里往往有低濃度的蛋白質殘留，應與其它方法結合使用。
2．2 脫色：植物多糖提取物中含有酚類化合物而使其顏色較深，可用吸附劑(纖維素、硅藻土、活性炭等)、離子交換柱(DEAE一纖維素)、氧化劑(H2O2)等脫除。活性炭比表面積大，吸附能力強，在進行當歸多糖的提取時只向多糖液中加入了0．1％左右的活性炭，煮沸後濾過即完成了脫色操作。此法成本低廉，適合工業化生產。
2．3 除小分子雜質
小分子雜質如低聚寡糖的殘留往往影響多糖的生物活性，需要進一步脫除，提高純度。傳統的方法是透析法，該法操作簡單、技術成熟，但周期長，往往需要2一3天，常溫下操作有可能造成多糖的霉變，必要時需加入少量防腐劑或需在低溫條件下進行。隨著膜分離技術的發展，纖維濾器透析法已經發展起來了，它利用不同孔徑的膜使大小不同的分子分級，這種方式可縮短生產周期，而且條件溫和，無疑是多糖脫除雜質的一條新途徑。
2．4 多糖的分級純化
採用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分級的方法可達到純化的目的．可按溶解性不同進行分級、按分子大小和形狀分級(如分級沉澱、超濾、分子篩、層析等)，也可按分子所帶基團的性質分級．
2．4．1按溶解性不同分離
2.4.1.1分步沉澱法
分步沉澱法是根據不同多糖在不同濃度低級醇、酮中具有不同溶解度的性質，從小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮進行分步沉澱．
2.4.1.2 鹽析法
鹽析法是根據不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同而將其分離的一種方法。常用的鹽析劑有氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等，其中以硫酸銨最佳。
2.4.2 按電離性質不同分離
2.4.2.1季胺鹽沉澱法
季胺氫氧化物是一類乳化劑，能與酸性多糖形成不溶性化合物季銨絡合物，此絡合物在低離子強度的水溶液中不溶解而產生沉澱。若提高多糖液pH值或加入硼砂緩沖液，也可使中性多糖沉澱分離。常用季銨鹽有十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。
2．4．3 柱層析法
2.4.3.1凝膠柱層析法
凝膠柱層析法常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，從而使不同大小的多糖分子得到分離純化，但不適宜粘多糖的分離。
2.4.3.2纖維素陰離子交換劑柱層析法
纖維素陰離子交換劑柱層析法常用的交換劑為DEAE一纖維素和ECTEOLA一纖維素，分類硼砂型和鹼型兩種，洗脫劑可用不同濃度鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液，其優點可吸附雜質、純化多糖，並適用於分離各種酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙參多糖、太子參多糖等。
2.4.3.3 活性炭柱層析法
活性炭吸附量大、效率高，是分離水溶性物質的常用吸附劑。柱層析時活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀釋劑，以增加溶液的流速。糖溶液上柱後先用水洗脫無機鹽、單糖等再依次增加乙醇濃度進行洗脫。
2.4.3.4 離子交換柱層析和普通凝膠柱層析聯用法
有些植物的多糖成分復雜， 除中性多糖外，還含有糖醛酸等，因此往往兩種不同性質的色譜柱聯用才能得到單一多糖組分。
2.4.3.5 三種層析柱聯用
採用離子交換葡聚糖凝膠柱、丙烯葡聚糖凝膠柱和葡聚糖凝膠柱三者聯用，即先進行DEAE—SephadexA柱層析，用蒸餾水洗脫。水洗組分進一步用SephacrylS柱層析，得到主要組分再用SephadexG一100柱層析，有時會有較高的得率。
三、多糖的純度鑒定
經過分級純化的多糖在測定結構前須進行純度鑒定．而且多糖的純度不能用通常化合物的純度標准來衡量，因為即便是多糖純品，其微觀也並不均一，僅代表相似鏈長的多糖分子的平均分布，通常所謂的多糖純品也只是一定相對分子質量范圍的多糖的均一組分．目前常用於多糖純度的鑒定方法有：高效液相、 凝膠層析法、電泳法、色譜法、旋光度法等．

多糖的單糖組分的鑒定稱取多糖粗品8 mg，用2 mL濃度為1 mol／L硫酸100*C水解6 h。飽和Ba(OH)2中和至中性，抽濾，取濾液，濃縮，毛細管點樣，薄層層析法分析。採用硅膠G板105"(2活化2 h後使用。標准糖分別為D一半乳糖，D一葡萄糖，D一甘露糖，L一山梨糖、L一阿拉伯糖。展開劑為正丁醇一冰醋酸一水(4：1：5)(體積比)。用AgNO3一NaOH 溶液顯色。
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