陰離子交換柱防止核酸

⑴ 蛋白質、核酸等生物大分子為何能用離子交換色譜分離

因為他們來都帶電荷啊，因為源你柱子上有相反的離子啊，他們可以通過離子鍵相互作用啊！
同時的柱子有孔徑啊，可以將小的直接溜走，沒有機會結合啊
可以讓大的下來的更慢啊！

你滿意不！

⑵ 在本實驗中使用了有機溶劑純化多糖，有其他替代的試劑或方法嗎

多糖（polysacharides，PS），又稱多聚糖，是由個以上的單糖通過苷鍵連接而成的，具有廣泛生物活性的天然大分子化合物。它廣泛分布於自然界高等植物、藻類、微生物（細菌和真菌）與動物體內。20世紀60年代以來，人們逐漸發現多糖具有復雜的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作為廣譜免疫促進劑，具有免疫調節功能，能治療風濕病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系統疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明顯的抗病毒和抗腫瘤作用[10]，黑木耳多糖、銀杏外種皮多糖和蘆薈多糖可抗腫瘤和增強人體免疫功能[3-5]。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促進核酸與蛋白質的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗輻射，增強免疫功能等生物學作用[6]，麥冬多糖具有降血糖及免疫增強作用[7-8]，動物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制細胞分裂和分化，調節細胞的生長與衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，銀杏外種皮粗多糖具有抗衰老、抗過敏、降血脂、止咳祛痰、減肥等功能[11]。
另外，多糖作為葯物，其毒性極小，因而多糖的研究已引起人們極大的興趣。
由於多糖具有的生物活性與其結構緊密相關，而多糖的結構又是相當復雜的，所以在這一領域的研究相對緩慢。但人們在多糖的分離提取與純化方面已做出了不少工作。
1. 多糖的提取[12]
1.1 熱水浸提法：
1.1.1多糖提取條件的優選
根據文獻報道[13]：影響熱水浸提多糖的因素主要有提取時間、提取次數、溶劑體積、浸提溫度、pH值、醇析濃度和植物顆粒大小等。在試驗前對上述多種因素利用正交實驗法做出優選，才能選出最佳提取方案。
1.1.2其步驟為：原料→粉碎→脫脂→粗提（2－3次）→吸濾或離心→沉澱→洗滌→乾燥
首先除去表面脂肪。原料經粉碎後加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加熱攪拌或迴流1－3小時，脫脂後過濾得到的殘渣一般用水作溶劑（也有用氫氧化鉀鹼性水液、氯化鈉水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氫氧化鈉作為提取溶劑）提取多糖。溫度控制在90－100℃，攪拌4－6小時，反復提取2－3次。得到的多糖提取液大多較粘稠，可進行吸濾。也可用離心法將不溶性雜質除去，將濾液或上清液混合（得到的多糖若為鹼性則需要中和）。然後濃縮，再加入2－5倍低級醇（甲醇或乙醇）沉澱多糖；也可加入費林氏溶液或硫酸銨或溴化十六烷基三甲基銨等，與多糖物質結合生成不溶性絡合物或鹽類沉澱。然後依次用乙醇、丙酮和乙醚洗滌。將洗干後疏鬆的多糖迅速轉入裝有五氧化二磷和氫氧化鈉的真空乾燥器中減壓乾燥（若沉澱的多糖為膠狀或具粘著性時，可直接冷凍乾燥）。乾燥後可得粉末狀的粗多糖。
1.2 微波輔助提取法：
其原理為利用不同極性的介質對微波能的不同吸收程度，使基體物質中的某些區域和萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使萃取物質從基體或體系中分離出來，進入到介電常數小，微波吸收能力較差的萃取劑中[14]。
由於微波能極大加速細胞壁的破裂，因而應用於中草葯中有效成分的提取能極大加快提取速度，增加提取產率。而且由於其選擇性好，提取後基體能保持良好的性狀，提取液也較一般的提取方法澄清[15]。
聶金源等在柴胡多糖和黃酮化合物的提取[18]中對微波輔助提取法、超聲輔助法和索氏提取法進行比較，發現微波輔助提取法所需時間最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。
1.3 超聲輔助法：
其原理是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超聲波的次級效應，如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學效應等也能加速欲提取成分的擴散釋放並充分與溶劑混合，利於提取[16]。
超聲波輔助法與常規提取法相比，具有提取時間短、產率高、無需加熱等優點[17]。
1.4 索氏提取法：
將植物粉末置於索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃條件下提取至無色（一般為6小時）。過濾，濾渣揮發乾燥完溶媒後加入80%乙醇，再提取6小時，過濾，濾渣乙醇揮發乾燥後加蒸餾水。迴流提取2次，趁熱過濾，濾液減壓濃縮，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃乾燥，稱重。
1.5 醇提法：
先後將90%和50%乙醇加入植物粉末中，振盪充分再抽濾。濾液中加入足量無水乙醇，至於4℃冰箱中過夜。減壓抽濾，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通風乾燥箱中乾燥，再置乾燥皿中恆重保存。
醇提法方法簡單，易於操作，但提取率較低，乙醇使用量大，不宜大規模提取使用。
1.6 其它方法：
多糖的提取方法還有稀鹼液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由於稀酸、稀鹼條件下，易使多糖發生糖苷鍵的斷裂，部分多糖發生水解而使多糖的提取率減少，因而很多試驗中避免採用稀鹼液浸提法和稀酸液浸提法。
2. 多糖的純化
2.1 多糖中雜質除去方法 粗多糖中往往混雜著蛋白質、色素、低聚糖等雜質，必須分別除去。
2.1.1 除蛋白質
採用醇沉或其它溶劑沉澱所獲得的多糖，常混有較多的蛋白質，脫去蛋白質的方法有多種：如選擇能使蛋白質沉澱而不使多糖沉澱的酚、三氯甲烷、鞣質等試劑來處理，但用酸性試劑宜短，溫度宜低，以免多糖降解。常用的方法有[19]：
2.1.1.1 沙維積法（Sevag法）[20]：根據蛋白質在氯仿等有機溶劑變性而不溶與水的特點，將多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比調為25:5:1或25:4:1，混合物劇烈振搖20到30分鍾，蛋白質與氯仿－戊醇（或正丁醇）生成凝膠物而分離，然後離心，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質。此種方法較溫和，在避免降解上有較好效果，但效率不高，如五味子多糖的提取實驗中要重復處理達三十幾次。並且每次除去蛋白質變性膠狀物時，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖與蛋白質結合的蛋白聚糖和糖蛋白，在處理時會沉澱下來，造成多糖的損失。如能配合加入一些蛋白質水解酶，再用Sevage法效果更佳。
2.1.1.2 三氟三氯乙烷法[21]：多糖溶液與三氟三氯乙烷等體積混合，低溫下攪拌10min左右，離心得上面水層，水層繼續用上述方法處理幾次，即得無蛋白質的多糖溶液，此法效率高，但溶劑沸點較低，易揮發，不宜大量應用。
2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5％－30％三氯醋酸，直至溶液不再繼續混濁為止，在5－10℃放置過夜，離心除去沉澱即得無蛋白質的多糖溶液。此法會引起某些多糖的降解。
Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三種方法均不適合糖肽，因糖肽也會像蛋白質那樣沉澱出來。對於對鹼穩定的糖蛋白，在硼氫化鉀存在下，用稀鹼溫和處理，可以把這種結合蛋白質分開[1]。
2.1.1.4 酶解法[22]：在樣品溶液中加入蛋白質水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶等，使樣品中的蛋白質降解。通常將其與Sevag法綜合使用除蛋白質效果較好。
2.1.1.5 鹽酸法[23]：取樣品濃縮液，用2mol/L鹽酸調節其PH至3，放置過夜，在3000r/min條件下離心，棄去沉澱，即脫去蛋白質。
另有李知敏[23]和葉將瑜[25]等人分別在植物多糖實驗中證明：鹽酸法、三氯乙酸法及Sevag法脫蛋白率分別為72.5％、46.1％和42.3％，多糖的損失率分別為15.1%、6.1％和14.3％。鹽酸法脫蛋白率高，但多糖的損失率也較高;三氯乙酸法較溫和，但除蛋白效率不高；Sevag法的脫蛋白效果不及前兩種。
2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和飽和Ba（OH）2溶液，振盪後離心去蛋白。此法除蛋白不夠徹底，可結合Sevag法使用。還可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉澱完全，在4000r/min的條件下離心10min，收集上清液，即為除蛋白液。還有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白，將混合液清搖，再靜置，取上清液。此過程需重復多次方可除盡蛋白。
除去蛋白質的樣品用紫外分光光度計檢驗，觀察在280mm處是否有吸收，如果無吸收則表明蛋白質已經除盡[24]。
2.1.2 除色素
2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素[12]：活性炭屬於非極性吸附劑，有著較強的吸附能力，特別適合於水溶性物質的分離。它的來源充足，價格便宜，上柱量大，適用於大量制備性分離。目前用於色譜分離的活性炭主要分為粉末狀活性炭、顆粒狀活性炭、錦綸活性炭三種。一般情況下，盡量避免用活性炭處理，因為活性炭會吸附多糖，造成多糖的損失。
2.1.2.2對於植物來源的多糖，可能含有酚型化合物而顏色較深，這類色素大多呈負性離子，不能用活性炭吸收劑脫色，可用弱鹼性樹脂DEAE纖維素或DuoliteA－7來吸附色素。
2.1.2.3若糖和色素時結合的，易被DEAE纖維素吸附，不能被水洗脫，這類色素可進行氧化脫色：以濃氨水或NaOH液調至PH8.0左右，50℃以下滴加H2O2至淺黃色，保溫2小時。
2.1.2.4 依次用丙酮、無水乙醚和無水乙醇洗滌多糖，即可得到較為純凈的多糖。此法較為簡單，便於操作，多糖損失也較小。
2.1.2.5 用4:1的氯仿-正丁醇除色素。操作簡單，多糖有一定損失。
2.1.2.6發酵來源的多糖顏色一般較淺，色素含量較少，一般可不除色素。
2.1.2.7對於動物，微生物等提取得到的多糖也可根據不同情況按上述方法處理。
2.1.3 除低聚糖等小分子雜質
2.1.3.1採用逆向流水透析法。即准備好一桶蒸餾水，用一根導管將水通入透析袋的燒杯底部，另用一根導管將水引出，根據水量控制流速，使水緩慢流動48小時。這樣得到的就是多糖的半精品。
2.1.3.2利用溶液濃度擴散效應，將分子量小的物質如無機鹽、低聚糖等從透析袋滲透到袋外的蒸餾水中，不斷換水即可保持濃度差，從而除盡小分子雜質。具體的做法是根據多糖溶液的體積截取相應長度的透析袋，用透析夾夾住一端，灌入多糖液，離液面2－3cm處夾緊透析袋，置於一大燒杯中，注入蒸餾水至完全浸沒透析袋後，用磁力攪拌器慢速攪拌，每12小時換一次水，重復3－4次。
2.2 多糖的純化方法 純化是將多糖混合物分離為單一多糖的過程，純化的方法主要有以下幾種：
2.2.1 分部沉澱法 根據各種多糖在不同濃度的低級醇或丙酮中具有不同溶解度的性質，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉澱，經反復溶解與沉澱後，直到測得的物理常數恆定（最常用的是比旋光度測定或電泳檢查）。這種方法適合於分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩定，常在pH7進行，唯酸性多糖在pH7時－COOH是以－COO` 離子形式存在的，需在pH2－4進行分離，為了防止苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖製成各種衍生物如甲醚化物、乙醯化物等，然後將多糖衍生物溶於醇中，最後加入乙醚等極性更小的溶劑進行分級沉澱分離。
2.2.2 鹽析法 在天然產物的水提液中，加入無機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉澱析出，與其它水溶性較大的雜質分離。常做鹽析的無機鹽的有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
2.2.3 季銨鹽沉澱法 季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉澱，常用於酸性多糖的分離。通常季胺鹽及其氫氧化物並不與中性多糖產生沉澱，但當溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時，也會與中性多糖形成沉澱。常用的季銨鹽有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的濃度一般為1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉澱出來，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小於9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會被沉澱出來。
2.2.4 柱層析：包括纖維素柱層析、纖維素陰離子交換柱層析、凝膠柱層析、親和層析、高壓液相層析和其它柱層析。如用活性炭及硅膠做載體的柱層來分離多糖；或用硼砂型的離子交換樹脂分離中性多糖。
纖維素柱層析 纖維素柱層析對多糖的分離既有吸附色譜的性質，又具有分配色譜的性質，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先後順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最後出柱，與分級沉澱法正好相反。
纖維素陰離子交換柱層析 最常見的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或鹼型），洗脫劑可用不同濃度的鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適於分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝膠柱層析 凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開來，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（sephadex G）、瓊脂糖凝膠（sepharose bio－gel A）、聚丙烯醯胺凝膠（bio－gel P）等，常用的洗脫劑是各種濃度的鹽溶液及緩沖液，但它們的離子強度最好不低於0.02。出柱的順序是大分子的先出柱，小分子的後出柱。由於糖分子與凝膠間的相互作用，洗脫液的體積與蛋白質的分離有很大的差別。在多糖分離時，通常是用孔隙小的凝膠如sephadex G－25、G－50等先脫去多糖中的無機鹽及小分子化合物，然後再用孔隙大的凝膠sephadex G－200等進行分離。凝膠柱層析法不適合於粘多糖的分離。
親和層析 用凝聚素（一般是蛋白質和糖蛋白）做親和色譜來分離多糖。
高壓液相層析
2.2.5 制備性區域電泳 分子大小、形狀及所負電荷不同的多糖其在電場的作用下遷移速率是不同的，故可用電泳的方法將不同的多糖分開，電泳常用的載體是玻璃粉。具體操作是用水將玻璃粉拌成膠狀、柱狀，用電泳緩沖液（如0.05mol/L硼砂水溶液，PH9.3）平衡3天，將多糖加於柱上端，接通電源，上端為正極（多糖的電泳方向是向負極的），下端為負極，其單位厘米的電壓為1.2－2V，電流30－35MA，電泳時間為5－12小時。電泳完畢後將玻璃粉載體推出柱外，分割後分別洗脫、檢測。該方法分離效果較好，但只適合於實驗室小規模使用，且電泳柱中必須有冷卻夾層。
2.2.6 金屬絡合物法 常用的絡合劑有費林溶液、氯化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等。
2.2.7 其它方法：純化除採用上述方法外，還有超過濾法（多糖溶液通過各種已知的超過濾膜就能達到分離）、活性炭柱色譜。另據報道，國外多採用的LKB柱色譜系統，用比旋度、示差折射及紫外檢測多糖，各組分的峰位自動記錄，分離效果好且方便。
2.3 多糖純度的鑒定
2.3.1超離心法 由於微粒在離心力場中移動的速度與微粒的密度、大小和形狀有關，故當將多糖溶液進行密度梯度超離心時，如果是組分均一的多糖，則應呈現單峰。具體的做法是將多糖樣品用0.1molNaCl或0.1molTris鹽緩沖溶液配製成1％－5％的溶液，然後進行密度超離心，待轉速達到恆定後（通常是60000r/min），採用間隔照明的方法檢測其是否為單峰。
2.3.2高壓電泳法 由於中性多糖導電性差、分子量大、在電場中的移動速度慢，故常將其製成硼酸絡合物進行高壓電泳。多糖的組成不同、分子量不同，其與硼酸形成的絡合物就不同，在電場作用下的相對遷移率也會不同，故可用高壓電泳的方法測定多糖的純度。通常高壓電泳所用的支持體是玻璃纖維紙、純絲綢布、聚丙醯銨凝膠、纖維素醋酸酯薄膜等。緩沖液是PH9.3－12的0.03－0.1mol的硼砂溶液，電壓強度約為30－50V/cm，時間是30－120min。由於電泳時會產生大量的熱，所以要有冷卻系統，將溫度維持在0℃左右，否則會燒掉支持體。一般單糖、低聚糖因醛基而發生的顏色反應在多糖上不明顯，電泳後常用的顯色劑是p－茴香胺硫酸溶液（p－anisidine）和過碘酸希夫試劑等。
2.3.3凝膠柱層析 常用的凝膠是Sephadex、Sepharose、Sephacryl，展開劑為0.02－0.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶與0.02醋酸1：1的緩沖溶液，柱高和柱直徑之比大於40。
2.3.4旋光測定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其濃度為10％左右，離心得沉澱。上清液再加入乙醇使其濃度為20％－25％，離心所得二次沉澱，比較二次沉澱的比旋度。如果比旋度相同則為純品，否則為混合物。
2.3.5其它方法：官能團摩爾比恆定法，即如為純品兩次分離所得產物的官能團如－COOH、－NH2、－SO3H、－CHO等摩爾比應該恆定。類似的方法還有示查折射法、HPLC法等。此外德國常用高壓液相法來檢測多糖純度，結果可靠。
必須注意的是：純度檢查一般要求有上述兩種方法以上的結果才能肯定。

⑶ 簡述核酸分離的基本 原理

通過機械磨碎細胞或加入表面活性劑裂解細胞使內容物提取出來，再加入蛋白變性劑變性沉澱蛋白質。最後靠核酸在醇溶液中溶解度下降的特點提取純的核酸。

⑷ 用於測定蛋白大分子的離子色譜柱是陰離子還是陽離子色譜柱

高效色譜柱可以通過陰陽離子交換色譜方式進行分析和分離生物分子的。在任何一種離子交換模式下，產品既有甲基丙烯酸基體，又有硅膠基體的色譜柱。蛋白質、多肽、DNA和寡核苷酸衍生出來的RNA以及其它的核酸片斷是TSK-GE陰離子交換分析和分離的典型樣品。
我公司提供分析柱（4.6和7.5mm內徑）和半制備柱（21.5和55mm內徑）。顆粒范圍從快速質量控制和工藝檢測的2μm到工藝規模分離的20μm大型顆粒。由於陰離子交換柱是基於聚苯烯基體材料，他們最適合用於分析小分子量的糖類氨基酸類、核酸鹼基，以及小的備選葯物。

TSK-GEL 離子交換色譜柱特性及優點

TSK-GEL 陽離子交換色譜柱特點：

TSKgel BioAssist S 色譜柱具有獨特的孔結構和結合特性，對中到大分子量的蛋白質具有較高的結合容量。
BioAssist 色譜柱有內徑為4.6mm或者10mm的PEEK 材質，也有分析，半制備和制備應用的玻璃柱和不銹鋼柱。
TSKgel CM-3SW 色譜柱具有小孔徑和較大的表面積，對小到中等分子量的蛋白質的結合量近似為TSKgel CM-5PW色譜柱的兩倍。
TSKgel SP-5PW有內徑為2mm的色譜柱，可應用於LC-MS分析。

⑸ 生物分離高手進

這寫起來復雜了....... 很多地方都有這樣的實驗步驟啊，我看了一下 下面這個，還可以
酶的分離簡單，就是麻煩，時間挺長的

酶的分離純化方法簡介
生物細胞產生的酶有兩類：一類由細胞內產生後分泌到細胞外進行作用的酶，稱為細胞外酶。這類酶大都是水解酶，如酶法生產葡萄糖所用的兩種澱粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發酵過程中分泌的。這類酶一般含量較高，容易得到；另一類酶在細胞內產生後並不分泌到細胞外，而在細胞內起催化作用，稱為細胞內酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發酵生產所進行的一系列化學反應，就是在多種酶催化下在細胞內進行的，在類酶在細胞內往往與細胞結構結合，有一定的分布區域，催化的反應具有一定的順序性，使許多反應能有條不紊地進行。
酶的來源多為生物細胞。生物細胞內產生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別很大。
因此，在提取某一種酶時，首先應當根據需要，選擇含此酶最豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、澱粉酶和脂酶的好材料。由於從動物內臟或植物果實中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業上大多採用培養微生物的方法來獲得大量的酶制劑。從微生物中來生產酶制劑的優點有很多，既不受氣候地理條件限制，而且動植物體內酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產酶量又豐富，還可以通過選育菌種來提高產量，用廉價原料可以大量生產。
由於在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質以及其他雜質，因此為製取某酶制劑時，必須經過分純化的手續。
酶是具有催化活性的蛋白質，蛋白質很容易變性，所以在酶的提純過程中應避免用強酸強鹼，保持在較低的溫度下操作。在提純的過程中通過測定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在分離提純過程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標，在整個酶的分離純化過程中的每一步驟，始終要測定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經過某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取捨。

酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質，然後再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質，然後製成純化的酶制劑。下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹：
一、預處理及固液分離技術
1.細胞破碎（cell disruption）
高壓均質器法：此法可用於破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑麴黴菌。將細胞懸浮液在高壓下通入一個孔徑可調的排放孔中，菌體從高壓環境轉到低壓環境，細胞就容易破碎。菌懸液一次通過均質器的細胞破碎率在12%-67%。細胞破碎率與細胞的種類有關。要達到90%以上的細胞破碎率，起碼要將菌懸液通過均質器兩次。最好是提高操作壓力，減少操作次數。但有人報道，當操作壓力達到175Mpa時，破碎率可達100%。當壓力超過70Mpa時，細胞破碎率上升較為緩慢。高壓均質器的閥門是影響細胞破碎率的重要因素。絲狀菌會堵塞均質器的閥門，尤其高濃度菌體時更是如此。在豐富培養基上比在合成培養基上生長的大腸菌更難破碎。
容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價格便宜，常用來裂解細胞。具體做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置於0.5%的氯化鈉溶液中，使細胞濃度為5%（乾重），在35℃用0.68kg（乾重）的蛋清處理20min，得到的細胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機將細胞碎片和胞內蛋白質除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分數），可以得到純度為5%的過氧化氫酶1500g。
2.離心
離心分離過程可分為離心過濾、離心沉澱、離心分離3種類型，所使用的設備有過濾式離心機、沉降式離心機和離心機。過濾式離心機的轉鼓壁上開有小孔，壁上有過濾介質，一般可用於處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場合。沉降式離心機用於分離固體濃度較低的固液分離，如發酵液中的菌體，用鹽析法或有機溶劑處理過的蛋白質等。分離機用於分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。
在生物領域採用的離心機系統，除了應具備離心機的一般要求外，還應滿足生物生產的技術要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產品不受污染並不污染環境。現代哦離心機裝置包括以下三個步驟，並進行程序控制：離心、離心系統的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機產品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉筒主軸上下的碳化硅動環和固定環組成，密封由水連續冷卻和潤滑，可防止產品被污染，也可防止生產過程中排出的廢物對環境的污染。該離心機又如一個密閉的壓力容器，可在121℃溫度下進行蒸汽滅菌，該離心設備設有環繞離心機轉筒的冷卻夾套，對懸浮液和濃縮的固體都能進行充分的冷卻，並能有效地控制溫度，這對於生物製品是非常重要的。如BTPX205型離心機可用於細胞收集、培養液的凈化和細胞碎片的分離，可用於疫苗、酶制劑等的提取。該機的其他輔助系統及控制系統也較為完善，如設有壓力指示器、力量計、溫度感測器和液面感測器。
3.膜分離技術
在蛋白質純化過程中主要用到的膜分離技術多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過孔徑非常小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質透過薄膜，而大分子被截留於膜表面。大多數超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結合在一起而組成的。功能膜決定了膜的孔徑，而支撐膜提供機械強度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優點是：操作條件溫和，無相變化，對生物活性物質沒有破壞。
超濾系統主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過液收集罐組成，料液經泵打入超濾器，水及低分子量物質排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環。當料液濃縮至一定的倍數後即可作為進一步處理的濃縮料液。
超濾應用於蛋白質類物質的濃縮和脫鹽過程中時應注意以下問題：第一，在超濾循環過程中，由於泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的溫度會逐漸升高，會造成蛋白質分子的損失。因此，料液貯罐應加冷卻系統，並安裝自動測溫及控制系統。第二，某些酶的輔助因子散失為問題：一些酶含有輔助因子，其分子量小，超濾時易從透過液中排除掉，因而在超濾前或超濾後要添加一定濃度的的輔助因子。
還可將超濾與親和層析相結合以提高分離純度。其工作原理是：當溶液中欲被分離的蛋白質不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時，如果在膜的一側結合著親和配基，該蛋白質就會與配基結合因而結聚在膜的這一側。不與配基結合的其他物質就將穿過孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質洗脫下來，洗脫液用於進一步的分離純化。
4.泡沫分離
原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由於這些組分的表面活性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩定性取決於操作條件及溶液的生物學特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分離。
蛋白質較易吸附與氣液界面，這有利於其結構的穩定。泡沫分離過程是：蛋白質從主體溶液中擴散到氣液界面，該過程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發生重排，一般認為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會發生由多個分子聚集在一起的現象。在氣液界面形成的蛋白質膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類型取決於主體溶液及氣液界面上蛋白質的特性、結構和濃度。
泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質的濃度/最初溶液中蛋白質濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質的提取率/最初的蛋白質質量），或使多組分混合物中某一組分的分配系數最大。

二、抽提
沉澱
1. 鹽析
常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價格便宜。硫酸銨沉澱蛋白質的能力很強，其飽和溶液能使大多數的蛋白質沉澱下來。對酶沒有破壞作用。
pH的控制：應從酶的溶解度與穩定性兩個方面考慮，在酶等電點時其溶解度最小易沉澱，但有些酶再等電點時穩定性較差，因此要選擇最佳pH值.一般要求在酶最穩定的pH值的前提下再考慮最適宜酶沉澱的pH值。在操作中一旦確定最佳pH值後，在添加硫酸銨之前甲酸或鹼調節好酶液的pH值，要盡量避免溶液pH值的波動以免破壞酶的穩定性。在添加硫酸銨時要注意攪拌，並注意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細粉。
溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩定性能較好，可在常溫下進行鹽析操作，而對於大多數酶，盡可能在低溫下操作。
酶液的凈置：加完硫酸銨後，酶液要靜置一段時間，使酶蛋白完全沉澱下來，酶靜置後，就不要再加以攪拌。
2．有機溶劑沉澱
有機溶劑選擇：可用於酶蛋白沉澱的有機溶劑包括醇類物質等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。
有機溶劑沉澱操作：有機溶劑一般都使蛋白質變性，當溫度較高時變性蛋白質分子就會變成永久失活。因此用有機溶劑處理時最好在0℃以下進行。用有機溶劑沉澱得到的酶蛋白不要放置過久，要盡快加水溶解。
3.聚合物絮凝劑沉澱
聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭奪水分子，具有脫水作用使酶沉澱。聚乙二醇作為一種沉澱劑的優點是在水溶液中，其濃度可達到50%，濃度為6%-12%的蛋白質大都可以沉澱下來。這種試劑不需要低溫操作，而且對蛋白質的穩定還有一定的保護作用。聚乙二醇不會被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。
4．用金屬離子和絡合物沉澱
酶和其他蛋白質都會形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉澱的缺點是酶與金屬離子相互作用後，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結合的]金屬離子會催化酶變性而失活。
5．用特殊試劑沉澱法
用鏈黴素可選擇性去除核酸，從而使胞內酶沉澱出來。鏈黴素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質）對於選擇性沉澱核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活。
6．親和沉澱
將親和反應的高度選擇性、低處理量特性與沉澱操作的大處理量、地選擇性有機結合形成了親和沉澱技術。將配基與可溶性載體偶聯後形成載體-配基復合物，該復合物與生物分子結合後在一定條件下可以沉澱出來。
配基-載體復合物可以選擇性地與蛋白質結合，溶液中的pH值、離子強度及蛋白質濃度等條件對親和結合的影響力並不大，只有競爭性的配基會降低產物與原配基的親和結合力，甚至使親和結合發生逆轉。
引導產生沉澱的方法有：離子交聯；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷的疏水基團；改變pH值，誘導產生疏水沉澱；溫度誘導產生沉澱。
親和結合：將親和配基加入到含有目的物蛋白質的溶液中，調節好有關沉澱的條件，使之有利於親和結合。
洗滌：為經過處理的粗製液中發生親和沉澱可能會發生非特異性結合，尤其是使用帶電的聚合物，離子交換的效應將使其他蛋白質共同沉澱，因此在分離目的物之前要洗滌沉澱物。其做法是：加入適當的清洗劑重新溶解沉澱，再沉澱；或在專一性洗脫之前，徹底清洗沉澱。在上述過程中要始終保持目的蛋白質與配基處於親和結合狀態。
配基-載體復合物與目的蛋白質的分離：分離結束之後，要確保回收目的蛋白質和配基-載體復合物，目的蛋白質要達到一定的純度，回收率要高。

⑹ DEAE纖維素柱的原理

DEAE纖維素柱原理，基於離子交換層析：離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。

陰離子交換基質結合，帶有負電荷的蛋白質，然後這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質從而洗脫下來。

(6)陰離子交換柱防止核酸擴展閱讀：

基本信息：

性狀：乾燥纖維狀。

用途：用於柱色譜分析，用以分離提純多糖、肽、核苷酸、酶、血清組分和病毒等，陰離子交換填料。

保存：常溫乾燥封袋保存。

DEAE—纖維素的使用方法：

稱取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸餾水浸泡過夜，觀察溶脹後DEAE的體積。根據所需層析柱的柱床體積計算所需DEAE的用量，稱取所需DEAE用蒸餾水浸泡過夜，其間換幾次水，每次除去細小顆粒。

抽干，改用0.5mol/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用無離子水漂洗，使pH至8左右（用pH試紙檢查）。再改用0.5mol/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用無離子水洗至pH6左右。本實驗中在用前應以0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，浸泡平衡後使用。

⑺ 蛋白純化怎麼去除核酸

1、根據所選蛋白的性質，選擇合適的介質和條件，想辦法把蛋白結合在內柱子上，（有tag的話用這容個方法最好了），然後用高鹽（0.5-3M NaCl）洗，一般會洗下來一個峰，就是被洗下來的核酸了。
2、試試在高鹽條件下加Mn2+，因為高鹽可以讓核酸和蛋白分離，而Mn2+對核酸沉澱有一定的效果。
但是要十分小心的是，這類蛋白本身的天然性質就是要結合核酸的，有的時候核酸去除干凈了，蛋白也沉澱了，所以沒那麼容易，很多小條件要結合所選的蛋白自己去摸索。

⑻ 硫酸鈣溶度積的測定

難溶強電解質溶度抄積常數Ksp的測定一、 實驗目的1、 了解極稀溶液濃度的測量方法;2、 了解測定難溶鹽Ksp的方法;3、 鞏固活度、活度系數、濃度的概念及相關關系。二、 實驗原理 在一定溫度下，一種難溶鹽電解質的飽和溶液在溶液中形成一種多項離子平衡，一般表示式為:這個平衡常數Ksp稱為溶度積常數，或簡稱溶度積，嚴格地講Ksp應為相應個離子活度的乘積，因為溶液中個離子有牽制的作用，但考慮的難容電解質飽和溶液中離子強度很小，可警世的用濃度來代替活度。就AgCl而言 從上式可知，若測出難溶電解質飽和溶液中個離子的濃度，就可以計算出溶度積Ksp。因此測量最終還是測量離子濃度的問題。若設計出一種測量濃度的方法，就找到了測量Ksp的方法。具體測量濃度的方法，包括滴定法(如AgCl溶度積的測定)，離子交換法(如CuSO4溶度積的測定)，電導法(如AgCl溶度積的測定)，離子電極法(如氯化鉛溶度積的測定)，電極電勢法(Ksp與電極電勢的關系)，即分光光度法(如碘酸銅溶度積的測定)等