『壹』 巢式 PCR-RFLP 法
新型的基因分型技術(SNP分型)——巢式PCR-RFLP技術 隨著生命科學迅猛的發展，與之相適應的實驗技術手段越來越復雜和專業化，對於科研人員實驗技能要求也越來越高。由於生物學實驗高度的復雜性、使得一個科研人員往往只能精通某一方向的實驗。因此許多生物技術公司應孕而生，他們提供了許多專業的服務，其中最常規的技術服務包括核酸、蛋白測序、引物合成，SNP分型,動物培養及轉基因動物實驗。 在國外，生命科學的研究已經初步形成了一個大型技術平台共享的研究形式，科研人員的主要工作是進行實驗方案的設計、若干實驗和實驗數據的分析工作，而大量的基礎性的實驗工作則由相應的技術公司來完成，據不完全統計，2004年全美60%的SNP分型工作就是外包的生物技術公司完成。因為專業的技術公司在各自領域有著雄厚的技術背景和豐富的實驗經驗，試驗成功率更高,實驗數據也更可靠，這樣科研人員也能夠將主要精力放在真正的科研－實驗設計和數據分析中去。 出具有針對性的SNP分型技術，「巢式PCR-RFLP」基因分型技術，不同於傳統的只能對於有酶切位點的傳統的SNP分型的技術，本公司開發的「巢式PCR-RFLP是針對任意的基因分型技術，使任何位點最終都能進行常規限制性內切酶鑒定；同時該SNP分型技術利用巢式PCR技術，使得多個位點同時進行分析稱為可能。即使低濃度的DNA也能夠進行快速准確的分型工作。 與現有常規的分型技術相比，其最大的優勢包括：(一)所需DNA濃度低。1-2ng/uL也能完成檢測工作，而Taqman技術所需的DNA含量至少5ng/uL。(二)價格低。由於不需要合成熒光探針，使得該技術比Taqman技術價格低，該優勢在對多個位點同時進行分型時更明顯。 與Taqman技術和普通技術的詳細對比
分型技術 PCR-RFLP技術 Taqman技術 普通PCR-RFLP技術
最佳運用時機 200-600樣本，任何DNA多態位點 樣本量大於500人份 僅適合含有現成酶切位點的多態位點的分型
試劑投入 低 熒光探針，需3000-4000元。有可能實驗失敗需重新花錢設計熒光探針。 低
技術的適用性 可適合任何多態位點的分型 基本適合任何多態位點的分型，但有時若干位點不能成功進行試驗；當分型位點過於接近也不能用該方法。 僅適合含有現成酶切位點的多態位點的分型，有時出現的是一些稀有酶的酶切位點，導致效率低下或費用昂貴；
結果判斷 直觀，明確，穩定 間接，每管反應必須加熒光參照ROX，否則結果判斷不確定 一般直觀，明確；有時酶切位點出現在非主頻等位基因上，導致結果判讀困難
結果穩定性 穩定 一般 穩定
結果准確性 准確度高 一般 准確度高
樣本消耗量 1-2ng 5-10ng 50－100ng
實驗耗時 2-3周 由於要定製MGB熒光探針，和預實驗，也需要2-3周 2-3周
返回操作流程 1．基本信息收集具體內容包括客戶信息、樣本數(case,control)數、位點信息等。 2 位點信息的查詢 主要包括：2.1 位點上下游各300bp的確切序列，基因頻度;2.2 有無文獻報道證明該位點多態存在於中國人群;2.3 如無上述相關文獻,在J-SNP資料庫中查詢該位點多態是否存在於東亞人群中。為了保證結果的可靠，實驗方案設計原則上應以野生型進行酶切鑒定，因此確認snp的頻度是非常重要的。 3．樣品質控從全部樣品中取8%樣品，即96個樣品中取8個樣品，用我們的一對特異的PCR引物進行樣品質控，以檢測送來樣品是否良好。因為客戶樣品質量是實驗成功的關鍵因素之一，只有客戶提供的樣品質量可靠穩定，那麼結果自然就好。 4．引物設計同時設計AB兩套方案，分別以正鏈和負鏈為模板設計引物。 5．單管測試進行實驗方案可行性嘗試，首先要在多種溫度，多種Mg離子、多種添加劑加入的情況下進行方案的可行性測試，對於所有單管測試的結果都送去測序，以保證序列的正確性，在實驗結果得到確認的基礎上，挑選穩定的方案進入中試過程。 6．中試抽取8個樣品做小規模批量實驗，以模擬和檢查批量PCR情況和酶切情況。 7．大規模實驗准備將DNA模板按方案進行一次性分板(有冗餘)，並引入陽性和陰性對照，同時將所有相關的PCR體系進行一次性大規模分裝，防止污染。 8．第一板數據先用一板模板進行一輪PCR和酶切，以檢驗體系和分板的情況。 9．正式實驗 流程圖示 返回相關技術要點 1．實驗設計必需保證野生型的被限制性內切酶切開因為對於只有少量突變型的SNP位點，如果突變型被切開，那麼所得到的實驗結果就是大量沒有被酶切開的PCR產物，而這個結果與酶切實驗失敗的結果非常類似，不易區分，對結果的判讀造成很大的麻煩，因此保證了主頻鹼基被解開，從根本上保證了實驗的可靠性。 2．偏向性擴增的解決。所謂偏向性擴增是因為SNP位點上會往往存在嘌吟和嘧啶的替換，在PCR過程中，聚合反應對嘧啶(C或T)比較敏感，使得嘌吟(A或T)的擴增非常少，而出現偏向性擴增，這在SNP位點附近嘌吟含量較高時特別明顯。為此，本公司專門設計一個方案，用以克服偏向性擴增。 3．方案設計中的內切酶的選擇雖然從理論上，我們的方案可以進行任意位點改造，但事實上在改造過程中會出現一系列的問題，包括擴增效率，鹼基劃移等一系列問題，使得改造方案失敗。對此，我們公司專業開發了一個引物設計軟體，通過運算獲得最佳的改造方案，同時通過在正向和反向序列上同時設計方案，以保證試驗的成功。 4．PCR產物的污染問題在大規模的PCR過程中，最嚴重的問題是PCR產物污染，據我們經驗總結，80％以上的污染是由於接觸式污染，剩餘的污染則包括氣溶膠污染等環境造成的污染。對於PCR污染這個問題，本公司制訂了嚴格的實驗措施，具體包括使用濾芯搶頭、所有PCR體系全部分裝、PCR體系與各類模板嚴格分離、配置體系人員與接觸PCR產物人員嚴格分離等一系列措施，同時在處理PCR管，eppendorf管時也規定了詳細的操作過程。 5．關於質量控制問題在每板PCR過程中，我們會放入兩個陰性對照和一個重復對照，以確認PCR的過程中不會產生污染和PCR的結果確實可信。 技術基本原理和實例本公司採用的巢式PCR－RFLP分型技術，其基本原來是利用PCR引物的3』端，對SNP位點附近的鹼基進行人為改造，產生一個常規的限制性內切酶識別序列，如SNP rs1321425（rs1321425－來自NCBI的refSNP資料庫）的C/G，其任何一個鹼基和上下游鹼基無法形成一個可直接被限制性內切酶識別的序列，於是我們對SNP位點前的上游鹼基進行改造，通過對序列的分析和PCR效果的計算，我們將原本四個鹼基AGAT改成CTGC，結合後一個鹼基A以及SNP位點G，形成CTGCAG（PstI）酶切識別位點，經測序和序列對比，改造成功。又比如rs9309462和rs4646642，成功的將2個鹼基，3個鹼基進行成功的改造。 C/G ACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCAC TTCTGTAAACTACATGCACTAAT 圖a C/T CTCGGTGGAAACGG 圖brs4646642 /圖c 本改造方案的成功之處在與3』端鹼基的改造，一般而言，如果PCR引物的近3』端的幾個鹼基不能與模板互補，其實驗是不能成功的，事實也大致如此。但本公司所採用的方案確能成功的將3』端引物進行改造，即使是3』端最後一個鹼基與模板不匹配，我們也能成功的進行改造。如SNP（rs10491482），在改造過程中，與SNP直接相鄰的GAA被改成了TGC，形成了GTGCAC(ApaLI)，就有3』端最後一個鹼基被成功改造，形成限制性內切酶識別序列。 A/G CTCTGCTGATAAAGCTGTTT 圖d 這里所展示的實例，往往改造2、3、4個鹼基，事實上，本方案理論上可進行5個鹼基的改造，從而人為構建一個識別位點，但從鹼基的組合而言，需要改動如此多的鹼基很少，而且PCR效率也不是很高，因此若非有特殊需要，一般不產生5個鹼基的改動。