離子交換柱純化多糖

A. 柱層析分離純化多糖

在使用部分收集器時，每個梯度應洗至苯酚-硫酸法基本無多糖檢出為止

B. 求實驗室胡蘿卜多糖提取方案，要具體的條件步驟

由於胡蘿卜主要的多糖類型為果膠，因此根據果膠的特殊性質可以依次採用水提、CDTA(或
EDTA)、弱鹼螯合等方式從胡蘿卜中提取，分別得到水溶性果膠、CDTA
螯合果膠和弱鹼螯合果膠等不同性質的多糖，同時可採用超聲、微波、酶解等方法輔助提取，提高多糖得率。
不同提取方法獲得胡蘿卜多糖的相對分子質量存在一定差異，一般都小於50萬， 有少數報道胡蘿卜多糖相對分子質量超過了50 萬。

C. 多糖提取純化過程中的注意事項

多糖純化：
a、分部沉澱法：根據各種多糖在不同濃度的低級醇或丙酮中具有不同溶解度的性質，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉澱，經反復溶解與沉澱後，直到測得的物理常數恆定（最常用的是比旋光度測定或電泳檢查）。這種方法適合於分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩定，常在pH7進行，唯酸性多糖在pH7時－COOH是以－COO` 離子形式存在的，需在pH2－4進行分離，為了防止者基畢苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖製成各種衍生物如甲醚化物、乙醯化物等，然後將多糖衍生物溶於醇中，最後加入乙醚等極性更小的溶劑進行分級沉澱分離。
b、鹽析法：在天然產物的水提液中，加入無機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉澱析出，與其它水溶性較大的雜質分離。常做鹽析的無機鹽的有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
c、季銨鹽沉澱法：季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉澱，常用於酸性多糖的分首芹離。通常季胺鹽及其氫氧化物並不與中性多糖產生沉澱，但當溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時，也會與中性多糖形成沉澱。常用的季銨鹽有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的濃度一般為1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉澱出來，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小於9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會被沉澱出來
d、柱層析：
纖維素柱層析：纖維素柱層析鋒棚對多糖的分離既有吸附色譜的性質，又具有分配色譜的性質，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先後順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最後出柱，與分級沉澱法正好相反。
纖維素陰離子交換柱層析：最常見的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或鹼型），洗脫劑可用不同濃度的鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適於分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝膠柱層析：凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開來，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（sephadex G）、瓊脂糖凝膠（sepharose bio－gel A）、聚丙烯醯胺凝膠（bio－gel P）等，常用的洗脫劑是各種濃度的鹽溶液及緩沖液，但它們的離子強度最好不低於0.02。出柱的順序是大分子的先出柱，小分子的後出柱。由於糖分子與凝膠間的相互作用，洗脫液的體積與蛋白質的分離有很大的差別。在多糖分離時，通常是用孔隙小的凝膠如sephadex G－25、G－50等先脫去多糖中的無機鹽及小分子化合物，然後再用孔隙大的凝膠sephadex G－200等進行分離。凝膠柱層析法不適合於粘多糖的分離。

D. 在本實驗中使用了有機溶劑純化多糖，有其他替代的試劑或方法嗎

多糖（polysacharides，PS），又稱多聚糖，是由個以上的單糖通過苷鍵連接而成的，具有廣泛生物活性的天然大分子化合物。它廣泛分布於自然界高等植物、藻類、微生物（細菌和真菌）與動物體內。20世紀60年代以來，人們逐漸發現多糖具有復雜的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作為廣譜免疫促進劑，具有免疫調節功能，能治療風濕病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系統疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明顯的抗病毒和抗腫瘤作用[10]，黑木耳多糖、銀杏外種皮多糖和蘆薈多糖可抗腫瘤和增強人體免疫功能[3-5]。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促進核酸與蛋白質的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗輻射，增強免疫功能等生物學作用[6]，麥冬多糖具有降血糖及免疫增強作用[7-8]，動物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制細胞分裂和分化，調節細胞的生長與衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，銀杏外種皮粗多糖具有抗衰老、抗過敏、降血脂、止咳祛痰、減肥等功能[11]。
另外，多糖作為葯物，其毒性極小，因而多糖的研究已引起人們極大的興趣。
由於多糖具有的生物活性與其結構緊密相關，而多糖的結構又是相當復雜的，所以在這一領域的研究相對緩慢。但人們在多糖的分離提取與純化方面已做出了不少工作。
1. 多糖的提取[12]
1.1 熱水浸提法：
1.1.1多糖提取條件的優選
根據文獻報道[13]：影響熱水浸提多糖的因素主要有提取時間、提取次數、溶劑體積、浸提溫度、pH值、醇析濃度和植物顆粒大小等。在試驗前對上述多種因素利用正交實驗法做出優選，才能選出最佳提取方案。
1.1.2其步驟為：原料→粉碎→脫脂→粗提（2－3次）→吸濾或離心→沉澱→洗滌→乾燥
首先除去表面脂肪。原料經粉碎後加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加熱攪拌或迴流1－3小時，脫脂後過濾得到的殘渣一般用水作溶劑（也有用氫氧化鉀鹼性水液、氯化鈉水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氫氧化鈉作為提取溶劑）提取多糖。溫度控制在90－100℃，攪拌4－6小時，反復提取2－3次。得到的多糖提取液大多較粘稠，可進行吸濾。也可用離心法將不溶性雜質除去，將濾液或上清液混合（得到的多糖若為鹼性則需要中和）。然後濃縮，再加入2－5倍低級醇（甲醇或乙醇）沉澱多糖；也可加入費林氏溶液或硫酸銨或溴化十六烷基三甲基銨等，與多糖物質結合生成不溶性絡合物或鹽類沉澱。然後依次用乙醇、丙酮和乙醚洗滌。將洗干後疏鬆的多糖迅速轉入裝有五氧化二磷和氫氧化鈉的真空乾燥器中減壓乾燥（若沉澱的多糖為膠狀或具粘著性時，可直接冷凍乾燥）。乾燥後可得粉末狀的粗多糖。
1.2 微波輔助提取法：
其原理為利用不同極性的介質對微波能的不同吸收程度，使基體物質中的某些區域和萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使萃取物質從基體或體系中分離出來，進入到介電常數小，微波吸收能力較差的萃取劑中[14]。
由於微波能極大加速細胞壁的破裂，因而應用於中草葯中有效成分的提取能極大加快提取速度，增加提取產率。而且由於其選擇性好，提取後基體能保持良好的性狀，提取液也較一般的提取方法澄清[15]。
聶金源等在柴胡多糖和黃酮化合物的提取[18]中對微波輔助提取法、超聲輔助法和索氏提取法進行比較，發現微波輔助提取法所需時間最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。
1.3 超聲輔助法：
其原理是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超聲波的次級效應，如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學效應等也能加速欲提取成分的擴散釋放並充分與溶劑混合，利於提取[16]。
超聲波輔助法與常規提取法相比，具有提取時間短、產率高、無需加熱等優點[17]。
1.4 索氏提取法：
將植物粉末置於索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃條件下提取至無色（一般為6小時）。過濾，濾渣揮發乾燥完溶媒後加入80%乙醇，再提取6小時，過濾，濾渣乙醇揮發乾燥後加蒸餾水。迴流提取2次，趁熱過濾，濾液減壓濃縮，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃乾燥，稱重。
1.5 醇提法：
先後將90%和50%乙醇加入植物粉末中，振盪充分再抽濾。濾液中加入足量無水乙醇，至於4℃冰箱中過夜。減壓抽濾，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通風乾燥箱中乾燥，再置乾燥皿中恆重保存。
醇提法方法簡單，易於操作，但提取率較低，乙醇使用量大，不宜大規模提取使用。
1.6 其它方法：
多糖的提取方法還有稀鹼液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由於稀酸、稀鹼條件下，易使多糖發生糖苷鍵的斷裂，部分多糖發生水解而使多糖的提取率減少，因而很多試驗中避免採用稀鹼液浸提法和稀酸液浸提法。
2. 多糖的純化
2.1 多糖中雜質除去方法 粗多糖中往往混雜著蛋白質、色素、低聚糖等雜質，必須分別除去。
2.1.1 除蛋白質
採用醇沉或其它溶劑沉澱所獲得的多糖，常混有較多的蛋白質，脫去蛋白質的方法有多種：如選擇能使蛋白質沉澱而不使多糖沉澱的酚、三氯甲烷、鞣質等試劑來處理，但用酸性試劑宜短，溫度宜低，以免多糖降解。常用的方法有[19]：
2.1.1.1 沙維積法（Sevag法）[20]：根據蛋白質在氯仿等有機溶劑變性而不溶與水的特點，將多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比調為25:5:1或25:4:1，混合物劇烈振搖20到30分鍾，蛋白質與氯仿－戊醇（或正丁醇）生成凝膠物而分離，然後離心，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質。此種方法較溫和，在避免降解上有較好效果，但效率不高，如五味子多糖的提取實驗中要重復處理達三十幾次。並且每次除去蛋白質變性膠狀物時，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖與蛋白質結合的蛋白聚糖和糖蛋白，在處理時會沉澱下來，造成多糖的損失。如能配合加入一些蛋白質水解酶，再用Sevage法效果更佳。
2.1.1.2 三氟三氯乙烷法[21]：多糖溶液與三氟三氯乙烷等體積混合，低溫下攪拌10min左右，離心得上面水層，水層繼續用上述方法處理幾次，即得無蛋白質的多糖溶液，此法效率高，但溶劑沸點較低，易揮發，不宜大量應用。
2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5％－30％三氯醋酸，直至溶液不再繼續混濁為止，在5－10℃放置過夜，離心除去沉澱即得無蛋白質的多糖溶液。此法會引起某些多糖的降解。
Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三種方法均不適合糖肽，因糖肽也會像蛋白質那樣沉澱出來。對於對鹼穩定的糖蛋白，在硼氫化鉀存在下，用稀鹼溫和處理，可以把這種結合蛋白質分開[1]。
2.1.1.4 酶解法[22]：在樣品溶液中加入蛋白質水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶等，使樣品中的蛋白質降解。通常將其與Sevag法綜合使用除蛋白質效果較好。
2.1.1.5 鹽酸法[23]：取樣品濃縮液，用2mol/L鹽酸調節其PH至3，放置過夜，在3000r/min條件下離心，棄去沉澱，即脫去蛋白質。
另有李知敏[23]和葉將瑜[25]等人分別在植物多糖實驗中證明：鹽酸法、三氯乙酸法及Sevag法脫蛋白率分別為72.5％、46.1％和42.3％，多糖的損失率分別為15.1%、6.1％和14.3％。鹽酸法脫蛋白率高，但多糖的損失率也較高;三氯乙酸法較溫和，但除蛋白效率不高；Sevag法的脫蛋白效果不及前兩種。
2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和飽和Ba（OH）2溶液，振盪後離心去蛋白。此法除蛋白不夠徹底，可結合Sevag法使用。還可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉澱完全，在4000r/min的條件下離心10min，收集上清液，即為除蛋白液。還有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白，將混合液清搖，再靜置，取上清液。此過程需重復多次方可除盡蛋白。
除去蛋白質的樣品用紫外分光光度計檢驗，觀察在280mm處是否有吸收，如果無吸收則表明蛋白質已經除盡[24]。
2.1.2 除色素
2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素[12]：活性炭屬於非極性吸附劑，有著較強的吸附能力，特別適合於水溶性物質的分離。它的來源充足，價格便宜，上柱量大，適用於大量制備性分離。目前用於色譜分離的活性炭主要分為粉末狀活性炭、顆粒狀活性炭、錦綸活性炭三種。一般情況下，盡量避免用活性炭處理，因為活性炭會吸附多糖，造成多糖的損失。
2.1.2.2對於植物來源的多糖，可能含有酚型化合物而顏色較深，這類色素大多呈負性離子，不能用活性炭吸收劑脫色，可用弱鹼性樹脂DEAE纖維素或DuoliteA－7來吸附色素。
2.1.2.3若糖和色素時結合的，易被DEAE纖維素吸附，不能被水洗脫，這類色素可進行氧化脫色：以濃氨水或NaOH液調至PH8.0左右，50℃以下滴加H2O2至淺黃色，保溫2小時。
2.1.2.4 依次用丙酮、無水乙醚和無水乙醇洗滌多糖，即可得到較為純凈的多糖。此法較為簡單，便於操作，多糖損失也較小。
2.1.2.5 用4:1的氯仿-正丁醇除色素。操作簡單，多糖有一定損失。
2.1.2.6發酵來源的多糖顏色一般較淺，色素含量較少，一般可不除色素。
2.1.2.7對於動物，微生物等提取得到的多糖也可根據不同情況按上述方法處理。
2.1.3 除低聚糖等小分子雜質
2.1.3.1採用逆向流水透析法。即准備好一桶蒸餾水，用一根導管將水通入透析袋的燒杯底部，另用一根導管將水引出，根據水量控制流速，使水緩慢流動48小時。這樣得到的就是多糖的半精品。
2.1.3.2利用溶液濃度擴散效應，將分子量小的物質如無機鹽、低聚糖等從透析袋滲透到袋外的蒸餾水中，不斷換水即可保持濃度差，從而除盡小分子雜質。具體的做法是根據多糖溶液的體積截取相應長度的透析袋，用透析夾夾住一端，灌入多糖液，離液面2－3cm處夾緊透析袋，置於一大燒杯中，注入蒸餾水至完全浸沒透析袋後，用磁力攪拌器慢速攪拌，每12小時換一次水，重復3－4次。
2.2 多糖的純化方法 純化是將多糖混合物分離為單一多糖的過程，純化的方法主要有以下幾種：
2.2.1 分部沉澱法 根據各種多糖在不同濃度的低級醇或丙酮中具有不同溶解度的性質，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉澱，經反復溶解與沉澱後，直到測得的物理常數恆定（最常用的是比旋光度測定或電泳檢查）。這種方法適合於分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩定，常在pH7進行，唯酸性多糖在pH7時－COOH是以－COO` 離子形式存在的，需在pH2－4進行分離，為了防止苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖製成各種衍生物如甲醚化物、乙醯化物等，然後將多糖衍生物溶於醇中，最後加入乙醚等極性更小的溶劑進行分級沉澱分離。
2.2.2 鹽析法 在天然產物的水提液中，加入無機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉澱析出，與其它水溶性較大的雜質分離。常做鹽析的無機鹽的有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
2.2.3 季銨鹽沉澱法 季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉澱，常用於酸性多糖的分離。通常季胺鹽及其氫氧化物並不與中性多糖產生沉澱，但當溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時，也會與中性多糖形成沉澱。常用的季銨鹽有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的濃度一般為1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉澱出來，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小於9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會被沉澱出來。
2.2.4 柱層析：包括纖維素柱層析、纖維素陰離子交換柱層析、凝膠柱層析、親和層析、高壓液相層析和其它柱層析。如用活性炭及硅膠做載體的柱層來分離多糖；或用硼砂型的離子交換樹脂分離中性多糖。
纖維素柱層析 纖維素柱層析對多糖的分離既有吸附色譜的性質，又具有分配色譜的性質，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先後順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最後出柱，與分級沉澱法正好相反。
纖維素陰離子交換柱層析 最常見的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或鹼型），洗脫劑可用不同濃度的鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適於分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝膠柱層析 凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開來，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（sephadex G）、瓊脂糖凝膠（sepharose bio－gel A）、聚丙烯醯胺凝膠（bio－gel P）等，常用的洗脫劑是各種濃度的鹽溶液及緩沖液，但它們的離子強度最好不低於0.02。出柱的順序是大分子的先出柱，小分子的後出柱。由於糖分子與凝膠間的相互作用，洗脫液的體積與蛋白質的分離有很大的差別。在多糖分離時，通常是用孔隙小的凝膠如sephadex G－25、G－50等先脫去多糖中的無機鹽及小分子化合物，然後再用孔隙大的凝膠sephadex G－200等進行分離。凝膠柱層析法不適合於粘多糖的分離。
親和層析 用凝聚素（一般是蛋白質和糖蛋白）做親和色譜來分離多糖。
高壓液相層析
2.2.5 制備性區域電泳 分子大小、形狀及所負電荷不同的多糖其在電場的作用下遷移速率是不同的，故可用電泳的方法將不同的多糖分開，電泳常用的載體是玻璃粉。具體操作是用水將玻璃粉拌成膠狀、柱狀，用電泳緩沖液（如0.05mol/L硼砂水溶液，PH9.3）平衡3天，將多糖加於柱上端，接通電源，上端為正極（多糖的電泳方向是向負極的），下端為負極，其單位厘米的電壓為1.2－2V，電流30－35MA，電泳時間為5－12小時。電泳完畢後將玻璃粉載體推出柱外，分割後分別洗脫、檢測。該方法分離效果較好，但只適合於實驗室小規模使用，且電泳柱中必須有冷卻夾層。
2.2.6 金屬絡合物法 常用的絡合劑有費林溶液、氯化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等。
2.2.7 其它方法：純化除採用上述方法外，還有超過濾法（多糖溶液通過各種已知的超過濾膜就能達到分離）、活性炭柱色譜。另據報道，國外多採用的LKB柱色譜系統，用比旋度、示差折射及紫外檢測多糖，各組分的峰位自動記錄，分離效果好且方便。
2.3 多糖純度的鑒定
2.3.1超離心法 由於微粒在離心力場中移動的速度與微粒的密度、大小和形狀有關，故當將多糖溶液進行密度梯度超離心時，如果是組分均一的多糖，則應呈現單峰。具體的做法是將多糖樣品用0.1molNaCl或0.1molTris鹽緩沖溶液配製成1％－5％的溶液，然後進行密度超離心，待轉速達到恆定後（通常是60000r/min），採用間隔照明的方法檢測其是否為單峰。
2.3.2高壓電泳法 由於中性多糖導電性差、分子量大、在電場中的移動速度慢，故常將其製成硼酸絡合物進行高壓電泳。多糖的組成不同、分子量不同，其與硼酸形成的絡合物就不同，在電場作用下的相對遷移率也會不同，故可用高壓電泳的方法測定多糖的純度。通常高壓電泳所用的支持體是玻璃纖維紙、純絲綢布、聚丙醯銨凝膠、纖維素醋酸酯薄膜等。緩沖液是PH9.3－12的0.03－0.1mol的硼砂溶液，電壓強度約為30－50V/cm，時間是30－120min。由於電泳時會產生大量的熱，所以要有冷卻系統，將溫度維持在0℃左右，否則會燒掉支持體。一般單糖、低聚糖因醛基而發生的顏色反應在多糖上不明顯，電泳後常用的顯色劑是p－茴香胺硫酸溶液（p－anisidine）和過碘酸希夫試劑等。
2.3.3凝膠柱層析 常用的凝膠是Sephadex、Sepharose、Sephacryl，展開劑為0.02－0.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶與0.02醋酸1：1的緩沖溶液，柱高和柱直徑之比大於40。
2.3.4旋光測定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其濃度為10％左右，離心得沉澱。上清液再加入乙醇使其濃度為20％－25％，離心所得二次沉澱，比較二次沉澱的比旋度。如果比旋度相同則為純品，否則為混合物。
2.3.5其它方法：官能團摩爾比恆定法，即如為純品兩次分離所得產物的官能團如－COOH、－NH2、－SO3H、－CHO等摩爾比應該恆定。類似的方法還有示查折射法、HPLC法等。此外德國常用高壓液相法來檢測多糖純度，結果可靠。
必須注意的是：純度檢查一般要求有上述兩種方法以上的結果才能肯定。

E. 多糖的純化方法與哪些

ctab即十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度的溶液中沉澱核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質和中性多聚糖仍留在溶液里，在高離子強度的溶液里，ctab與蛋白質和大多數酸性多聚糖以外的多聚糖形成復合物，只是不能沉澱核酸。因此，ctab可以用於從大量產生粘多糖的有機體如植物以及某些革蘭氏陰性菌（包括e.coli的某些株）中制備純化dna
去垢劑(表面活性劑)是一類即具有親水基又具有疏水基的物質，一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分陰離子、陽離子和中性去垢劑等多種類型，中性去垢劑在蛋白提取鍾應用的較多。
a．中性去垢劑
又稱非離子表面活性劑，對蛋白質的變性作用影響較少，宜於蛋白質或酶提取之用。一般市售中性去垢劑有聚乙二醇類，如peg200；多元醇類表面活性劑，如山梨醇、司盤類和吐溫類；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄澤類、平平加類；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如igepal
co、乳化劑op、triton、pluronic(用作消泡劑、潤濕劑、增溶劑)、泡敵。中性去垢劑作用後可通過sephadex
lh-50柱除去；也可直接上deae-sephadex柱層析分離目的蛋白，不必先除去去垢劑。
b．陰離子去垢劑
常見的有十二烷基硫酸鈉和十二烷基璜酸鈉。前者可促進核蛋白的溶解，將核酸釋放出來，並對核酸酶有一定抑製作用，常用於核酸的提取。
c．陽離子去垢劑
如潔爾滅、新潔爾滅、ctab、cpc、zeph、克菌定、消毒凈（tmpb）、杜滅芬等，消毒滅菌類居多。
d．天然表面活性劑
又稱為生物表面活性劑，包括種類較為廣泛，如各種樹膠（阿拉伯膠、杏膠、桃膠、果膠）、明膠、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、瓊脂、海藻酸鈉、酪蛋白、膽甾醇、膽酸類、多糖類（如環糊精）等。
e．兩性表面活性劑
在鹼性水溶液中呈陰離子表面活性劑的性質，起泡性好，去污力也強；在酸性溶液中則呈現陽離子表面活性劑特徵，其殺菌性很強。
蛋白質變性劑的作用是破壞蛋白質的次級鍵，如氫鍵、鹽鍵和疏水力，引起天然構象的解體；它們並不破壞共價鍵，如肽鍵和二硫鍵，故不涉及一級結構的改變。變性劑有溶解型和沉澱型兩類，sds、尿素和胍鹽是有效的溶解型變性劑，而三氯乙酸、甲醇、和氯仿/異戊醇是有效的沉澱變性劑。一般而言，變性劑應用時常大大過量，破壞氫鍵的變性劑用量至少兩倍於氨基酸的克分子數，如1克蛋白質可可結合1.4g。
sds溶於水可達25%，對溫度敏感，w/v貯存液最為方便。需要注意的是sds的鉀鹽是不溶性的，所以sds溶液中要避免混入鉀鹽。
尿素極易溶於水，可達10mol/l,在8mol/l以上要注意溫度以防止沉澱。尿素在水中緩慢分解形成氨及高度活性的氰酸離子，故要防止高溫。
三氯乙酸與過氯酸（tca，pca）都是極好的沉澱劑，能沉澱蛋白質和核酸，前者應用更為廣泛。

F. DEAE-52離子交換色譜柱精製多糖 在加洗脫劑前會不會有多糖出來

這個理論上來說是不會有多糖出來的，但是實際上會有很少的部分會流出，這取決於吸附劑的多少，和能力的強弱

G. 多糖的純化方法與哪些

多糖純化：
a、分部沉澱法：根據各種多糖在不同濃度的低級醇或丙酮中具有不同溶解度的性質，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉澱，經反復溶解與沉澱後，直到測得的物理常數恆定（最常用的是比旋光度測定或電泳檢查）。這種方法適合於分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩定，常在pH7進行，唯酸性多糖在pH7時－COOH是以－COO` 離子形式存在的，需在pH2－4進行分離，為了防止苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖製成各種衍生物如甲醚化物、乙醯化物等，然後將多糖衍生物溶於醇中，最後加入乙醚等極性更小的溶劑進行分級沉澱分離。
b、鹽析法：在天然產物的水提液中，加入無機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉澱析出，與其它水溶性較大的雜質分離。常做鹽析的無機鹽的有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
c、季銨鹽沉澱法：季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉澱，常用於酸性多糖的分離。通常季胺鹽及其氫氧化物並不與中性多糖產生沉澱，但當溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時，也會與中性多糖形成沉澱。常用的季銨鹽有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的濃度一般為1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉澱出來，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小於9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會被沉澱出來
d、柱層析：
纖維素柱層析：纖維素柱層析對多糖的分離既有吸附色譜的性質，又具有分配色譜的性質，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先後順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最後出柱，與分級沉澱法正好相反。
纖維素陰離子交換柱層析：最常見的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或鹼型），洗脫劑可用不同濃度的鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適於分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝膠柱層析：凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開來，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（sephadex G）、瓊脂糖凝膠（sepharose bio－gel A）、聚丙烯醯胺凝膠（bio－gel P）等，常用的洗脫劑是各種濃度的鹽溶液及緩沖液，但它們的離子強度最好不低於0.02。出柱的順序是大分子的先出柱，小分子的後出柱。由於糖分子與凝膠間的相互作用，洗脫液的體積與蛋白質的分離有很大的差別。在多糖分離時，通常是用孔隙小的凝膠如sephadex G－25、G－50等先脫去多糖中的無機鹽及小分子化合物，然後再用孔隙大的凝膠sephadex G－200等進行分離。凝膠柱層析法不適合於粘多糖的分離。

H. 離子交換純化多糖使用什麼方法檢測收集

離子交換純化多糖使用什麼方法檢測收集
鑒定多糖（參考資料）：
1.苯酚-硫酸法 需要多糖的純品和特定的酶
2.蒽酮-硫酸法 多糖在濃硫酸水合產生的高溫下迅速水解，產生單糖，單糖在強酸條件下與苯酚反應生成橙色衍生物。在波長490nm左右處和一定濃度范圍內，該衍生物的吸收值與單糖濃度呈線性關系，從而可用比色法測定其含量，所用的單糖對照品盡量採用與其多糖組成一致或為含量較高的單糖，這樣測得的值較准確。
3.3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法） 在鹼性條件下顯色，較准確測定還原糖與總糖的含量從而求出多糖的含量，可消除還原性雜質的干擾。

多糖的分離純化
在多糖提取物中，常會有無機鹽、蛋白質、色素及小分子物質等雜質，必須分別除去．一般是先脫除非多糖組分，再對多糖組分進行分級．
2．1 除蛋白：除蛋白質時一般選擇能使蛋白質沉澱而不使多糖沉澱的試劑來處理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必須處理時間短，溫度低，避免多糖降解。Sevage法（氯仿：戊醇/丁醇=4：1）和三氟三氯乙烷法在避免降解上有較好效果但要達到除盡游離蛋白質的目的仍需反復處理。如能加入蛋白質水解酶，使蛋白質大分子進行一定程度的降解，再用Sevage法處理，一般效果更好。
為了避免使用有機溶劑也可採用反復凍融的方法除蛋白，將多糖液濃縮後，一20℃室溫反復凍融7～8次，離心除去蛋白質。另外，蛋白質在等電點時溶解度最小，用氫氧化鈣飽和液調pH10～pH11可除去偏鹼性的蛋白質，然後再用硫酸調pH5～pH6，可除去偏酸性的蛋白質。凍融和等電點沉澱除蛋白質操作簡單，但多糖液里往往有低濃度的蛋白質殘留，應與其它方法結合使用。
2．2 脫色：植物多糖提取物中含有酚類化合物而使其顏色較深，可用吸附劑(纖維素、硅藻土、活性炭等)、離子交換柱(DEAE一纖維素)、氧化劑(H2O2)等脫除。活性炭比表面積大，吸附能力強，在進行當歸多糖的提取時只向多糖液中加入了0．1％左右的活性炭，煮沸後濾過即完成了脫色操作。此法成本低廉，適合工業化生產。
2．3 除小分子雜質
小分子雜質如低聚寡糖的殘留往往影響多糖的生物活性，需要進一步脫除，提高純度。傳統的方法是透析法，該法操作簡單、技術成熟，但周期長，往往需要2一3天，常溫下操作有可能造成多糖的霉變，必要時需加入少量防腐劑或需在低溫條件下進行。隨著膜分離技術的發展，纖維濾器透析法已經發展起來了，它利用不同孔徑的膜使大小不同的分子分級，這種方式可縮短生產周期，而且條件溫和，無疑是多糖脫除雜質的一條新途徑。
2．4 多糖的分級純化
採用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分級的方法可達到純化的目的．可按溶解性不同進行分級、按分子大小和形狀分級(如分級沉澱、超濾、分子篩、層析等)，也可按分子所帶基團的性質分級．
2．4．1按溶解性不同分離
2.4.1.1分步沉澱法
分步沉澱法是根據不同多糖在不同濃度低級醇、酮中具有不同溶解度的性質，從小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮進行分步沉澱．
2.4.1.2 鹽析法
鹽析法是根據不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同而將其分離的一種方法。常用的鹽析劑有氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等，其中以硫酸銨最佳。
2.4.2 按電離性質不同分離
2.4.2.1季胺鹽沉澱法
季胺氫氧化物是一類乳化劑，能與酸性多糖形成不溶性化合物季銨絡合物，此絡合物在低離子強度的水溶液中不溶解而產生沉澱。若提高多糖液pH值或加入硼砂緩沖液，也可使中性多糖沉澱分離。常用季銨鹽有十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。
2．4．3 柱層析法
2.4.3.1凝膠柱層析法
凝膠柱層析法常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，從而使不同大小的多糖分子得到分離純化，但不適宜粘多糖的分離。
2.4.3.2纖維素陰離子交換劑柱層析法
纖維素陰離子交換劑柱層析法常用的交換劑為DEAE一纖維素和ECTEOLA一纖維素，分類硼砂型和鹼型兩種，洗脫劑可用不同濃度鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液，其優點可吸附雜質、純化多糖，並適用於分離各種酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙參多糖、太子參多糖等。
2.4.3.3 活性炭柱層析法
活性炭吸附量大、效率高，是分離水溶性物質的常用吸附劑。柱層析時活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀釋劑，以增加溶液的流速。糖溶液上柱後先用水洗脫無機鹽、單糖等再依次增加乙醇濃度進行洗脫。
2.4.3.4 離子交換柱層析和普通凝膠柱層析聯用法
有些植物的多糖成分復雜， 除中性多糖外，還含有糖醛酸等，因此往往兩種不同性質的色譜柱聯用才能得到單一多糖組分。
2.4.3.5 三種層析柱聯用
採用離子交換葡聚糖凝膠柱、丙烯葡聚糖凝膠柱和葡聚糖凝膠柱三者聯用，即先進行DEAE—SephadexA柱層析，用蒸餾水洗脫。水洗組分進一步用SephacrylS柱層析，得到主要組分再用SephadexG一100柱層析，有時會有較高的得率。
三、多糖的純度鑒定
經過分級純化的多糖在測定結構前須進行純度鑒定．而且多糖的純度不能用通常化合物的純度標准來衡量，因為即便是多糖純品，其微觀也並不均一，僅代表相似鏈長的多糖分子的平均分布，通常所謂的多糖純品也只是一定相對分子質量范圍的多糖的均一組分．目前常用於多糖純度的鑒定方法有：高效液相、 凝膠層析法、電泳法、色譜法、旋光度法等．

多糖的單糖組分的鑒定稱取多糖粗品8 mg，用2 mL濃度為1 mol／L硫酸100*C水解6 h。飽和Ba(OH)2中和至中性，抽濾，取濾液，濃縮，毛細管點樣，薄層層析法分析。採用硅膠G板105"(2活化2 h後使用。標准糖分別為D一半乳糖，D一葡萄糖，D一甘露糖，L一山梨糖、L一阿拉伯糖。展開劑為正丁醇一冰醋酸一水(4：1：5)(體積比)。用AgNO3一NaOH 溶液顯色。

I. 膜分離技術可以完成糖類物質分離嗎

到現在為止膜分離技術暫時不可以完成糖類物質分離。

可以完成糖類物質分離的方法： 分步沉澱法、柱層析法、陰離子交換法、凝膠色譜法、大孔樹脂柱色譜、超濾法

先將糖類物質提取出來

• 分步沉澱法

多糖的結構和分子量不同，其極性大小不同，在有機溶劑（如醇或酮）中的溶解度不同，根據這一原理，可以依次增加醇濃度，從而將多糖按分子量從大到小的沉澱出來。仍需要藉助柱層析法等進一步純化，方可得到均一性的多糖。

• 柱層析法

要獲得均一性的多糖，一般是先經過陰離子交換柱進行粗步純化，然後再用凝膠柱進一步純化。有些多糖也採用大孔樹脂柱進行純化。下面對這三種柱層析法進行詳細介紹。

• 陰離子交換法

一般使用陰離子交換柱對真菌、藻類和高等植物的多糖進行初步分離。陰離子交換色譜常用的介質有DEAE-纖維素、DEAE-瓊脂糖凝膠、DEAE-葡萄糖凝膠。

• 凝膠色譜法

凝膠色譜法根據被分離組分尺寸大小與凝膠的孔徑關系實現分離，類似於分子篩的作用。常用的凝膠有葡聚糖凝膠（SephadexG）、Sephadex LH-20、聚丙烯酸凝膠Toyopearl HW等。多糖的進一步分離往往會選擇用各種凝膠進行分離純化。

• 大孔樹脂柱色譜

大孔樹脂柱色譜是利用大孔樹脂的選擇性吸附作用和分子篩作用分離純化多糖。比如用AB-8大孔樹脂從青錢柳葉中分離純化出均一性多糖。

• 超濾法

超濾是以壓力為推動力的膜分離技術，應用膜分離原理將小分子溶質和溶劑除去而留下大分子溶質，從而使大分子物質得到純化。