『壹』 蛋白質的分離純化技術有哪些
蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的 SO4 和 NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液 pH 在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4 度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25 度）比 0 度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH 值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在 2.5-3.0%。蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25 度時飽和溶液為 4.1M，即 767 克/升；0 度時飽和溶解度為 3.9M，即 676 克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之間，當用其他 pH 值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常
用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠 G-25 或 G-50 過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的 pH 達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同 pH 環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一 pH 條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的 pH 梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的 pH 位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變 pH 或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質
從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。
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『貳』 離子交換層析可用於哪些種類蛋白質的分離
離子交換層析是利用蛋白質在不同PH帶不同種電荷的方法，利用離子交換的方法分離專蛋白的。
離子交換屬內的介質一般是樹脂，陽離子交換型的，使用前樹脂先用鹼處理成鈉型，將氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3時，氨基酸主要以陽離子形式存在，與樹脂上的鈉離子發生交換而被「掛」在樹脂上，再用洗脫劑洗脫。不同的氨基酸（帶的電荷不同）與樹脂的親和力不同，要將其分離洗脫下來，需要降低它們之間的親和力，方法是逐步提高洗脫劑的pH和鹽濃度，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，反之亦然。
不同反荷離子與樹脂親和力是不同的，其強弱關系為陽性競爭離子：Ag+〉CS+〉K+〉NH4+〉Na+〉H+〉Li+ 陰性競爭離子：I->NO3->(PO4)3->CN-〉HSO3-〉Mg2+〉HCO3-〉HCOO-〉CH3COO-〉OH-〉F- 如果某種離子溶液洗脫效果不好，可用另一種親和力強的離子代替之，等電點＞7選擇陽離子交換樹脂，等電點＜7選擇陰離子交換樹脂。
『叄』 使用分子篩純化蛋白後發現收率較低，是什麼原因
1.蛋白可能被蛋白酶降解。可以在樣品和緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，阻止蛋白酶降解作用
2.樣品制備過程中可能吸附在濾器上，更換吸附性更低的濾器材質
3.樣品沉澱，可能由於鹽或不合適的緩沖液條件引起
4.疏水蛋白，可以酌情採用去污劑、降低極性的試劑和去污劑
5.非特異性吸附，可以通過降低鹽離子濃度最小化疏水相互作用，增加pH，加入適量去污劑或有機溶劑
『肆』 蛋白分離純化所使用的填料有哪些
從方法上來講，主要是親和層析、離子交換、分子排阻（分子篩）、疏水層析和反相層析這5種；但具體到每個實驗，就會根據您的實驗目的（蛋白的純度、活性、量產以及用途的不同），以及蛋白本身的性質不同（真核或原核、水溶性、穩定性、有無修飾、理化性質等），來設計合理的純化方法，進而選擇不同類型、解析度和性價比的填料。
一般科研實驗室，有限考慮親和層析填料，若有更高的純度要求，再考慮不同解析度的離子交換或分子篩填料。
蛋白純化，GE的填料是最豐富，也是最穩定的，你可以參考最新的GE 凝膠選擇指南。
如，我在文庫鍾搜的2014版的：
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『伍』 deat-纖維素離子交換層析法可用於分離純化蛋白質,主要是由於a...
DEAT-纖維素離子交換層析法主要用於分離純化蛋白質，這主要得益於其獨特的分子篩分能力和離子交換機制。
一、DEAT-纖維素離子交換層析法的基本原理
DEAT-纖維素離子交換層析法是一種基於離子交換原理的分離純化技術。在層析過程中，蛋白質在流動相和固定相之間的分布取決於蛋白質的電荷特性和大小。纖維素作為固定相，其表面的離子交換基團能與蛋白質分子上的電荷進行作用，從而實現蛋白質的分離。
二、分子篩分能力在蛋白質分離中的應用
DEAT-纖維素層析介質具有特定的孔徑和表面性質，這些特性使得它可以根據蛋白質分子的大小和形狀進行篩分。不同大小的蛋白質分子在通過層析柱時，會受到不同程度的阻力，從而實現了不同蛋白質的分離。
三、離子交換機制的作用
離子交換層析中的離子交換過程是關鍵。纖維素介質上的離子交換基團能夠與蛋白質表面的電荷進行選擇性結合。這種結合力的大小取決於蛋白質所帶電荷的多少和性質，因此不同性質的蛋白質會以不同的速度在層析柱中被分離。
四、DEAT-纖維素離子交換層析法的優勢
該方法具有分離效果好、解析度高、操作簡便等優點。此外，由於纖維素介質的生物相容性，該方法在蛋白質分離純化中具有良好的應用前景。在生物醫葯、生物工程等領域中，DEAT-纖維素離子交換層析法已成為一種重要的蛋白質分離純化手段。
綜上所述，DEAT-纖維素離子交換層析法通過其分子篩分能力和離子交換機制，實現了對蛋白質的有效分離和純化。其在生物醫葯和生物工程領域的應用前景廣闊。