Ⅰ 測定蛋白質中氨基酸含量的主要步驟有哪些為什麼一般分析報告顯示17種氨基酸成分
一般來說人體必須的17種氨基酸，也較為重視
氨基酸的定性測定
一、氨基酸的一般顯色反應
本節介紹三種顯色反應：茚三酮法、吲哚醌法和鄰苯二甲醛法。前二種是經典的常用顯
色法，後一種是近年來發展起來的熒光顯色法，具有靈敏度高的特點。
1. 茚三酮法
顯色方法有下列數種：
①常用法：將點有樣品的層析或電泳完畢的濾紙充分除盡溶劑，用 5g/L 茚三酮無水丙
酮溶液噴霧，充分吹乾，置65℃烘箱中約30min（溫度不宜過高，避免空氣中氨，以免背
景泛紅色），氨基酸斑點呈紫紅色。
為了使各種氨基酸呈現不同顏色，可用下列方法：
②用 0.4g 茚三酮，10g 酚和90g 正丁醇的混合液顯色。
③用 1g/L 茚三酮無水丙酮溶液顯色完畢後，再用鹽酸蒸汽熏1min。
④用 1g 茚三酮，600mL 無水乙醇，200mL 冰醋酸及80mL2,4,6-三甲基吡啶混合液80
℃染色5～10min。
為了使顯色穩定，可用下列方法：
⑤配製含醋酸鎘 2g 加蒸餾水200mL 及冰醋酸40mL 的貯存液。將上述貯存液加200mL
丙酮及2g 茚三酮，即為顯色液。點有樣品的濾紙上浸有此顯色液後，放置於盛有一小杯濃
硫酸的密閉玻璃容器中，25℃，18h，或較高溫度下適當縮短時間。背景色淺，氨基酸斑點
也比較穩定。
⑥用含 2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L 茚三酮異丙酮溶液顯色時，氨基酸斑點呈紅色，也
可在茚三酮顯色後噴以含鈷、鎘或銅等無機離子的異丙醇溶液，斑點自藍紫色變成紅色。
2．吲哚醌法
（1）原理
各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可藉此辯認氨基酸。氨對吲哚醌顯色沒
有妨礙，但其靈敏度較茚三酮法稍差，顯色不穩定，顏色只有在絕對乾燥的環境中才能保存。
（2）試劑
①顯色劑：1g 吲哚醌溶於100mL 乙醇及10mL 冰醋酸中（若冰醋酸用量減少則靈敏度
稍差）。
②底色褪色劑：在 100mL 200g/L 碳酸鈉溶液中加入60g 硅酸鈉（Na2SiO3•9H2O）在水
浴（60～70℃）中加熱攪拌直至完全溶解，待溶液比較清澈為止。在溶解過程中，有時硅酸
鈉會結成凝膠，此時只需繼續攪拌即可溶解。配製時若硅酸鈉用量多則褪色較快，但背景容
易變黃，硅酸鈉用得少（40g），雖裉色較慢，但背景較為潔白。
顯色步驟
層析或電泳後濾紙烘乾後，仔細噴上或塗上顯色劑，用電吹風迅速吹乾，待醋酸氣味不
太刺鼻時移置100℃烘箱烘5～15min，直至顯色為止（溫度不要太高，以免引起減色）注
意觀察所顯出的顏色，然後均勻地塗上底色褪色劑，紙的背景即由黃色變為絳紅而後逐漸變
淺，待黃色背景幾乎褪盡時，迅速用電吹風吹乾，並隨時觀察顏色的變化。例如蘇氨酸在褪
色前為淺紅帶褐色，褪色後則呈橙黃色或黃色：脯氨酸在褪色前為藍色，吹乾時很快褪成無
色。室溫較低時，底色褪色很慢，此時可將褪色劑加溫到30～40℃。溫度過高也不宜，因
氨基酸斑點的褪色速度也同時加快，應該避免。
其他顯色步驟：顯色劑為 1g 吲哚醌，1.3g 醋酸鋅溶解於70～80mL 熱異丙醇中，冷卻
後加1mL 吡啶。或者1g 吲哚醌，1.5g 醋酸鋅溶解於95mL 熱異丙醇中，加3mL 水，冷卻
後加1mL 冰醋酸。點有樣品的濾紙仔細噴以顯色劑後，80～85℃放置10min，背景可用水
迅速浸洗去而不使氨基酸斑點退去
由於吲哚醌試劑配製方法不同，對同一種氨基酸所顯顏色往往也有差異。
3．鄰苯二甲醛法
鄰苯二甲醛法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色氨基酸最靈敏的方法之一，也可
用於氨基酸溶液定量，並推廣應用於乙內醯苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白質的檢出和定量。根
據文獻報道，氨基酸紙上層析靈敏度達0.5μmoL，在硅膠薄層層析上為0.05～0.2μmoL。
這里介紹在紙上層析顯現氨基酸方法。（熒光胺是另一種常用的熒光試劑，由於熒光胺來源
比較困難，這里未作介紹）
（1）原理
鄰苯二甲醛在 2-巰基乙醇存在下，在鹼性溶液中與氨基酸作用產生熒光化合物，最適
的激發光和發射光波長分別為340nm 和455nm。
各種氨基酸顯現的熒光強度不同，其相對熒光強度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，
異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨
酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。
（2）試劑
鄰苯二甲醛顯色液：取0.1g 鄰苯二甲醛，0.1mg 巰基乙醇，1mL 三乙胺，加丙酮+石油
醚（60℃～90℃）（1+1）的混合溶劑至100mL。放置0.5h 後使用。
顯色步驟
將含有氨基酸樣品的濾紙浸入鄰苯二甲醛顯色液中 1min，冷風吹乾，在溫度18℃以下，
濕度50%～90%之間顯色0.5h，於紫外燈下觀察熒光點。
說明
在濾紙上顯現氨基酸時，鄰苯二甲醛濃度以 0.1%為宜。顯色時必須有一定的濕度，以
便氨基酸溶解，提高分子碰撞機率，並使極性基團解離，促進反應趨於完全。濕度太低，顯
不出熒光。溫度對顯現的熒光延時有顯著影響，溫度高熒光延時短，溫度低熒光延時長。
二、個別氨基酸的顯色反應
利用個別氨基酸與某些試劑具有特殊的顯色反應定性氨基酸。可應用於紙層析和紙電
泳顯色，也可單獨應用。方法很多，僅將常用的方法介紹如下：
1．精氨酸的顯色——坂口（Sakaguchi）反應
(1)第一種方法
試劑：①5g 尿素溶解於100mL0.1g/Lα-萘酚乙醇中。使用前，每100mL 加約5g KOH。
②0.7mL 溴水溶解於100mL 5%NaOH 中。
顯色步驟：在點有樣品的濾紙上噴試劑①後，在空氣中吹幾分種，再噴試劑②。精氨
酸或含精氨酸的多肽顯紅色。此試劑對含精氨酸的蛋白質也適用。
(2)第二種方法：
試劑：①1g/L 8-羥基喹啉的丙酮溶液。②0.02mL 溴水溶解於100mL 0.5mol/LnaOH 溶
液中。
顯色步驟：將點有樣品的濾紙烘乾後，噴上試劑①，吹乾後，再噴試劑②。精氨酸或
其他胍類物質顯桔紅色。
2．胱氨酸和半胱氨酸的顯色
試劑：①1.5g 亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5NO2•5H2O）溶於5mL 2mol/L H2SO 4 溶液
中，加95mL 甲醇。此時會有沉澱產生，可保存一個月以上。使用時在每100mL 上述溶液
中加10mL 28%氨水，過濾除去沉澱，清液僅能保持一天左右。②2g 氰化鈉溶於5mL 水中，
然後加95mL 甲醇。此時有沉澱產生，使用時只需搖勻即可。
顯色步驟：半胱氨酸的顯色：在濾紙上噴以試劑①的清液，5min 後半胱氨酸顯紅色。
胱氨酸的顯色：先將濾紙浸入試劑②，迅速取出，稍等片刻再噴試劑甲的清液，5min 後胱
氨酸顯紅色。也可以把試劑②配製的濃度增加一倍，在顯色前混和，再噴到濾紙上。
3．甘氨酸的顯色
試劑；0.1g 鄰苯二甲醛溶於100mL 77%乙醇中。
顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上試劑，甘氨酸顯墨綠色，在汞燈（365nm）下顯巧克力
棕色。吲哚醌顯色後，再用此試劑仍有效。以甘氨酸為N 端的小肽也能顯色，但其N 端被
保護後，以及其他氨基酸均不顯色。
4．脯氨酸的顯色
試劑：1g 吲哚醌和1.5g 醋酸鋅，1mL 醋酸，5mL 蒸餾水混和，再加入95mL 異丙醇。
新鮮配製。
顯色步驟：層析濾紙除盡溶劑，噴上以上試劑，80℃～85℃烘箱內放置30min，脯氨酸
顯藍色，再以30℃溫水漂洗除去多餘的試劑後，背景為白色或淺黃色。
也可剪下脯氨酸斑點，在試管中加入5mL 水飽和酚，在黑暗中洗脫15min，間歇振搖，
於610nm 測定其吸光度。從已知標准曲線即可求得樣品內脯氨酸含量，測定范圍5～20μg。
5．絲氨酸和羥賴氨酸的顯色
試劑：①0.035mol/L 過碘酸鈉（748mgNaIO4 溶於數毫升甲醇中，加2 滴6mol/L 鹽酸，
再用甲醇稀釋至100mL）。②15g 醋酸銨加0.3mL 冰醋酸，加1mL 乙醯丙酮，用甲醇稀釋到
100mL。
顯色步驟：點有樣品的濾紙吹乾，先噴試劑①，近干後再噴試劑②，室溫放置 2h，紫
外燈下照射0.5h，絲氨酸和羥賴氨酸呈黃色斑點，在紫外線下都有熒光。
6．羥脯氨酸的顯色
試劑：①1g 吲哚醌溶於100mL 乙醇及10mL 冰醋酸。②1g 對二甲胺苯甲醛溶於100mL
的丙酮濃鹽酸（9＋1）混合液中。（此試劑不穩定，隔數日後溶液顏色增深發黑，靈敏度降
低，故用時新鮮少量配製。
顯色步驟：將待鑒定的溶液點於小方塊紙上，干後先點上試劑①，熱風吹乾。這時純
羥脯氨酸呈墨綠色，純脯氨酸呈深藍色（極靈敏），對其他氨基酸呈程度不同的紫紅色（不
太靈敏）；然後再點上試劑②吹乾，如溶液中含有羥脯氨酸即轉變為玫瑰紅色，而其他氨基
酸與吲哚醌所生成的顏色則褪去。
7．色氨酸的顯色
(1)第一種方法
試劑：1g 對二甲氨基苯甲醛加90mL 丙酮，10mL 濃鹽酸。新鮮配製。
顯色步驟：點有樣品的濾紙乾燥後，噴上以上試劑，在室溫下放置幾分鍾後，色氨酸
顯藍色或紫紅色。茚三酮顯色後，仍可使用本法。
(2)第二種方法：
試劑：10mL 35%甲醛加10mL25%鹽酸，20mL 無水乙醇。
顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上以上試劑後，100℃烘5min，色氨酸在長波長紫外光下
呈現熒光（黃-橙-帶綠色）。
8．酪氨酸的顯色
試劑：①0.1%α-亞硝基β-萘酚的95%乙醇溶液。②10%硝酸水溶液。
顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上試劑①後，吹乾，再噴試劑②，然後在100℃烘3min，
酪氨酸或含酪氨酸的多肽在淺灰綠色的背景上顯紅色，0.5h 後轉變為桔紅色，其後漸退去。
靈敏度1～2μg 酪氨酸。茚三酮顯色後，再用此試劑處理，仍能顯色，茚三酮所顯出的紫紅
色斑點變成紅色。
9．酪氨酸和組氨酸的顯色——pauly 反應
試劑：①4.5g 對氨基苯磺酸與45mL 12mol/L 鹽酸共熱溶解，以蒸餾水稀釋至500mL。
用時取出30mL，在0℃與等體積的5%亞硝酸鈉水溶液相混合。（室溫放置太長會失效）
②10%碳酸鈉水溶液。
顯色步驟：點有樣品的濾紙上噴試劑①，片刻後再噴試劑②。組氨酸及含組氨酸的多
肽顯桔紅色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽顯淺紅色。
第六節 氨基酸定量測定
一、氨基酸的一般定量測定
（一）甲醛滴定法
1．原理
氨基酸具有酸性的-COOH 基和鹼性的-NH2 基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內
鹽。當加入甲醛溶液時，-NH2 基與甲醛結合，從而使其鹼性消失。這樣就可以用標准強鹼
溶液來滴定-COOH 基，並用間接的方法測定氨基酸總量。反應式（有三種不同的推論）如
下：
2．方法特點及應用
此法簡單易行、快速方便，與亞硝酸氮氣容量法分析結果相近。在發酵工業中常用此
法測定發酵液中氨基氮含量的變化，來了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，並以此
作為控制發酵生產的指標之一。脯氨酸與甲醛作用時產生不穩定的化合物，使結果偏低；酪
氨酸含有酚羧基，滴定時也會消耗一些鹼而致使結果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反
應，往往使結果偏高。
3．操作方法
吸取含氨基酸約 20mg 的樣品溶液於100mL 容量瓶中，加水至標線，混勻後吸取20.0mL
置於200mL 燒杯中，加水60mL，開動磁力攪拌器，用0.05mol/L 氫氧化鈉標准溶液滴定至
酸度計指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標准溶液mL 數，供計算總酸含量。
加入10.0mL 甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標准溶液繼續滴定至pH9.2，記錄消
耗氫氧化鈉標准溶液毫升數。
同時取 80mL 蒸餾水置於另一200mL 潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標准溶液調至pH8．2，
（此時不計鹼消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氫氧化鈉標准溶液滴定
至pH9.2，作為試劑空白試驗。
4．結果計算
氨基酸態氮質量分數（%）=
式中：V1——樣品稀釋液在加入甲醛後滴定至終點（pH9.2）所消耗氫氧化鈉標准溶液
的體積，mL；
V2——空白試驗加入甲醛後滴定至終點所消耗的氫氧化鈉標准溶液的體積，mL；
c——氫氧化鈉標准溶液的濃度，mol/L；
m——測定用樣品溶液相當於樣品的質量，g；
0.014——氮的毫摩爾質量，g/mmoL。
5．說明
①本法准確快速，可用於各類樣品游離氨基酸含量測定。②渾濁和色深樣液可不經處
理而直接測定。
(二)茚三酮比色法
1．原理
氨基酸在鹼性溶液中能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應），
可用吸光光度法測定。
該藍紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為 570nm，故據此
可以測定樣品中氨基酸含量。
2．操作方法
(1)標准曲線繪制
准確吸取 200μg /mL 的氨基酸標准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相當於
0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分別置於25mL 容量瓶或比色管中，各加
水補充至容積為4.0mL，然後加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸鹽緩沖溶液（pH 為8.04）各
1mL，混合均勻，於水浴上加熱15min，取出迅速冷至室溫，加水至標線，搖勻。靜置15min
後，在570nm 波長下，以試劑空白為參比液測定其餘各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克
數為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，繪制標准曲線。
(2)樣品測定
吸取澄清的樣品溶液 1～4mL，按標准曲線製作步驟，在相同條件下測定吸光度A 值，
用測得的A 值在標准曲線上可查得對應的氨基酸微克數。
3．結果計算
氨基酸含量（mg/100g）=
式中：c——從標准曲線上查得的氨基酸的質量數，μg；
m——測定的樣品溶液相當於樣品的質量，g。
4．說明及注意事項
①通常採用的樣品處理方法為：准確稱取粉碎樣品 5～10g 或吸取樣液樣品5～10mL，
置於燒杯中，加入50mL 蒸餾水和5g 左右活性炭，加熱煮沸，過濾，用30～40mL 熱水洗
滌活性炭，收集濾液於100mL 容量瓶中，加水至標線，搖勻備測。
②茚三酮受陽光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前須進行
純化，具體操作可參閱黃偉坤等編著《食品檢驗與分析》。
(三)非水溶液滴定法
1．原理
氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的標准溶液滴定其含量。根據酸
鹼的質子學說：一切能給出質子的物質為酸，能接受質子的物質為鹼；弱鹼在酸性溶劑中鹼
性顯得更強，而弱酸在鹼性溶劑中酸性顯得更強，因此本來在水溶液中不能滴定的弱鹼或弱
酸，如果選擇適當的溶劑使其強度增加，則可以順利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中
呈現中性，而在冰醋酸中就能接受質子顯示出鹼性，因此可以用高氯酸等強酸進行滴定。
本法適合於氨基酸成品的含量測定。允許測定的范圍是幾十毫克的氨基酸
2．測定
(1)直接法（適用於能溶解於冰醋酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品50mg 左右，溶解
於20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示劑，用0.100mol/L 高氯酸標准液滴定（用10mL 體積
的微量滴定管），終點為紫色剛消失，呈現藍色。空白管為不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至
同樣終點顏色。
(2)回滴法（適用於不易溶解於冰醋酸而能溶解於高氯酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣
品30～40mg 左右，溶解於5mL0.1mol/L 高氯酸標准溶液中，加2 滴甲基紫指示劑，剩餘的
酸以醋酸鈉溶液滴定，顏色變化由黃，經過綠、藍至初次出現不褪的紫色為終點。
3．說明
(1)能溶解於冰醋酸的氨基酸，可以用直接法測定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、組
氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸。不易溶解於冰
醋酸，但能溶解於高氯酸可以回滴法測定的有：賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。
(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以將樣品溶解於2mL 甲酸中，再
加20mL 冰醋酸，直接用標準的高氯酸溶液滴定。
(四)鄰苯二甲醛法(OPT 法)
1．原理
鄰苯二甲醛在 2-巰基乙醇存在下，於鹼性溶液中與氨基酸作用產生熒光化合物，最適
的激發光和發射光波長分別為340 和455nm。可能產物為：
各種氨基酸顯現的熒光強度不同，其相對熒光強度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，
異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨
酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸，和半胱氨酸。
本法可用於測定游離氨基酸的含量。靈敏度較茚三酮法約高 100 倍以上，可測到0.1～
1×10－4mol 氨基酸。如用於血清中α-氨基氮的測定，每次血清用量只需5～10μL。與另一
種熒光試劑（螢光胺）一樣，空白無熒光，只有與氨基酸結合才產生熒光。缺點是與脯氨酸
不產生熒光，鄰苯二甲醛與半胱氨酸熒光值太低。熒光胺已有用於氨基酸自動分析定量分析，
但由於試劑昂貴及個別氨基酸反應不滿意，目前還未普遍應用。
(五)三硝基苯磺酸法
三硝基苯磺酸（TNBS）是定量測定氨基酸的重要試劑之一。TNBS 在偏鹼性的條件下
與氨基酸反應，先形成中間絡合物，如下式所示：
中間絡合物在光譜上有二個吸收值相近的高峰，分別位於355nm 和420nm 附近。然
而溶液一旦酸化，中間絡合物轉化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 處的吸收值
顯著下降，而350nm 附近的吸收峰則移至340nm 處。
利用 TNBS 與氨基酸反應的這一特性，可在420nm 處（偏鹼性溶液中）或在340nm
（偏酸性溶液中）對氨基酸進行定量測定。下表列出各種氨基酸與TNBS 反應後在不同條
件下測定的吸光度。在340nm 處，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 處的吸光度
因氨基酸種類而異；在加入適量SO3
2－時，吸收值升高。
本法允許的測定范圍是 0.05～0.4μmol 氨基酸。
表 10-3 各種氨基酸與TNBS 反應後在不同條件下測定的吸光度
氨基酸種類 鹼性溶液① 酸性溶液加 SO3
①取不同含量氨基酸液1mL，加4%NaHCO3 1mL，0.1%TNBS 1mL，於40℃反應2h，用水補充至4mL，
在420nm 處測定。製作氨基酸濃度—吸光度坐標圖，從曲線中求得各氨基酸於1μmol 時的吸光度。
②條件同上，但在與TNBS 反應時加0.01mol/L Na2SO3 1mL，最後總體積也是4mL，同樣在420nm 處
測定。
③條件同①，但與 TNBS 反應後加1mol/L HCl 1mL 酸化，在340nm 處測定。
(六)乙醯丙酮和甲醛熒光法
1．原理
氨基酸與乙醯丙酮和甲醛反應，生成 N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙醯基1,4-二氫吡啶，
產生黃-綠色熒光，可用熒光分析法檢測。主要反應如下：
乙醯丙酮 甲醛 氨基酸 熒光物質
2．試劑
混合試劑：取1mol/L 乙酸鈉溶液10mL，加入乙醯丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，
用水稀釋至30mL。
3．測定
取氨基酸液 1mL，加入混合試劑1mL，用棉花塞滿試管口，避光於100℃下加熱10min，
冷卻，加水2mL，然後測定熒光值。
表 10-4 各種氨基酸的發射波長和檢測范圍
化合物（激發波長405nm） 發射波長（nm） 檢測范圍（mg/L）
甘氨酸 485 2～10
苯丙氨酸 490 8～40
絲氨酸 485 5～25
半胱氨酸（鹽酸鹽） 500 20～100
谷氨酸 485 20～100
與標准相比較求出樣品中的氨基酸含量。
二、個別氨基酸的定量測定
（一）賴氨酸的測定
1．原理
用銅離子阻礙游離氨基酸的α-氨基,使賴氨酸的ε-氨基可以自由地與1-氟-2,4 二硝基
苯(FDNB)反應,生成ε-DNP-賴氨酸。經酸化和用二乙基醚提取,在波長390nm 處有吸收峰,
從而求出樣品中游離賴氨酸的含量.
2．試劑
(1)氯化銅液：稱28.0g 無水氯化銅，用水稀釋至1000mL。
(2)磷酸三鈉溶液：稱68.5g 無水磷酸鈉,用水稀釋至1000mL。
(3)硼酸鹽緩沖液（pH9.1～9.2）：稱54.64g 帶有10 結晶水的四硼酸鈉，用水稀釋至
1000mL 。
(4)磷酸銅懸浮液：攪拌情況下，把氯化銅液200mL，緩慢倒入400 mL 的磷酸三鈉溶液
中，把懸浮液以2000r/min 速度離心5min ，用硼酸鹽緩沖液再懸浮沉澱物，洗滌離心3 次，
把最後的沉澱物懸浮在硼酸鹽緩沖液中，並用緩沖液稀釋至1L。
(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀釋至100mL。
(6)賴氨酸-HCl 標准溶液：稱取一定量賴氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作標准液。
(7)100g/L 丙氨酸溶液。
3．測定
(1)稱取通過40 目篩的均勻試樣1.00g，置於100mL 燒瓶中。另吸取賴氨酸-HCl 標准工
作液5mL（相當1mg 賴氨酸-HCl），連同試劑空白同時進行試驗。
(2)向各燒瓶中加入25mL 磷酸銅懸浮液，然後再加10%丙氨酸1.0mL,振搖15min。吸
取10%FDNB 溶液0.5mL.置於各處理燒瓶中,將燒瓶置沸水中加熱15min。
(3)取出燒瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,並不斷搖動使之酸化和分散均勻。
(4)燒瓶中的溶液冷卻至室溫,用水稀釋至100mL.取約40mL 懸浮液進行離心。
(5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。並將溶液收集於有刻度試管中,於65℃
水浴中加熱15min，以除去殘留的醚。並記錄溶液的毫升數。
(6)吸取上述各處理液10mL，分別與95%乙醇溶液10mL 混合，用濾紙過濾。
(7)用試劑空白液凋零，測定樣液A390nm，與賴氨酸-HCl 標准液對照，求出樣品中賴氨
酸-HCl 的含量。
本法在 0～40mg/L 賴氨酸溶液范圍內呈良好線性關系。
4．說明
(1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加總氨基酸的濃度，有助於賴氨酸-HCl 濃度
具有良好的線性關系。
(2)用醚提取酸性溶液，可將所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，並把FDWB
的產物破壞，否則這些產物在390nm 處存在干擾。
（二）色氨酸的測定
1.原理
樣品中的蛋白質經鹼水解後，游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用，生
成哈爾滿化合物（norharman），具有特徵熒光值，可以進行定量測定。
2．試劑
(1)0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸溶液：稱取三氯化鐵(FeCl3•6H2O)41mg，加入10%三
氯乙酸溶液溶解並定溶至500mL。
(2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～38%)5.5mL，加水至100mL。
(3)色氨酸標准溶液：稱取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解並定容至100mL,
置棕色瓶中備用,使用時用水稀釋成1mg/L 的標准溶液.
3．測定
稱取樣品粉末 100～200mg 於離心管中，加入4mL 乙醚,搖勻後過夜，以3000r/min 速
度離心。將乙醚提取液移入試管內,並用乙醚洗滌殘渣3 次，收集乙醚液於試管中，於40℃
水浴除去醚。殘留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，於110℃水解16～24h。水
解液用4mol/L HCl 溶液調節至pH6～8 後,用水定容至50mL,過濾備用。
吸取濾液 0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸混合液2mL，
搖勻後於100℃水浴中加熱1h，取出，冷卻後用水定容至10mL。在激發波長為365nm，發
射波長449nm 條件下，測定樣品的熒光強度，與色氨酸標樣作對照，求出樣品中色氨酸含
量。
本法在 0～10mg/L 色氨酸溶液范圍內呈良好線性關系。
Ⅱ 植物體細胞培養基操作
樓主好！！ 實驗八 培養基的制備與滅菌 一、目的要求1. 掌握微生物實驗室常用玻璃器皿的清洗及包紮方法。2. 掌握培養基的配置方法。3. 掌握乾熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、基本原理 正確掌握培養基的配製方法是從事微生物學實驗工作的重要基礎。由於微生物種類及代謝類型的多樣性．因而用於培養微生物的培養基的種類也很多，它們的配方及配製方法雖各有差異。但一般培養基的配製程序卻大致相同．例如器皿的准備，培養基的配製與分裝，棉塞的製作，培養基的滅菌，斜面與平板的製作以及培養基的無菌檢查等基本環節大致相同。三、實驗材料1. 葯品：待配各種培養基的組成成分、瓊脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。2. 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三角瓶、培養皿、玻璃漏斗等。3. 其他物品：葯匙、稱量紙、pH試紙、記號筆、棉花等。四、操作步驟（一）玻璃器皿的洗滌和包裝1．玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然後用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置於烘箱中烘乾後備用。2．滅菌前玻璃器皿的包裝（1） 培養皿的包紮：培養皿由一蓋一底組成一套，可用報紙將幾套培養皿包成一包，或者將幾套培養皿直接置於特製的鐵皮圓筒內，加蓋滅菌。包裝後的培養皿須經滅菌之後才能使用。（2）
圖8-1 移液管的包紮移液管的包紮：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作用是避免外界及口中雜菌進入管內，並防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應距管口約0.5cm左右，棉花自身長度約1~1.5cm。塞棉花時．可用一外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內。棉花要塞得松緊適宜，吹時以能通氣而又不使棉花滑下為准。先將報紙裁成寬約5cm左右的長紙條，然後將已塞好棉花的移液管尖端放在長條報紙的一端，約成45℃角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊．在桌面上向前搓轉，以螺旋式包紮起來。上端剩餘紙條，折疊打結，准備滅菌。（二）液體及固體培養基的配製過程1．液體培養基配製1) 稱量：一般可用0.01g天平稱量配製培養基所需的各種葯品，先按培養基配方計算出各成分的用量．然後進行准確稱量。2) 溶解：將稱好的葯品置於一燒杯中，先加入少量水(根據實驗需要可用自來水或蒸餾水)，用玻璃棒攪動，加熱溶解。3) 定容：待全部葯品溶解後，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種葯品用量太少時，可預先配成較濃溶液，然後按比例吸取一定體積溶液，加入至培養基中。4) 調pH：一般用pH試紙測定培養基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然後用鑷子夾取此段pH試紙，在培養基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養基偏酸或偏鹼時，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液進行調節。調節pH時，應逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過鹼，破壞培養基中成分。邊加邊攪拌，並不時用pH試紙測試，直至達到所需pH為止。5) 過濾：用濾紙或多層紗布過濾培養基。一般無特殊要求時，此步可省去。2．固體培養基的配製 配製固體培養基時，應將已配好的液體培養基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.5~2％)加入，並用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續加熱至瓊脂全部融化，最後補足因蒸發而失去水分。（三）培養基的分裝 根據不同需要，可將已配好培養基分裝入試管或三角瓶內，分裝時注意不要使培養基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養基沾污管口或瓶口時，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養基，並將脫脂棉棄去。1．試管的分裝取一個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，並將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾佐玻璃管嘴，使培養基直接流入試管內。裝入試管培養基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150 mm時，液體培養基可分裝至試管高度1／4左有為宜；如分裝固體或半固體培養基時，在瓊脂完全融化後，應趁熱分裝於試管中。用於製作斜面的固體培養基的分裝量為管高1／5(約3—4mI)，半固體培養基分裝量為管高的1／3為宜。2．三角瓶的分裝圖8-2培養基的分裝 用於振盪培養微生物時，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液體培養基；若用於製作平板培養基用時，可在250 m1三角瓶中加入150ml培養基，然後再加入3g瓊脂粉(按2％計算)，滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化。（四）棉塞的製作及試管、三角瓶的包紮 為了培養好氣性微生物，需提供優良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或三角瓶內空氣預先進行過濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。1．試管棉塞的製作制棉塞時，應選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展於左手拇指和食指扣成的團孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團孔中製成棉塞．然後直接壓入試管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法製作棉塞。製作的棉塞應緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好後以手提棉塞，試管不下落為准。棉塞的2／3在試管內，1／3在試管外。目前也有採用硅膠塞代替棉塞直接蓋在試管口上。將裝好培養基並塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外麵包上一層牛皮紙。用記號筆註明培養基名稱及配製日期，滅菌待用。
圖8-3 棉塞的製作
圖8-4 正確與不正確的棉塞1.金屬塞 2正確 3、4不正確 2．三角瓶棉塞製作通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時為了進行液體振盪培養加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上，目前也有採用硅膠塞直接蓋在瓶口上。在裝好培養基並塞好棉塞或包紮八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上一層牛皮紙並用線繩捆好，滅菌待用。（五）培養基的滅菌培養基經分裝包紮後，應立即按配製方法規定的滅菌條件進行進行高壓蒸汽滅菌。（六）斜面和平板的製作1．斜面的製作將已滅菌裝有瓊脂培養基的試管，趁熱置於木棒或玻棒上，使成適當斜度，凝固後即成斜面。斜面長度不超過試管長度l／2為宜。如製作半團體或固體深層培養基時，滅菌後則應垂直放置至凝固。2．平板的製作將裝在三角瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養基融化後，待冷至50℃左右傾入無菌培養皿中。溫度過高時，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低於50℃，培養基易於凝固而無法製作平板。平板的製作應在火旁進行，左手拿培養皿，右手拿三角瓶的底部或試管，左手同時用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入10~15mL培養基，迅速蓋好皿蓋，置於桌上，輕輕旋轉平皿，使培養基均勻分布於整個平皿中，冷凝後即成平板。（七）培養基的滅菌檢查滅菌後的培養基，一般需進行無菌檢查。最好取出1~2管(瓶)，置於37℃溫箱中培養1~2天，確定無菌後方可使用。（八）無菌水的制備在每個250mL的三角瓶內裝100mL的蒸餾水並塞上棉塞或硅膠塞。在每支試管內裝4.5mL蒸餾水，塞上棉塞或硅膠塞。再在棉塞上包上一張牛皮紙，高壓蒸汽滅菌。0.1MPa滅菌20~30min。五、實驗內容1. 根據要求清洗各種玻璃器皿，並進行包紮。2. 根據要求配製各種培養基。3. 用電熱鼓風乾燥箱對玻璃器皿進行乾熱滅菌。4. 用高壓蒸汽滅菌鍋對所配各培養基滅菌。六、實驗報告1. 簡述移液管和培養皿的包紮注意事項。2. 簡述配製培養基的基本步驟及注意事項。3. 為什麼微生物實驗室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞入一小段棉花，再用報紙包起來，經高壓蒸汽滅菌後才能使用?4. 為什麼微生物實驗室所用的三角瓶口或試管口都要塞上棉塞（硅膠塞）才能使用？5. 配製培養基時為什麼要調節pH？6. 高壓蒸汽滅菌為什麼比乾熱滅菌要求溫度低、時間短？ 附錄 滅菌技術一、目的要求了解消毒和滅菌的原理，並掌握各種滅菌方法的操作步驟。二、實驗材料1. 儀器或其他用具：上述包紮的培養皿、試管、移液管等，電熱鼓風乾燥箱，高壓蒸汽滅菌鍋，微孔濾膜過濾器，0.22μm濾膜，注射器，鑷子，玻璃塗棒。2. 培養基：上述配製的培養基及生理鹽水三、基本原理在微生物實驗中，需要進行純培養，不能有任何雜菌污染，因此必須對所用器材、培養基和工作場所進行滅菌和消毒。滅菌是指殺死一定環境中的所有微生物，包括微生物的營養體、芽孢和孢子。實驗室常用的滅菌方法包括直接灼燒、恆溫乾燥箱滅菌、高壓蒸汽滅菌、間歇滅菌、煮沸滅菌等方法。這些方法的基本原理是通過加熱使微生物體內蛋白質凝固變性，從而達到滅菌的目的。四、操作步驟（一）乾熱滅菌法乾熱滅菌是在電熱乾燥箱內利用高溫乾燥空氣（160℃~170℃）進行滅菌，它是利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固變性而達到滅菌目的。此法適用於玻璃器皿如移液管、試管和培養皿的滅菌。培養基、橡膠製品、塑料製品不能採用乾熱滅菌。細胞內的蛋白質凝固性與其本身的含水量有關，在菌體受熱時，當環境和細胞內含水量越大，則蛋白質凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，乾熱滅菌所需溫度高（160℃~170℃），時間長（1~2h）。但乾熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。乾熱滅菌使用的是電熱乾燥箱（乾燥箱）。具體操作步驟如下：1. 裝入待滅菌物品：將包好的待滅菌物品放入電熱乾燥箱內，關好箱門。堆積時要留有空隙，物品不要擺放得太擠，以免妨礙空氣流通，滅菌物品不要接觸電熱乾燥箱內壁的鐵板、溫度探頭，以防包裝紙烤焦起火。2. 升溫：接通電源，打開開關，適當打開電熱乾燥箱頂部的排氣孔，旋動恆溫調節器，使溫度逐步上升。當溫度升至100℃時，關閉排氣孔。在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示電熱乾燥箱內停止加溫，此時如果還未達到所需的160℃~170℃，則需要轉動溫度調節器使紅燈亮，如此反復調節，直至達到所需的溫度。3. 恆溫：當溫度升到160℃~170℃時，藉助恆溫調節器的自動控制，保持此溫度2h。乾熱滅菌過程中，嚴防恆溫調節的自動控制失靈而造成安全事故。4. 降溫：切斷電源，自然降溫。5. 開箱取物：待電熱乾燥箱內溫度降到60℃以下後，才能打開箱門，取出滅菌物品。同時，應將溫度調節旋鈕調到零點，並打開排氣孔。電熱乾燥箱內溫度未降到60℃以前，切勿自行打開箱門，以免驟然降溫導致玻璃器皿炸裂。（二）高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內，在一定的壓力下保持15~30分鍾進行滅菌。此法適用於培養基、無菌水、工作服等物品的滅菌，也可用於玻璃器皿的滅菌。將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋夾套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中排盡，然後關閉排氣閥，繼續加熱，此時由於蒸汽不能溢出，而增加了滅菌鍋內的壓力，從而使沸點增高，獲得高於100℃的溫度，導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。在相同的溫度下，濕熱滅菌的效果好於乾熱滅菌。有三點原因：在濕熱滅菌中菌體吸收水分，蛋白質容易凝固變性，蛋白質隨著含水量的增加，所需凝固溫度降低；濕熱滅菌中蒸汽的穿透力比乾燥空氣大；蒸汽在被滅菌物體表面凝結，釋放出大量的汽化潛熱，能迅速提高滅菌物體表面的溫度，從而增加滅菌效力。實驗室常用的滅菌鍋有非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋和自控式滅菌鍋，其結構和工作原理是相同的。本實驗介紹的是非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋，自控式滅菌鍋的使用可參考廠家說明書。具體操作步驟如下：1. 加水：首先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面沒過加熱蛇管，與三角擱架相平為宜。切勿忘記檢查水位，加水量過少，滅菌鍋會發生燒干引起炸裂事故。2. 裝料：放回內層鍋，並裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果。裝有培養基的容器放置時要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包紮的紙而透入棉塞。3. 加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內，擺正鍋蓋，對齊螺口，然後以對稱方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣，並打開排氣閥。4. 排氣：打開電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內的冷空氣和水蒸汽一起從排氣孔中排出。一般認為當排出的氣流很強並有噓聲時，表明鍋內的空氣已排盡，沸騰後約需5分鍾。5. 升壓：冷空氣完全排盡後，關閉排氣閥，繼續加熱，鍋內壓力開始上升。6. 保壓：當壓力表指針達到所需壓力時，控制電源，開始計時並維持壓力至所需的時間。如本實驗中採用0.1Mpa，121.5℃，20分鍾滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內的冷空氣必須完全排盡後，才能關閉排氣閥，維持所需壓力。7. 降壓：達到滅菌所需的時間後，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當壓力表的壓力降至「0」後，方可打開排氣閥，排盡餘下的蒸汽，旋松螺栓，打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內剩水。壓力一定要降到「0」後，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基或試劑由於內外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。8. 無菌檢查：將已滅菌的培養基放入37℃恆溫培養箱培養24h，檢查無雜菌生長後，即可使用。 （三）過濾除菌有些物質，如抗生素、血清、維生素、糖溶液等採用加熱滅菌法時，容易受熱分解而被破壞，因而要採用過濾除菌法。過濾除菌是通過機械作用濾去液體或氣體中細菌的方法，該方法最大的優點是不破壞溶液中各種物質的化學成分。過濾除菌法除實驗室用於溶液、試劑的除菌外，在微生物工作中使用的凈化工作台也是根據過濾除菌的原理設計的，可根據不同的需要來選用不同的濾器和濾板材料。應用最廣泛的過濾器種類有：1. 微孔濾膜過濾器：是一種新型過濾器，它由上下二個分別具有出口和入口連接裝置的塑料盒組成，出口處可連接針頭，入口處可連接針筒，使用時將濾膜裝入兩塑料盒之間，旋緊盒蓋，當溶液從針筒注入濾器時，各種微生物被阻留在微孔濾膜上面，而液體和小分子物質通過濾膜，從而達到除菌的目的。其濾膜是由硝酸纖維素、醋酸纖維素等製成的薄膜，有孔徑大小不同的多種規格（如0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm等），實驗室中用於除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22μm。根據待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。該濾器的優點是吸附性小，即溶液中的物質損耗少，過濾速度快，每張濾膜只使用1次，不用清洗。2. 蔡氏（Seitz）過濾器：是一種金屬製成的過濾漏斗，其過濾部分是一種用石棉纖維和其他填充物壓製成的片狀結構。溶液中的細菌通過石棉纖維的吸附和過濾而被去除，但對溶液中其他物質的吸附性也大，每張纖維板只能使用1次。3. 玻璃過濾器：是一種玻璃製成的過濾漏斗，其過濾部分是由細玻璃粉燒結成的板狀構造。玻璃濾器的規格很多，5號（孔徑2~5μm）和6號（孔徑<2μm）適用於過濾細菌，其優點是吸附量少，但每次使用後要洗凈再用。本實驗採用微孔濾膜過濾器進行過濾除菌，具體操作步驟如下：1. 組裝、滅菌：將0.22�0�8m孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊壓平，包裝滅菌後待用（0.1Mpa，121.5℃，滅菌20分鍾）。2. 連接：將滅菌濾器的入口在無菌條件下，以無菌操作方式連接於裝有待濾溶液的注射器上，將針頭與出口處連接並插入帶橡皮塞的無菌試管中。3. 壓濾：將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠入過濾到無菌試管中，濾畢，將針頭拔出。壓濾時用力要適當，不可太猛太快，以免細菌被擠壓通過濾膜。4. 無菌檢查：無菌操作吸取除菌濾液0.1mL於肉湯蛋白腖平板上，均勻塗布，置37℃恆溫培養箱培養24小時，檢查是否有雜菌生長。5. 清洗：棄去塑料濾器上的微孔濾膜，將塑料濾器清洗干凈，並換上一張新的微孔濾膜，組裝包紮，再經滅菌後使用。整個過程應嚴格按照無菌操作，以防污染，過濾時應避免各連接處出現滲透現象。 來自網路，本人整理，沒法上圖！